방법 논문

헬리컬 펩 티 드를 통해 사진 유도 Thiol-ene 또는 yne Hydrothiolation Thioether/비닐 황 화물-곁에 건설

DOI:

10.3791/57356

⸱

2018년 8월 1일

 ,  ,  , 
1Key Laboratory of Chemical Genomics, School of Chemical Biology and Biotechnology, Peking University Shenzhen Graduate School

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

선물이 thioether/비닐의 건설에 대 한 프로토콜 황화 닿는 헬리컬 펩 티 드 사진 유도 thiol-ene/thiol-yne hydrothiolation를 사용 하 여.

초록

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여기, 우리-수 지 intramolecular/intermolecular thiol-ene hydrothiolation를 사용 하 여 thioether-곁에 펩 티 드의 준비에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 또한,이 프로토콜 난, 난 + 4 개의 위치에 알 켄/alkyne 사이드 체인을 소유 하는 amino acids 및 시스테인 잔류물 사이 솔루션 intramolecular thiol-yne hydrothiolation를 사용 하 여 비닐 황화 닿는 펩 티 드의 준비를 설명 합니다. 선형 펩 티 드 표준 Fmoc 기반 단단한 단계 펩 티 드 합성 (SPPS)을 사용 하 여 합성 했다. Thiol 한 hydrothiolation는 intramolecular thio-ene 반응 또는 펩 티 드의 길이 따라 intermolecular thio-ene 반응 중 하나를 사용 하 여 실시 됩니다. 이 연구에서 intramolecular thio-ene 반응 수 지에 따라 선형 펩 티 드의 완전 한 합성 시스테인 잔류물의 trityl 그룹의 deprotection를 사용 하 여 짧은 펩 티 드의 경우 수행 됩니다. 수 지 photoinitiator 4 methoxyacetophenone (지도) 및 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP)를 사용 하 여 UV 방사선을 설정 합니다. Intermolecular thiol-ene 반응 Fmoc Cys 오 N, N-dimethylformamide (DMF) 용 매에 용 해 하 여 수행 됩니다. 이 다음 수 지를 켄 베어링 잔류물을 사용 하 여 펩 티 드와 함께 반응. 그 후에, macrolactamization는 활성화 시 약 지에로 benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBop), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt), 및 4-Methylmorpholine (NMM)를 사용 하 여 밖으로 수행 됩니다. Macrolactamization, 다음 펩 티 드 종합은 계속 표준 SPPS를 사용 하 여. Thio-yne hydrothiolation의 경우 선형 펩 티 드 수 지에서 죽 습, 건조, 이며 이후 degassed DMF에 녹아. 이것은 다음 photoinitiator 2, 2-dimethoxy-2-phenylacetophenone (DMPA)와 UV 빛을 사용 하 여 반구. 반응에 따라 DMF 증발 하 고 원유 찌 꺼 기 침전은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 사용 하 여 정화. 이러한 방법은 수 세대 thioether 곁 순환 펩 티 드의 우수한 기능 그룹 허용 및 좋은 수확량을가지고 thio-ene 또는 yne 클릭 화학의 사용을 단순화 하기 위해 작동 합니다. 펩 티 드로 thioether의 소개의 시스테인 잔류물 및 자연의를 이황화 채권 기준으로 redox 불활성 이다.

서론

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단백질 단백질 상호 작용 (PPIs)를 변조 하는 ligands의 개발 현대 약물 발견에 대 한 매력적인 접근을 제공 합니다. 따라서, 많은 노력은 PPIs1,2,3변조 효율적으로 수 공부 소설 화학 형식으로 투자 되었다. PPIs는 일반적으로 얕은 크거나 단종 상호 작용 표면, 구성 하 고 작은 분자 PPIs4,5의 변조에 대 한 부적 절 한 ligands로 일반적으로 간주 됩니다. 적당 한 노출 상호 작용 표면 면적, 짧은 펩 티 드 단백질 인터페이스의 구조 기능을 모방 하는이 문제가6,7를 해결 하기 위해 이상적인 후보자를 나타냅니다. 그러나, 짧은 펩 티 드 일반적으로 수성 솔루션에 구조화 된 되지 않습니다. 이 물 분자의 펩 티 드 등뼈 및 잘 정의 된 conformations intramolecular 수소 결합 네트워크와 경쟁 하는 물8entropically 유리한는 사실 때문입니다. 또한, 펩 티 드의 본질적으로 낮은 안정성 및 세포 침투성 속성 주로 생물 학적 응용9,10에 그들의 사용을 제한. 단백질 데이터 은행 (PDB) 분석 > 짧은 α-나선 상호 작용11를 포함 하는 PPIs의 50%. 따라서, 다른 화학 방법 나선 안정화에 관한 개발 되었습니다. 이들은 이황화/thioether 유대 형성12,,1314, 반지-닫는 metathesis15, 락탐 반지 형성16를 포함, 화학17의 추가 "클릭" perfluoroarenes18,19, 그리고 비닐 황화 대형20.

안정된 헬리컬 펩 티 드 널리 p53, 등 다양 한 세포내 목표에 대 한 활용은 에스트로겐 수용 체, Ras, bcl-2 가족 단백질, 그리고 다른 사람21,22,,2324. ALRN-6924, 모든 탄화수소 MDM2 및 MDMX의 펩 티 드 이중 억제제를 붙인, 임상 조사25현재 사용 되 고. 지난 몇 년 동안, 우리의 그룹은 thiol ene와 thiol-yne 반응26,,2728를 사용 하 여 새로운 펩 티 드 안정화 방법의 개발에 집중 했다. 일반적으로, 우리는 자연스럽 게 풍부한 시스테인 사용 되 면 이러한 사진 시작 반응 온화한 조건 하에서 효율적인는 증명 하고있다. 또한, 우리가 이러한 반응 우수한 기능 그룹 허용 바이오 직교 고 펩 티 드 및 단백질 수정29적용할 수 입증 되었습니다 나타났습니다. 결과 thioether/비닐 황화 곁에 펩 티 드 크게 제약 펩 티 드의 화학 공간을 개선 정한 밧줄에 수정 센터를 제공 하 고 수많은 생물 학적 응용 프로그램30 사용에 대 한 적용할 수 입증 ,3132. 날짜 하려면, 제한 된 보고서만 thiol-ene/thiol-yne 펩 티 드 cyclization에 관한 설명 했습니다. 2009 년 Anseth 그 외 여러분 에 의해 출판, 연구에는 수 지에 intramolecular thiol-ene 시스테인과 활성화 된 알 켄 사이 펩 티 드 cyclization에 대 한 반응은 시연된33. 2015 년에 chou의 외. 2 구성 요소 급진 시작된 thiol-ene 반응34 와 후속, 순차 thiol-yne/한 커플링 반응35스테이플링 펩 티 드에 대 한 설명. 최근에, 우리는 thioether/비닐 황화 곁에 펩 티 드20,,2627에 따라 작품의 시리즈 설명. 이 프로토콜에는 광범위 한 연구 공동체에 대 한 도움이 될 것입니다 희망에서 위에서 언급 한 thioether/비닐 황화 곁에 펩 티 드의 상세한 종합을 설명 합니다.

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프로토콜

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1. 장비 준비

  1. 수동 펩 티 드 합성 장치에 대 한 효율적인 증기 두건에서 진공 매니폴드 (테이블의 재료)를 배치 합니다. 다음, 진공 매니폴드에 3 방향 stopcocks를 놓고 질소 또는 아르곤 가스 라인에 그들을 연결 합니다. 고무 격 막 사용 하 여 모든 사용 하지 않는 후미 모자.
  2. 수 지 가득 열 (0.8 x 4 cm, 10 mL 저수지, 재료의 표참조) 매니폴드 3 방향 stopcocks (그림 1)를 사용 하 여 연결 합니다. 진공 여과 또는 고무 피 펫 벌브로 밀어내어 진공 시스템에 연결 된 펌프를 사용 하 여 열에 있는 용 매를 제거 하.
  3. Photoreactor (그림 2)를 사용 하 여 UV 방사선에 대 한 10 350 nm 램프 (테이블의 재료)를 갖추고 있습니다. 아르곤 가스 탱크는 photoreactor 이전에 photoreactions 동안 아르곤 가스로 가득 되도록 photoreactor 공기 흡입구를 통해에 연결 합니다.
  4. photoreactor의 UV 램프에 전환 하기 전에 확인 경우에 자외선에서 방사선 photoreactor 문이 닫혀 있다.

2. 수 지 준비

참고: 일반적으로, 펩 티 드 기판의 건설 수행 됩니다 Fmoc 기반 단단한 단계 펩 티 드 합성 프로토콜을 사용 하 여. 이 C 터미널 아 미드 나머지 다음 펩 티 드 분열을 그대로 링크 아 미드 수 지를 사용 하 여 실시 됩니다. 이 프로토콜은 종이 걸쳐 사용 됩니다.

주의: N, N-dimethylformamide (DMF), dichloromethane (DCM), 4-methylmorpholine (NMM), 및 N, N-diisoproylethylamine (DIPEA)은 유독 하 고 유해한 흡입, 섭취, 또는 피부 접촉에 의해. Diethyl 에테르 가연성 이다입니다. Trifluoroacetic 산 (TFA) 부식성입니다. 1, 2-ethanedithiol (EDT)는 매우 악취를 풍기. 따라서, 모든 유기 용 제, 화학 물질, 적절 한 개인 보호 장비 (니트 릴 장갑, 실험실 외 투, 및 보호 안경) 처리와 있어야 화학 증기 두건 내부 처리 합니다.

  1. 다음 수식을 사용 하 여 필요한 수 지의 양을 계산 합니다.
    확장 (mmol) / (적재 능력 (mmol/g) 1000 (mg/g)을 수 지) 수 지 (mg)의 질량 =
    예를 들어, 링크 아 미드 MBHA 수 지 (0.5 m m o l/g) 25 µmol에 대 한 금액 = 0.025 m m o l / (0.5 m m o l/g 1000 mg/g) = 50 mg. 다음, 열 수 지의 50 밀리 그램 무게 하 고 3 방향 stopcocks를 사용 하 여 진공 매니폴드에 그것을 설정 합니다.
  2. 열 (0.8 x 4 cm, 10 mL 저수지)에 수 지를 DCM의 1-2 mL를 추가 합니다. 수 지를, 부드럽게 교 반 하십시오 질소 또는 아르곤 stream을 사용 하 여 10 분. 다음, 진공 여과 사용 하 여 용 매를 제거.

3. N-터미널 Fmoc Deprotection 및 세척

  1. Deprotecting 솔루션 N 맨끝 Fmoc 준비: 50% (v/v) morpholine 유리병에 DMF에의 한 적절 한 볼륨 (200 mL)를 준비.
  2. 수 지에 deprotection 솔루션의 1-2 mL를 추가 하 고 부드럽게 10 분 동안 그것을 선동 한 다음 진공 청소기를 사용 하 여 솔루션을 배수. 그 순서 대로 DMF (1-2 mL)과 DCM (1-2 mL) using, 수 지와 반응 선박 3 배 총을 철저 하 게 세척. 다음 절차를 반복 합니다 deprotection 및 세척 1 x.

4. Fmoc 보호 아미노산 커플링

  1. Fmoc-크 람-오 (5 equiv., 41.4 mg), 무게 25 µ-스케일 수동 합성의 경우 예를 들어, 알라닌 잔류물의 커플링을 사용 하 여 2-(6-chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate (HCTU; 4.9 equiv., 50.5 m g)에 폴 리 프로필 렌 컨테이너 DMF (0.5 mL)에 녹 이십시오.
  2. DIPEA 추가 (10 equiv., 43.5 µ l) 0.25 M를 생성 하기 위해 활성화 아미노산 솔루션 (표 1). 대략 1 분 사전 활성화에 따라 수 지에 솔루션을 추가 하 고 약 1-2 h N2 와 거품.
  3. 이 단계에서 일련의 단계를로 펩 티 드 사슬에 있는 각 아미노산을 통합: N 맨끝 Fmoc 그룹, 그리고 세척의 deprotection HCTU를 사용 하 여 활성화를 통해 아미노산의 결합에 의해 뒤에 먼저.
    참고: 더 이상 연결 시간 (예., 2 h) 것이 좋습니다 경우 sterically 방해 아미노산 잔류물에 따라 커플링 [예., Fmoc-목 (tBu)-오, Fmoc Cys (Trt)-오, Fmoc-그의 (Trt)-오, Fmoc Arg (Pbf)-오]. 비 천연 아미노산을 베어링 켄/alkyne 5 대신 3 항목에 사용 됩니다 그리고 3 h 반응 남아 있습니다.
  4. Arora 외 에 설명 된 대로 카이 저 또는 chloranil 테스트를 사용 하 여 펩 티 드 합성 진행률 모니터링 36 이러한 테스트 무료 1 차 및 이차 아민의 유무는 존재의 질적 평가 제공합니다. 또는, 펩 티 드의 약 2-3 mg 수 지에서 죽 습 하 고 LC MS에 의해 분석 될 수 있습니다.

5. thiol-ene Hydrothiolation 및 Thiol-yne Cyclization

  1. 수 지에 cyclization (그림 3)를 통해 thioether 링커를 구성 합니다.
    1. Trt deprotection 솔루션 (TFA/TIS/DCM 0.03/0.06/1.0)의 약 50 mL를 준비 합니다. Cys-및 mS5치료-수 지 베어링 [NH2-R-mS5-A-A-A-Cys (Trt)-R'-수 지, 50 mg] 10 mL 열에서 Trt deprotection 솔루션의 1-2 mL와 함께. 부드럽게 N2를 사용 하 여 10 분 동안 해결책을 교 반 하십시오. 마지막으로, DCM로 그것을 씻어 (1-2 mL) x 3의 총.
      참고: MS5 나타냅니다 alkylene 베어링 빌딩 블록 펩 티 드 결합 및 thio-ene cyclization38사용 (참조 그림 6에 묘사 된 구조).
    2. 약 6 x 총 솔루션 색상은 노란색이 더 이상 때까지 시스테인, trityl 보호 그룹을 제거 하려면 위에서 설명한 절차를 반복 합니다.
    3. R-mS5-A-A-A-Cys(-SH)-R을 씻어 N2버블링 '-수 지 [무료 thio와 시스테인 (-SH)] 그 순서 대로 (1-2 mL) DCM와 DMF (1-2 mL). 2 분 동안 메탄올 (1-2 mL)을 사용 하 여 수 지를 축소 한 다음 용 매 여과 사용 하 여 제거. 그런 다음 순차적으로 열에 약 5 분에 대 한 N2 가스의 증기에서 수 지 건조.
    4. 준비 degassed DMF 미리 입 플라스 크 내의 용 매에 기지개 했다 긴 바늘을 통해 약 1 시간에 대 한 버블링 질소 가스에 의해.
    5. 무게 종이 통해 10 mL 둥근 바닥 플라스 크에 수 지를 전송 합니다. 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone photoinitiator의 추가 의해 따라 degassed DMF의 2 mL에 수 지를 중단 (MMP; 1 equiv., 5.6 밀리 그램), 4-methoxyacetophenone (지도; 1 equiv., 3.8 mg).
    6. 저 어 추가 (0.3 cm) 플라스 크로 바와 적당 한 고무 플러그 플라스 크 모자 다음 플라스 크에 어 오일 펌프를 사용 하는 질소 가스로 치환.
      참고: 불활성 분위기 필요 하지 않습니다 엄격 하 게 효과적인 thio-ene photoreaction에 대 한 단단한 단계에. 그러나, 그것이 그림5에서 솔루션 단계에서 thio-yne photoreaction에 대 한 매우 필요 합니다. 그렇지 않으면, 유황 UV 방사선 조사 동안 산화 됩니다.
    7. 반응 플라스 크를 photoreactor로 설정 하 고 실내 온도 (그림 2)에서 UV 방사선에서 1 시간에 대 한 수 지를 저 어.
      주의: photoreactor UV 램프를 켜는, 사전 확인 하십시오 경우에 UV 빛에서 유해한 방사선 photoreactor 문이 닫혀 있다.
      참고: 선형 펩 티 드 선구자는 제품의 동일한 분자량으로 새로운 시퀀스 좋습니다 자주는 photoreactions 동안 반응 혼합물을 샘플링. 일반적으로, 선형 및 주기적인 펩 티 드 크게 다른 화란을 표시합니다. 이 HPLC를 사용 하 여 쉽게 구별 될 수 있습니다. 또는, 5, 5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic 산) (DTNB) 시 약 무료 thiol37의 존재를 공부 하는 데 사용 또한 수.
    8. 열에 플라스 크에서 수 지를 전송 하 고 진공 여과 사용 하 여 용 매를 제거 합니다. 세척 하 고 단계 5.1.3에서에서 설명 된 대로 수 지를 건조.
    9. 분열 칵테일 (TFA/팁/EDT/H2O 94/1/2.5/2.5) 증기 두건에서의 약 10 mL를 준비 합니다.
    10. 2 mL 폴 리 프로필 렌 용기에 수 지를 전송, 컨테이너, 분열 칵테일 (TFA/팁/EDT/H2O 94/1/2.5/2.5)의 1 mL을 추가 하 고 밀접 하 게 나사 모자를 사용 하 여 컨테이너를 봉인. 다음,로 교 반 1.5-2 h에 대 한 증기 두건에서 60 rpm의 속도로 궤도 통에 컨테이너를 부드럽게 하십시오.
      주의: TFA 매우 부식성입니다. 보호복을 착용 하 고 효율적인 증기 두건에서 작동. 동부 서머 타임은 매우 악취를 풍기는 물질 하 고 효율적인 증기 두건에서 처리 되어야 합니다.
    11. 증발 증기 두건에는 N2 가스 스트림 아래 여 TFA 칵테일을 제거 합니다. 다음, 30 s 및 격리에 대 한 차가운 diethyl 에테르 (1 mL)을 사용 하 여 잔류물을 침전 2 분 12000 x g에서 원심 분리를 통해. 원심 분리, 다음 조심 스럽게 부 어 에테르 구성 요소를 줄. 2x 대 한 침전과 원심 분리 단계를 반복 합니다. 증발 건조에 잔류물.
    12. 마지막으로, 1 mL H2O/이기 (2:1)에 찌 꺼 기를 녹이 고 HPLC C18 분석 열을 사용 하 여 정화 (4.6 x 250 m m 흐름 속도 1.0 mL/min). 사용 H2O (포함 하는 0.1 %TFA)와 UV 280 nm와 220 nm 파장 (표 2)를 사용 하 여 25 분 모니터 HPLC 스펙트럼을 통해 70% 이기에 20%에서 2%/min 선형 그라데이션에서 용 매로 순수한 이기.
  2. Macrolactamization (그림 4)에 의해 intermolecular thio-ene 반응, 그리고 cyclize 펩 티 드를 통해 thioether 링커를 구성 합니다.
    1. 선형 펩 티 드 H2N-A-A-A-mS5베어링 alkylene 잔류물을 합성 (2-R ')-R'-수 지 (50mg) 사용 하 여 표준 Fmoc 기반 단단한 단계 펩 티 드 합성 (SPPS)에 설명 된 대로 단계 2-4. 다음, 세척 하 고 단계 5.1.3에서에서 설명 된 대로 수 지를 건조.
    2. 10 mL 둥근 바닥 플라스 크 5.1.4 단계에서 설명한 대로 degassed DMF의 2 개 mL를 포함 하는 수 지를 일시 중단 합니다.
    3. 추가 photoinitiator MMP와 지도 (MMP: 1 equiv., 5.6 밀리 그램; 지도: 1 equiv., 3.8 m g), Fmoc-Cys-오 (3 equiv., 25.7 m g), 그리고 저 어 (0.3 cm) 플라스 크로 바. 적당 한 고무 플러그를 사용 하 여 플라스 크 모자 고 오일 펌프를 사용 하 여 플라스 크에 공기를 질소 바꿉니다.
    4. 반응 플라스 크를 photoreactor로 설정 합니다. 실내 온도 (그림 2)에서 UV 방사선에서 1-2 시간 저 어.
    5. LC MS 분석 아래 반응 모니터링: 분열 칵테일을 사용 하 여 수 지의 2-3 mg을 쪼개 다. 다음 찬 diethyl 에테르 (300 µ L)으로 찌 꺼 기를 침전, 원심 분리, 여 찌 꺼 기를 분리 하 고 5.1.11 단계에서 설명한 대로 건조에 잔류물을 증발. 그 후, H2O/이기 (2:1) 100 µ L에서 잔류물을 디졸브. 펩 티 드 솔루션 0.22 μ m 미소 한 구멍이 있는 필름을 사용 하 여 여과 하 고 분무 이온화 (ESI)에서 이온화 하 고 긍정적인 모드에서 운영 하는 화합물과 LC-MS를 사용 하 여 분석.
    6. 경우에 필요한, 반복 단계 5.2.2-반응 되도록 5.2.4 완료 수행 됩니다.
    7. 사진-반응의 완료 다음 열에 플라스 크에서 수 지를 전송 하 고 진공 여과 사용 하 여 용 매를 제거 합니다. 세척 하 고 단계 5.1.3에서에서 설명 된 대로 수 지를 건조.
    8. Benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate의 DMF 솔루션 추가 (PyBob; 2.4 equiv., 31.2 mg), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt; 2.4 equiv., 8.1 m g), 및 NMM (4 equiv., 11 µ L)는 macrolactamization에 대 한 열 수 지에. 버블 2 h N2 이 솔루션.
      1. 또한,이 커플링 반응 단계 5.2.3에에서 설명 된 대로 LC-MS를 사용 하 여 모니터링 합니다. 필요한 경우 반복 반응 되도록이 단계 완료를 수행 됩니다.
    9. 3, 4 단계에 설명 된 대로 표준 Fmoc 기반 SPPS를 사용 하 여 펩 티 드 연장
    10. 모든 아미노산 잔류물의 어셈블리 단계 5.1.10 5.1.11에에서 설명 된 대로 수 지에서 펩 티 드를 쪼개 고 5.1.12 단계에서 설명한 대로 그것을 정화.
  3. 솔루션 단계 (그림 5)에서 비닐 황화 링커를 구성 합니다.
    1. 2-4 단계에 설명 된 대로 표준 Fmoc 기반 SPPS를 사용 하 여 선형 펩 티 드 베어링 alkyne 잔류물을 음성 합성. 이전 연구20에 설명 된 대로 잘 설립 된 프로토콜에 따라 아미노산을 베어링 alkyne 음성 합성.
    2. 수 지에서 펩 티 드를 쪼개 고 5.1.11 5.1.9-단계에 설명 된 대로 찬 diethyl 에테르를 사용 하 여 침전. 절단, 수 지의 강 수에 따라 2 분 12000 x g에서 원심 분리를 사용 하 여 펩 티 드를 수집 합니다.
    3. 진공 상태에서 결과 잔류물을 건조. 0.5 m m의 최종 농도 도달 하기 위해서는 100 mL 둥근 바닥 플라스 크에 degassed DMF (50 mL)에 찌 꺼 기를 분해 (수 지, 0.025 m m o l의 로드에 따라 (1000 mL/L / 0.5 mmol/L) 50 mL =).
      1. Photoinitiator DMPA (0.5 equiv., 3.2 밀리 그램)를 추가 하 고 솔루션으로 뻗어 긴 바늘을 통해 N2 를 사용 하 여 10 분 동안 반응 솔루션을 드. 다음, 0.5-동요 없이 1 시간에 대 한 상 온에서 자외선 아래 샘플 비추는.
    4. 높은 진공 아래 DMF를 제거 하 고 그것의 유기 부산물을 분해 하려면 diethyl 에테르를 추가 하 여 원유 찌 꺼 기를 침전. 그런 다음 2 분 동안 12000 x g에서 원심 분리를 사용 하 여 찌 꺼 기 분리. 원심 분리, 다음 조심 스럽게 부 어 에테르 구성 요소를 줄. 증발 건조에 잔류물. 마지막으로, H2O/이기 (2:1) 1 mL에 찌 꺼 기를 녹이 고 정화 단계 5.1.7에에서 설명 된 대로 HPLC를 사용 하 여.

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결과

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펩 티 드 Ac YmS5AAAC NH2 와 그 cyclized 제품 Ac-Y-(쿠-1, 5)-[mS5AAAC]-의 HPLC 및 MS 스펙트럼 NH2 수 지에 intramolecular thiol-ene photoreaction를 사용 하 여 생성 된 그림에에서 묘사 6B. 주기적인 펩 티 드의 선형 전조를 기준으로 동일한 분자량을 발견. 그러나, HPLC 보존 시간이 약 2 분 같은 분리 조건 하에서 그것의 선구자 보다 이전 수 관찰 되었다. 서로 다른 시퀀스와 짧은 펩 티 드 모두 관찰 되었다 좋은 변환 해야 그림 6 c에서처럼.

그림 7B<...

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토론

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그림 3에 설명 된 수 지에 intramolecular thio-ene cyclization trityl 그룹의 시스테인 잔류물의 제거 이후 photoreaction에 대 한 중요 한 단계가 될 발견 되었습니다. 또한, 이전에 펩 티 드 분자 무게와 반응으로 동일한 것으로 밝혀졌다 다음 그림 6B에 그려져 있습니다. 따라서, HPLC id 또는 DTNB 분석 결과 사용 하 여 반응을 모니터 하기 위해 필요 합니다. Intermolecular thio-ene 반응 그림 4에 설명 된 경우 MS 모니터링은 필요 합니다. 락탐 커플링의 추가 단계 thioether 밧줄의 건설에 대 한 필요를 발견 하는 동안이 프로토콜 긴 펩 티 드에 대 한 전반적으로 높은 효율성을 달성 하기 위하여 사용 될 것 이라고 하는 것이 좋습니다.

비...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 없다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자 인정 (제 21372023, 21778009 및 81701818); 중국 보조금의 자연 과학 재단에서 재정 지원 과학과 기술 (No. 2015DFA31590); 중화 인민 공화국의 심천 과학 및 기술 혁신 위원회 (제 JCYJ20170412150719814, JCYJ20170412150609690, JCYJ20150403101146313, JCYJ20160301111338144, JCYJ20160331115853521, JSGG20160301095829250, 및 GJHS20170310093122365); 그리고 중국 박사 후 과학 재단 (No. 2017 M 610704).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
링크 아미드 MBHA 수지(0.53mmol/g)HECHENGGRM50407
Standard Fmoc-protected 아미노산GL Biochem (Shanghai) Ltd.
N-메틸-2-피롤리디논심천 엔디 생명공학 Co.Ltd.3230피부 유해
N, N- 디메틸 포름 아미드에너지B020051피부 유해
디클로로 메탄에너지W330229피부 유해
N, N- 디소 프로일 에틸 아민Aldrich9578자극성
트리 플루오로 아세트산J & K101398부식성
트리이소프로필실란J& K973821
1,2-에탄디티올J& K248897악취
2-(6-클로로-1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸아미늄 헥사플루오로포스페이트 GL Biochem (상하이) Ltd.
모르폴린알드리치, M109062성
디에틸 에테르알드리673811인화성
아세토니트릴알드리치9758독성,
메탄올알드리치9758독성:
2-하이드록시-1-[4-(2-하이드록시에톡시)-페닐]-2-메틸-1-프로판논에너지A050035
4-메톡시아세토페논에너지A050098
2,2-디메톡시-2-페닐아세토페논에너지D070132
5,5'-디티오비스-(2-니트로벤조산)J& K281281
Benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate에너지E020172
1-Hydroxybenzotriazole에너지D050256
4-Methylmorpholine에너지W320038
고성능 액체 크로마토그래SHIMADZULC-30AD
전기 분무 이온화 질량SHIMADZULCMS-8030
LyophilizerLabconcoFreeZone
SpeedVac 집중 시스템ThermoSavant
진공 매니폴드promegaA7231
삼방향 스톱콕Bio-Rad7328107
poly-prep 크로마토그래피 컬럼 Bio-Rad7311550
851012, 자극, , , , , , , 피

참고문헌

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