쥐 모델에 최적화 된 구조를 가진 Electrospun 혈관 이식 술의 이식

요약

여기, 우리는 PCL 두꺼운 섬유와 큰 모 공, 혈관 이식 조작 및 복 부 대동맥 교체의 쥐 모델에서 vivo에서 성능을 평가 하기 위해 프로토콜을 설명 하는 수정 된 전기 방법을 제시.

초록

여기, 우리는 macroporous PCL 혈관 이식 조작 및 복 부 대동맥 교체의 쥐 모델을 사용 하 여 평가 프로토콜을 설명 하는 프로토콜을 제시. Electrospun 혈관 이식 자주는 이식으로 세포 침투를 제한 하 고 재생성 하 고 개장 하는 신 동맥의 방해는 상대적으로 작은 구멍을가지고 있다. 이 연구에서는 두꺼운 섬유 (5-6 µ m)와 더 큰 모 (~ 30 µ m) PCL 혈관 이식 수정된 처리 기술을 사용 하 여 조작 했다. 이식의 장기 성능 쥐 복 부 대동맥 모델에 주입에 의해 평가 되었다. 초음파 분석은 이식 남아 동맥 또는 이식의 12 개월 후에 발생 하는 협 착 증 없이 특허를 보여주었다. Macroporous 구조는 셀 ingrowth를 개선 하 고 따라서 3 개월에서 재생성 조직 승진. 더 중요 한 것은, 12 개월 후 이식 벽 내 석 회화 등 불리 한 개장의 아무 표시도 없었다. 따라서, 처리 하는 수정 된 macroporous와 electrospun PCL 혈관 이식 장기 이식에 대 한 동맥 대체 될 잠재적인 개최.

서론

합성 중합체에서 만든 혈관 이식 심장 혈관 질병 (CVDs)의 치료를 위한 병원에 널리 활용 됩니다. 불행히도, 작은 직경의 혈관 이식의 경우 (D < 6 m m) 사용할 수 없습니다 종종 이르게 혈전 증, 내 증식, 그리고 다른 감소 된 혈액 흐름 속도 의해 발생 하는 낮은 patency 성공적인 제품 있다 합병증¹.

조직 공학 장기 patency 및 항상성 비 계 기반 혈관 재생 및 재건에 따라 실현 하는 대체 전략을 제공 합니다. 자세히, 혈관 이식, 3 차원 서식 파일로 제공할 수 있는 기계적인 지원 및 혈관 조직 및 기능의 영향 세포, 세포 접착, 이동, 확산를 포함 하 여 재생 하는 동안 구조 지도 기질²분 지금까지, 다양 한 합성 폴리머 혈관 조직 공학에서 응용 프로그램에 대 한 평가. 이러한 고분자 중 poly(ε-caprolactone) (PCL)가 집중적으로 조사 좋은 셀 호환성 및 느린 저하 몇 개월에서 2 년³에 이르기까지. 쥐 대동맥 모델^4,,56, PCL 혈관 이식 전기 처리 우수한 구조적 무결성 및 patency, 뿐만 아니라 지속적으로 증가 세포 침입과에서 neovascularization 전시는 최대 6 개월까지 이식 벽입니다. 그러나, 불리 한 조직 세포와 모세 혈관의 석 회화, 회귀를 포함 하 여 리 모델링 또한 관찰 되었다 더 긴 timepoints에서 최대 18 개월.

Cellularization 혈관 이식의 조직 재생을 결정 하 고⁷을 remolding 핵심 요소입니다. 전기, 다양 한 기법으로는 널리 고용 나노 섬유 구조⁸혈관 이식의 준비에 대 한. 불행히도, 상대적으로 작은 기 공 구조는 종종 후속 조직 재생을 제한 하는 electrospun 혈관 이식에 부족 한 세포 침투를 끈다. 이 문제를 해결 하려면 다양 한 기술은 시도 기 공 크기와 전반적인 다공성,^9,10, 수집 장치, 레이저 방사선^{11에 의해 치료 후의 수정 leaching 소금/폴리머를 포함 하 여 증가} , 등등. 사실, electrospun 이식 (를 포함 하 여 섬유 직경, 기 공 크기 및 다공성)의 구조는 밀접 하 게 관련이 처리 조건^12,13. 중 전기, 섬유 직경 폴리머 솔루션, 흐름 속도, 전압 등의 농도 같은 매개 변수를 변경 하 여 쉽게 제어할 수 있습니다. ^{14 , 15}, 그러므로, 숨 구멍 크기와 다공성 향상 되었습니다 따라와.

우리는 최근 macroporous 구조 (5-7 µ m의 직경 및 30-40 µ m의 모 섬유) 수정된 PCL electrospun 이식을 했다. Vivo에서 쥐 복 부 대동맥을 대체 하 여 이식 3 개월 후 수술¹⁶patency, 좋은 endothelialization, 부드러운 근육 중생의 높은 비율을 보였다. 더 중요 한 것은, 아니 불리 한 조직의 석 회화 및 셀 회귀를 포함 하 여 개장 이식의 1 년 후에 관찰 될 수 있었다.

프로토콜

실험 동물의 사용은 동물 실험 윤리 위원회의 난카이 대학에 의해 승인 하 고 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에 따라 실시.

1입니다. Electrospun PCL 이식의 제조

참고: 여기, 전기 기술 혈관 이식 조작에 이용 되었다.

1. 각각, 메탄올과 클로 프롬의 혼합물에서 PCL을 용 해 하 여 25 wt %와 10 wt %의 PCL 솔루션을 준비 (1:5 볼륨 비율), 실 온 (RT) 12 시간에서.
2. 10 mL 유리 주사기를 PCL 솔루션을 로드 합니다.
3. 21-G 바늘 주사기를 놓습니다.
4. 컬렉션 악기에 스테인리스 스틸 맨 드릴 (2 mm 직경, 길이 25 c m)를 놓습니다.
5. 두꺼운 섬유 이식에 대 한 사용 하 여 25 wt %의 PCL 솔루션, 수집기 바늘 끝에서 17 cm의 거리, 8 mL/h의 유량 및 11의 전압 전기 매개 변수로 kV. 얇은 섬유 이식 10 wt %, 수집기에 바늘 끝에서 20 cm의 거리, 2 mL/h의 유량 및 18의 전압의 PCL 솔루션 사용 전기 매개 변수로 kV.
6. 얻은 이식 하룻밤 잔여 용 매를 제거 하는 진공 상태에서 배치 됩니다 확인 하십시오. 소독 절차 전에 모든 악기 고 무 균 기술을 통해 유지 합니다.
7. 주입 전에 이식 30 분 75% 에탄올 10 ml에서 그들을 immersing 및 다음 하룻밤 UV 빛에 노출에 의해 소독.
8. 섬유 및 기 공 크기 측정: 스캐닝 전자 현미경 (SEM) 이미지에 따라 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 평균 섬유 직경을 계산.
9. 기계 장비의 테스트:
   1. 면도날을 사용 하 여 길이 3 m m 섹션으로 관 건설 기계를 절단. 건설 기계는 마이크로미터를 사용 하 여 두께 측정 합니다.
   2. 100 북 아의 부하 용량 인장 테스트 기계에 관 건설 기계를 배치
   3. 파열까지 1mm 간 클램프 거리와 풀 10 m m/min의 속도로 경도 건설 기계 클램프. 인장 강도 및 파단 궁극적인 측정 합니다. 초기 선형 영역에서 탄성 계수를 계산 (최대 5% 변형) 응력-변형 곡선의.

2. 쥐 복 부 대동맥 이식 모델

참고: 모든 재료와 수술에 사용 되는 계기는 살 균. 수술 동안 거 즈 마스크와 감염을 피하기 위해 멸 균 장갑을 착용 하는 연산자 확인 하십시오. 실내 온도 동물 체온을 유지 하기 위해 27-30 ° C에서 유지 됩니다 확인 하십시오. 진통에 관한 현지 IACUC 지침을 따르십시오.

1. 남성 Sprague Dawley 쥐 혈관 이식의 수신자로 240-270 g의 무게를 사용 합니다. 쥐 수술 하기 전에 24 시간 금식은 확인 합니다. 24 시간 단식 쥐의 목표는 빈 창 자에서 대변 충분히, 그로 인하여 확장 연산자의 수평선.
2. 쥐의 백 목 잡고 아래쪽으로 머리를 유지, 낮은 복 부의 복 부 구멍으로 springe 바늘을 삽입. 복 주사에 의해 chloral 하이드 레이트 (330 mg/kg)과 마 취에 대 한 쥐를 유도.
3. 쥐는 근육과 꾸준히 호흡을 완화 했다 함으로써 적절 한 anesthetization를 확인 합니다. 운영 현미경 쥐 부정사 위치에 놓습니다.
4. 바 셀 린 안과 수 의사 연 고 마 취에서 건조를 방지 하기 위해 눈에 적용 됩니다. 수술 전에 꼬리 정 맥 주입에 의해 heparinized 생리 염 분 해결책 (50 UI/mL)와 anticoagulation (UI/100kg)을 관리 합니다.
5. 면도칼 블레이드를 사용 하 여 전방 복 벽에 털을 면도 하십시오 그리고 요오드 솔루션 및 의료 알코올 솔루션을 사용 하 여 피부를 청소.
6. 수술가 위로 중간 개복 술 절 개를 수행 하 고 절 개 길이, 약 4-5 m 인지 확인 다음 복 부 구멍을 노출.
7. 철회 하 고 우선적으로 생리 식 염 수를 적신 거 즈로 내장을 포장.
8. 신중 하 게 복 부 대동맥 해 부.
9. 식별 하 고 9-0 monofilament 나일론 봉합을 사용 하 여 모든 작은 가지를 선.
10. 격리 된 섹션을 클램프 (길이 최대 1 c m) 2 개의 혈관 클램프를 사용 하 여 대동맥의. 대동맥 20-30 분 채워 남아 있을 수 있습니다.
11. Anastomotic 사이트를 만들 마이크로-가 위를 사용 하 여 두 개의 클램프 사이의 복 부 대동맥 transect
12. 잔여 혈액을 제거 하 heparinized 염 (UI/50ml) 솔루션을 사용 하 여 대동맥의 두 끝을 플러시.
13. 마이크로-가 위를 사용 하 여 adventitia 벗기다.
14. 9-0 monofilament 나일론 봉합을 사용 하 여 숫자의 8 봉합 패턴 2 m m 내경 및 쥐의 복 부 대동맥에 길이 1 cm 이식 anastomose.
15. 첫째, 9, 3, 12, 및 근 위 측에 6 시 위치 순서 대로 4 개의 anastomoses을 구성 다음 두 봉합 사이 4 바늘 컷된 가장자리 anastomose. 근 위 봉합을 마치고 같은 방법으로 원심 측을 봉합.
    참고: 모든 스티치는 네이티브 쪽은 약간은 이식에 포함 된 보장 합니다.
16. 이식, 흘러 혈액을 있도록 원심 클램프 다음 인접 클램프를 제거.
17. 멸 균 면봉 또는 스폰지 작은 거 즈를 사용 하 여 출혈을 막으려고 봉합 끝을 누릅니다. 약 3 분, hemostasis 때까지 누릅니다.
18. 복 부 구멍으로 내장을 반환 합니다.
19. 플러시 gentamicin (320 U/mL)와 따뜻한 생리 식 염 수 솔루션을 사용 하 여 복 부 구멍.
20. 각각 근육과 피부 층에 3-0 나일론 봉합 사를 사용 하 여 복 벽을 바느질.
21. 깨끗 하 고 건조 감 금 소에 쥐를 놓고 동물 체온; 유지 케이지 난방 패드를 넣어 마 취에서 회복 하기 위해 쥐를 기다립니다. Sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지 동물에 참석.
22. 후 의식 회복, 음식과 물을 함께 단일 케이지에 쥐를 넣어. 수술 후 감염을 방지 하기 위해 상처에 요오드를 적용 합니다. 그것은 완벽 하 게 복구 될 때까지 다른 동물의 회사에는 쥐를 반환 합니다.
23. 미리 정해진된 시간 지점에서 기관 지침에 따라 쥐 안락사

결과

PCL 이식 했다 explanted 3 개월 및 12 개월에서 post-operatively 및 hematoxylin에 오신 (H & E), 표준 조직학 기술에 의해 trichrome Masson, 분석 Verhoeff 반 Gieson (VVG), 폰 Kossa, 면역 형광 α-SMA를 위한 얼룩 MYH, vWF, 그리고 엘라 스 틴입니다. 조직학 이미지 똑바로 현미경을 사용 하 여 찍은 그리고 면역 형광 이미지 fluorescence 현미경을 사용 하 여 찍은.

모든 데이터는 ± sd. 의미를 표현 했다 학생의 t쌍 두 꼬리-시험 차이 비교 하는 데 사용 되었다. P 의 값 < 0.05 통계적으로 간주 되었다.

...

토론

셀 침투는 중생에 대 한 중요 하 고¹⁶ vivo에서혈관 이식의 개장 이다. 제한 된 셀 침투는 종종 이식 벽으로 세포의 이동 방해는 이식의 상대적으로 작은 구멍 관련이 있습니다. 이 문제를 해결 하려면 우리는 큰 기 공 구조 electrospun PCL 혈관 이식 준비 하 수정된 방법을 개발. 세부 사항에, 기 공 크기는 쉽게 처리 매개 변수에 의해 제어 될 수 있는 섬유 두께의 증가 함께 증가. 결과는 호스트 세포 vivo에서 이식 후이 macroporous 이식의 벽에 쉽게 침투 수와 cellularity 수술 12 개월 후에 명백한 셀 회귀 하지 않고 상대적으로 높은 수준에서 유지 했다.

네이티브 동맥 주로 이루어져 있다 3 개의 층, 즉, 내 피, tunica 매체, 및 adventitia. 피 안티 thrombogenic 인터페이스, 혈관의 장기 patency 유지 하는 중요 한 역할을 재생 합...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
폴리(&엡실론;-카프로락톤) (PCL) 펠릿(Mn=80,000)	시그마	704067
메탄올	톈진 화학 시약 회사	1060
알코올	톈진 화학 시약 회사	1083
클로로포름	톈진 화학 시약 회사	A1007
설탕	톈진 펑촨 회사	2296
Triton X-100	Alfa Aesar	A16046
Sprague Dawley 쥐	실험실 동물 센터 군사 의학
식염수	Hebei Tiancheng 제약 회사
Chloral hydrate	Tianjin Ruijinte 화학 회사	2223
Heparin sodium injection	Tianjin Biochem 제약 회사
Gentamycin Sulfate Injection	Jiangsu Lianshui Pharmaceutical company
Mouse anti-α-SMA primary antibody	Abcam	ab7817
Mouse anti-smooth MYH primary antibody	Abcam	ab683
Rabbit polyclonal anti-rat elastin 항체	Abcam	ab23748
토끼 항 폰 Willebrand 인자 1 차 항체	Abcam	ab6994
염소 항 마우스 IgG (Alexa Fluor 488)	Invitrogen	ab150117
염소 항 토끼 IgG (Alexa Fluor 488)	Invitrogen	ab150077
5 % 정상 염소 혈청	Zhongshan Golden bridge	ZLI9022
Hematoxylin 및 eosin (H & E)	베이징 leagene 생명 공학	DH0006
Masson의 trichrome	베이징 leagene 생명 공학	DC0032
Verhoeff-van Gieson (VVG)	베이징 leagene 생명 공학	DC0059
폰 Kossa	베이징 leagene 생명 공학	DS0003
실, 3-0 실크	상하이 Jinhuan 의료 용품 회사	G3002b
실, 9-0 실크	상하이 Jinhuan 의료 용품 회사	H901