지질 풍부 및 평가의 지질 분포 나 일 빨강, 기름 빨간 O 얼룩으로 꼬마 선 충 의 정량화

요약

나 일 빨강 고정된 꼬마 선 충 의 얼룩 조직 중 지질 분포의 질적 평가 용이 하 게 기름 빨간 O 얼룩 동안 중립 지질 예금, 양적 측정 하기 위한 방법입니다.

초록

꼬마 선 충 은 지질 대사 및 에너지 항상성 공부 하는 뛰어난 모델 유기 체입니다. 그것의 지질 유전자의 많은 인간에서 보존 하 고 대사 증후군 또는 다른 질병와 관련. 이 유기 체에서 지질 축적의 시험 통 염료 또는 레이블 자유로운 방법에 의해 밖으로 수행할 수 있습니다. 통 얼룩 나 일 빨강 좋아하고 기름 빨간 O 양적 지질 수준을 측정 하 고 질적 관찰 지질 분포, 조직에 걸쳐 각각 저렴 하 고 신뢰할 수 있는 방법이 있습니다. 또한, 이러한 얼룩 다양 한 지질 물질 대사 유전자 및 통로의 높은 처리량 검열을 허용 한다. 또한, 그들의 소수 성 자연 지질 용 해도 용이 하 게, 주변 조직와 상호 작용을 감소 및 용 매로 분리를 방지. 이 메서드는 일반적인 지질 콘텐츠 검사에 효과적, 비록 그들은 화학 성분 및 지질 예금의 다양성에 대 한 자세한 정보를 제공 하지 않습니다. 이러한 목적으로, GC-MS와 자동차 현미경 같은 레이블 없는 메서드는 더 나은 적합, 불구 하 고 그들의 비용.

서론

지질은 생활 필수품입니다. 그들은 세포 막의 필수 구성 요소, 보조 메신저 역할 및 신호 변환기, 그리고 에너지 저장에 중요 한 기능을가지고. 지질 대사 dysregulated 때, 그것은 공중 보건 우려⁹누르고 비만 타입 II 당뇨병 같은 질병에 이른다. 꼬마 선 충 (C. 선 충)은 상대적으로 짧은 수명 주기, 투명 한 몸, 알려진된 세포 계보와 완전히 시퀀스 된 게놈을가지고 있기 때문에 지질 대사를 공부 하는 우수한 모델 유기 체. 주로 남녀 추 니, C. 선 충 연구자를 인상 isogenic 동물의 많은 짧은 수행할 높은 처리량 앞으로 유전 스크린 다양 한 대사 유전자 및 통로⁴공부 기간에 있습니다. 이 이렇게 인간, 쥐, 쥐 및 초파리 중 273 선 충 C. 지질 물질 대사 유전자에서 보존의 높은 학위를 공개 했다. 또한, C. 선 충 에서 300 지질 유전자 변화 증후군¹¹에 비관련 질병에 연결 된 인간의 orthologues가 있다. 전통적으로, C. 선 충 에 지질 저장의 검사는 주로 지질 축적에 대 한 강력한 정보를 제공 하는 염료 분류 분석 실험에 의존 했다. 덜 일반적인 조직에 걸쳐 지질 지역화 및 지질 풍부에서 측정 된 차이의 설명 이다. 그러나, 최근 작품은 지질 분포 지질 축적⁶만큼 중요 있을 수 있습니다 밝혔다.

최근에, 고성능 액체 크로마토그래피-질량 분석 (HPLC-석사), 가스 크로마토그래피-질량 분석 (GC-MS), 같은 통합 연구 시작 하 고 일관 된 안티-스톡 스 라만 산란 (자동차) 현미경 주소로 얼룩-기반 접근 직접 지질 추출, 특정 지질 분수, 및 지질 예금, 각각^10,11의 내용을 분석 하 여 단점 또한, 자동차 현미경 나 일 빨강 수 있습니다만 중요 한 얼룩 리드 오프 대상 자동 형광 세포¹⁰의 얼룩에 사용을 위해 통 염료로 사용 하는 경우 지방 축적에 대 한 프록시 역할을 계시 했다. 그러나, 필요한 기술적 전문성과 비용 이러한 크로마토그래피와 관련 된 그리고 현미경 검사 법 방법 활용 그들의 많은 연구 질문에 대 한 점. 이 문서에서 우리는 흥분 시키는 중립 지질 예금 C. 선 충 나 일 빨강을 사용 하 여 얼룩 하 고 기름 빨간 O 지질 풍부 전체 동물에서 및 특정 조직에 구별을 편리 하 고 안정적인 방법 토론.

나 일 빨강, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, benzophenoxazone 염료를 쉽게 다양 한 유기 용 매에 녹이 고 주로 물에 용 해 되지 않습니다 이다. 그것은 우수한 lysochrome 염료 사용 트리 글리세라이드 등 중립 지질 얼룩 또는 콜레스테롤 에스테 르는 강한 색상을 보유 하 고 있습니다. 때문에 지질에 잘 solubilizes, 무시할 상호 주위 조직, 않으며 덜에 보다 용 매에 용 해 지질입니다. 그것은 450-500 및 520 nm, 각각¹의 여기 및 방출 맥시 마. 개별 지질 시체를 소장 및 다른 조직에 걸쳐 관찰 중 하나에 클러스터 또는 동물의 유전자 형 또는 실험적인 치료에 따라 균등 하 게 분산 수 있습니다 녹색 형광에 대 한 일 레드 스테인드 C. 선 충 을 볼 때 ⁷.

기름 빨간 O lysochrome, 트리 글리세라이드 및 단백질 얼룩을 사용 하는 지 용 성 염료 이다. 그것은 그것의 화학 구조 포함 3 개의 향기로운 반지에 연결 된 두 개의 아조 그룹 때문에 아조 염료 이라고 합니다. 그것은 어느 지질에서 높게 녹는 렌더링 이온화, 어렵다입니다. 얼룩 색은 빨간색 이며 그것의 빛을 흡수 최대 518 nm ³. C. 선 충 기름 빨간 O 쇼 다른 조직⁶중 지질 분포의 질적 평가 용이 하 게 동물의 투명 한 바디에 눈에 띄는 빨간 지질 방울 스테인드.

프로토콜

1. 나 일 빨강 (NR) 지질의 얼룩

1. 5 mg/mL NR 재고 솔루션의 준비
   1. 500 mL 병에서 NR 분말의 100 mg 100% 아세톤의 200 mL를 추가 합니다.
   2. 빛을 모든 노출을 피하기 위해 알루미늄 호 일 병을 커버.
   3. 사용 하기 전에 어둠 속에서 2 시간에 대 한 솔루션을 저 어.
   4. 장기 사용에 대 한 어떤 빛 노출 없이 단단히 밀봉된 병에 NR 재고 솔루션을 저장 합니다. 연구의 필요에 따라 NR 재고 솔루션을 확장 합니다. 동일한 재고 솔루션은 일관 된 얼룩 및 이미징 결과 NR 얼룩 실험에서 사용 확인 합니다.
2. NR 작업 솔루션의 준비
   1. 40% 소 프로 파 놀 (v/v)의 모든 1 ml NR 재고 솔루션의 6 µ L를 추가 합니다.
   2. 각 샘플에 대 한 NR 작업 솔루션의 600 µ L를 준비 합니다.
      참고: 신선한 NR 솔루션 오른쪽 얼룩이 지기 전에 작업을 확인 합니다. NR 재고 솔루션 요구에 따라 15 mL 또는 졸업 50 mL 원뿔 튜브를 사용 합니다.
3. NR 지질 얼룩에 대 한 벌레의 준비
   1. 선 충 류 성장 매체 (NGM) 시드 후반 로그 OP50 대장균과 20 ° C에서 초기 L4 단계에 벌레를 성장.
   2. 인산 염 버퍼 식 염 수 + 0.01% 트라이 톤 X-100 (PBST) 솔루션 x 1의 1 mL와 함께 접시에서 벌레를 세척 하 고 웜 현 탁 액 1.5 mL microfuge 관에 넣어.
   3. 560 x g 1 분에 벌레 제거 반복 대장균 까지이 단계를 삭제 하 고 상쾌한 현 탁 액에서 원심 분리기.
   4. 웜 펠 릿을 40% 소 프로 파 놀의 100 µ L을 추가 하 고 3 분 동안 실내 온도에 그것을 품 어.
   5. 560 x g 1 분 동안에 벌레를 원심 고 웜 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한을 제거 합니다.
      참고: 경우 판에서 벌레를 세척 하는 PBST의 높은 볼륨 사용 큰 접시를 사용 하 여 또는 접시 당 더 많은 벌레를 얼룩. PBST에서 보다 더 15 분 샘플 고정 전에 벌레를 씻지 않는. 수행 추가 세척은 상쾌한 박테리아의 지워지지 않습니다. Nutator 또는 로커를 사용 하 여 40% 소 프로 파 놀에 보육을 실시 합니다. 항상 전체 샘플 동요 발생 되도록 튜브 모니터링 합니다.
4. Nr 얼룩 지질
   1. 어둠 속에서, 각 샘플에 NR 작업 솔루션의 600 µ L를 추가 합니다. 반전 튜브 세 번 하 고 NR 솔루션에서 벌레를 완벽 하 게 혼합.
   2. 2 시간에 대 한 실 온에서 어둠 속에서 샘플을 회전 합니다.
   3. 외피, 다음 1 분 동안 560 x g 에서 벌레를 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다.
   4. PBST의 600 µ L을 추가 하 고 30 분 초과 NR 얼룩 제거에 대 한 어둠 속에서 샘플을 품 어.
   5. 560 x g 1 분에 샘플 원심 고 상쾌한의 약 50 µ L를 제외한 모든 제거 하십시오.
      참고: NR 인큐베이션 동요를 필요 하지 않습니다. 벌레의 정착은이 단계 동안 일반적 이다.
5. 현미경 이미징에 대 한 슬라이드의 준비
   1. 나머지 상쾌한에 웜 펠 릿을 resuspend.
   2. 현미경 슬라이드에 벌레 서 스 펜 션의 5 µ L을 놓고 신중 하 게 트래핑 어떤 공기 방울을 피하기 위해 하는 coverslip 넣어 합니다.
   3. 벌레를 이미징 하기 전에 매니큐어와 coverslip 인감.
   4. 한 번에 단지 몇 가지 슬라이드를 준비 합니다. 이렇게 하면 NR 이미징 일정 하 게 유지 샘플에서. NR 스테인드 이미지의 품질에는 6 헤 이산 지질 방울 관찰 하기 곤란 하다 며 배경 형광, NR 신호 검출을 방해는 감소 한다.
6. NR 얼룩진 벌레의 이미징
   1. 보기의 필드 당 여러 동물을 잡으려고 5 배 확대에 벌레 이미지.
   2. 개별 벌레의 더 나은 정량화에 대 한 10 배 확대로 전환.
   3. FITC/GFP 채널을 사용 하 여 이미지 NR 스테인드 웜 및 정량화에 대 한 최적의 조건을 결정 하기 위해 다른 노출 시간을 시도.
   4. 압축으로 인해 데이터 손실을 방지 하려면 TIF 형식으로 파일을 저장 합니다.
      참고: 일반적인 노출 시간 100-1000 양 최적의 노출 시간에 이르기까지, 모든 샘플에 대 한 그것을 사용 하 여 이미징 일관성을 유지 하.
7. NR 얼룩 이미지 정량화
   1. ImageJ를 현미경을 업로드. 플러그인 풀 다운 메뉴에서 이미지 파일 인식 되지 않으면 바이오 형식 함수를 사용 합니다.
   2. 스택 함수에서 이미지 풀 다운 메뉴에서 이미지 스택 사용 하 여 여러 현미경을 비교 하면 이미지 스택을 만듭니다.
   3. 같은 풀 다운 메뉴에서 이미지 스택의 밝기/대비를 조정 하 고 적용을 클릭 하 여 모든 이미지에 변경 내용을 전파 합니다.
   4. 각 이미지 웜 윤곽을 그리 다 하는 NR에서 방출 되는 형광 강도 계량 분석 풀 다운 메뉴에서 측정 함수를 사용 하 여 다각형 선택 도구를 사용 합니다.
   5. 각 이미지에 대 한 5 개의 배경 위치를 측정 하 고 평균 배경 형광 강도 계산 합니다.
   6. 수식 N을 사용 하 여 각 이미지 웜으로부터 배경 형광 강도 빼기 = G-(A x B), N 순 형광, 총 형광에 대 한 G, 총 웜 지역 A와 B 평균 배경 형광에 대 한 의미.
   7. 웜 크기에 의해 형광 강도 정상화 하려면 각 벌레의 전체 면적에 의해 net 형광을 나눕니다. 결과 형광 강도, 픽셀 당 임의의 단위 (거리)으로 보고 됩니다.
      참고: JPEG 형식으로 이미지를 수출 하지 마십시오. 압축 파일 저장을 더 관리 하면,이 형식에 의해 데이터 무결성 손상 됩니다. 모든 이미지 수정 및 동일 하 게 분석 다는 것을 확인 하십시오. 제대로 다른 배율에서 크기를 평가 하는 눈금 막대를 포함 하도록 하십시오. ImageJ를 사용 하 여 형광 강도 차이 더 나은 시각화 하려면 8 비트 RGB에서 이미지 형식을 전환 하 고 이미지 룩 업 테이블 (LUT) 메뉴에서 화재를 선택 합니다. 이 증가 색상 밝기 증가 형광 강도 상관 열 맵 이미지를 만듭니다.

2. 석유 지질 빨간 O 얼룩 (오로)

1. 오로 재고 솔루션의 준비
   1. 250 mL 병에서 100% 소 프로 파 놀의 100 mL를 오로 가루 500 밀리 그램을 추가 하 고 잘 혼합.
   2. 일단 준비, 단단히 빛 노출 없이 밀봉 하는 솔루션을 저장 합니다.
2. 오로 작업 솔루션의 준비
   1. 60% 소 프로 파 놀에 물 (3:2) 오로 재고 솔루션을 희석.
   2. 사용 하기 전에 작업 오로 솔루션 0.2 µ m 셀 루 로스 아세테이트 멸 균 주사기 필터를 통해 필터링.
      참고: 최상의 솔루션 품질을 위해 준비 작업 오로 솔루션 하루 전에, 그리고 섞어 하룻밤 보자. 그러나 솔루션은 필요한 같은 날, 희석과 혼합 사용 하기 전에 적어도 2 시간에 대 한 로커에 오로 솔루션. 락, 전에 오로 솔루션의 누설을 피하기 위해 파라핀 테이프에 원뿔 튜브 포장.
3. 벌레의 오로 지질 얼룩을 위한 준비
   1. 선 충 류 성장 매체 (NGM) 원하는 생활 단계에 늦게 로그 OP50 대장균 으로 시드에 20 ° C에서 벌레를 성장.
   2. 접시에 PBST 솔루션의 1 mL을 추가 하 고 모든 벌레는 접시에서 때까지 소용돌이. 접시를 기울기와 PBST의 1 mL와 함께 그것을 씻어. 1.5 mL microfuge 관 벌레 중지 전송.
   3. 원심 분리기 560 x g 1 분에 벌레 제거는 상쾌한 펠 릿 및 세척 단계 PBST의 1 mL와 함께 세 번 반복을 방해 하지 않고. 모든 표면에 뜨는 하지만 100 µ L을 제거 합니다.
   4. 웜 펠 릿을 40% 소 프로 파 놀의 600 µ L을 추가 하 고 3 분 동안 실내 온도에 바위.
   5. G 30 s 및 모든 표면에 뜨는 제거 하지만 100 µ L x 560에서 웜 웜 펠 렛을 방해 하지 않고 원심.
      참고: PBST의 높은 볼륨을 사용 하 여 높은 처리량 얼룩 하 고 접시에서 벌레를 씻어. 웜 PBST에 보다 더 많은 샘플 고정 이전 15 분 세척 하지 마십시오. 추가 세척 할 상쾌한 박테리아의 지워지지 않습니다. 40% 소 프로 파 놀 nutator 또는 로커를 사용 하 여 부 화를 실시 합니다. 항상 전체 샘플 동요 발생 되도록 튜브 모니터링 합니다.
4. 오로와 얼룩 지질
   1. 각 샘플에 600 µ L 오로 작업 솔루션을 추가 합니다. 반전 튜브 세 번 하 고 오로에서 벌레를 섞으십시오.
   2. 실 온에서 2 h 30 rpm에서 샘플을 회전 합니다.
   3. 1 분 동안 560 x g 에서 샘플 원심 고 모든 표면에 뜨는 하지만 100 µ L을 제거 합니다.
   4. PBST의 600 µ L에서 샘플을 resuspend 하 고 30 분 초과 오로 얼룩 제거 30 rpm에서 튜브를 회전.
   5. 샘플 1 분 560 x g 에서 원심 하 고 상쾌한의 50 µ L를 제외한 모든 제거.
   6. 더 나은 동물의 생식과 창 자 세포의 위치를 구별할,의 1 µ L을 추가 하 여 핵을 얼룩 (2-(4-amidinophenyl)-1 시간-indole-6-carboxamidine) (DAPI) 오로 작업 솔루션의 모든 1 ml. 이미징에 대 한 슬라이드를 장착 하기 전에 DAPI를 추가 2 h에 대 한 얼룩 오로 실시 합니다. 장 핵 크기에 더 큰 고 생식 개발 생식 세포에 의해 구별 된다.
      참고: 후 오로 얼룩, 웜 수 있습니다 microfuge 관의 양쪽에 준수 고 눈에 띄는 펠 릿을 형성 하기 위하여 실패. 이 경우, 다시 벌레를 원심 하거나 적어도 10 분 동안 중력에 의해 침전 하는 벌레를 허용 합니다.
5. 웜 이미징에 대 한 슬라이드의 준비
   1. 나머지 상쾌한에 벌레를 resuspend 하 고 솔루션을 잘 섞는다.
   2. 현미경 슬라이드에 벌레 서 스 펜 션의 5 µ L를 넣고 공기 폼 거품 확보는 coverslip 신중 하 게, 장소.
   3. 매니큐어와 이미지 웜 coverslip 인감.
      참고: 고정 하 고 얼룩, 후 웜 매우 견고 하 고 플라스틱 하기 어려운 수 있습니다. 회피, 그들의 끝을 절단 하 여 넓은 구멍 펫을 확인 합니다.
   4. 안 착 직후 이미징 하는 경우 24 h까지 4 ° C에서 마이크로 원심 분리기 랙에 슬라이드를 저장 합니다.
6. 오로 얼룩진 벌레의 이미징
   1. 색상 가능 카메라 이미지 오로 얼룩진 벌레를 사용 하 여.
   2. 5 배 확대를 사용 하 여 이미지 보기의 한 필드에 여러 가지 벌레를.
   3. 개별 벌레의 더 나은 시험 10 배 확대로 전환.
   4. 압축으로 인해 데이터 손실을 방지 하려면 TIF 형식에서 이미지를 내보냅니다.
      참고: 경우 오로 + DAPI 얼룩, 형광을 캡처할 수 있는 하나에 색상 가능 카메라를 전환.
7. 오로 얼룩진 벌레의 이미지 분석
   1. ImageJ를 micrograph(s)을 업로드. 플러그인 풀 다운 메뉴에서 이미지 파일 인식 되지 않으면 바이오 형식 함수를 사용 합니다.
   2. 스택 함수에서 이미지 풀 다운 메뉴에서 이미지 스택 사용 하 여 여러 현미경을 비교 하면 이미지 스택을 만듭니다.
   3. 지질 작은 물방울의 가시성을 개선 하기 위해 동일한 풀-다운 메뉴에서 밝기/대비를 조정 합니다.
   4. 특정 조직 또는 동물의 체 내 지질 축적에 따라 이미지를 분류할 수 있습니다.
   5. 지질 지역화의 더 나은 평가 및 일반적인 이미지 유물 ImageJ를 사용 하 여 식별 이미지 풀 다운 메뉴에서 색상 기능을 선택 하 고 표시 각 RGB 구성 요소의 신호를 RGB로 스택 클릭 합니다.

결과

SKN-1은 bZip, cytoprotective 전사 요소는 포유류 NRF2와 상 동을 공유 하 고 지방산 산화를 중재에 표시 되었습니다. 그들의 식단에 포도 당 농도 따라 웜 constitutively 활성화 skn 1 대립 유전자와 다른 지질 수준 나 일 빨강⁷물 때를 표시 합니다. 그림 1A -C 표시 활성화 skn-1 동물 지질 수준을 증가 하는 조건에 노출 됩니다. NR 형광 FITC/GFP 채널을 사용 하 여 캡처한 소장, 따라 유명 하지만 머리, 꼬리, 창 자 루멘에 주차. 지질 수준 증가, 개별 NR 스테인드 입자는 더 분별, 어렵다는 낮은 노출 시간을 할 거 수 있습니다. 이 방법은 양적 프록시 형광 강도 사용 하 여 지질 축적에 대 한, 비록 지방 매장 되지 않은 세포 구조의 난다 얼룩 구별에 ...

토론

비만 및 대사 질환에서 상승 선 충 C. 세포와 조직에 지방 축적 조절 메커니즘 연구에 적합 한 모델을 만든다. 최근의 증거는 지질 수준에 변화는 인슐린 신호⁸, 호르몬 수용 체², 생식 출력⁵의 정품 인증에서에서 배열 하는 세포질 과정에 대 한 상관을 제안 합니다. 레이블 없는 현미경 검사 법 및 크로마토그래피 방법, 나 일 빨강 및 오일에 비해 붉은 O 되며 벌레에 중립 지질을 지속적으로 얼룩에 사용 하는 상대적으로 저렴 한 염료 reproducibly^10,,1213. 두 번째는 hypodermis, 소장, 생식 선 등 조직 중 지질 분포의 평가 용이 하 게 하는 동안 첫 번째 총 지질 수준의 정량화에 대 한 수 있습...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Imager.M2m 현미경	Zeiss	형	광 현미경
ERC5s 카메라	Axiocam	해당 없음	컬러
MRm 카메라	Axiocam	해당 없음	형광 지원
나일 레드	Thermo Fisher	N1142	지질 염색
오일 레드 O	Alfa Aesar	A12989	지질 염색
DAPI	Thermo Fisher	D1306	DNA 염색
이소 프로필 알코올	BDH	BDH1133-1LP	고착 용액
0.2 &마이크로; m seterile 주사기 필터	VWR	28145-477	셀룰로오스 아세테이트 필터
원심분리기 5430	Eppendorf	5428000015	원심분리기
셰이커 로티세리	연구소 퀘이크	400110Q	셰이커
튜브 로테이터	VWR	10136-084	로테이터
K2HPO4	Sigma-Aldrich	7758-11-4	NGM
KH2PO4	Sigma-Aldrich	7778-77-0	NGM
MgSO4	Alfa Aesar	7786-30-3	NGM
CaCl2	Sigma-Aldrich	10035-04-8	NGM
NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5	NGM
콜레스테롤	Sigma-Aldrich	57-88-5	NGM
펩톤	BD 생명과학	211677	NGM
한천	Teknova	L9110	NGM
LB 매체	Sigma-Aldrich	L3147	박테리아 성장