골수성 창시자 및 정렬 전략 소설 셀을 사용 하 여 Murine 골에서 수지상 세포 선구자의 큰 숫자의 생성

요약

여기 우리는 식별 하 고 격리 GM-CSF 골수성 세포 고속 셀 정렬 사용 하 여 구동의 다 수에 대 한 메서드를 제공 합니다. Ly6C 및 CD115 식에 따라 5 가지 인구 (일반적인 골수성 창시자, granulocyte/macrophage 창시자, monocytes, monocyte 파생 된 대 식 세포 및 monocyte 파생 된 DCs)를 확인할 수 있습니다.

초록

문화 monocyte 파생 된 모 수석 세포 (moDC) Granulocyte-대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF)를 사용 하 여 마우스 골 수에서 생성 된의 최근 이전 감사 보다 더 이질적인 것 인정 되었습니다. 이러한 문화는 정기적으로 뿐만 monocyte 파생 된 moDC 대 식 세포 (moMac), 및 monocytes 등도 일부 덜 개발 된 셀 포함. 이 프로토콜의 목표는 일관 된 방법을 제공 식별 및 분리는 많은 종류의 세포가이 문화에 대 한 개발로 서 그들은, 특정 기능 추가 조사 될 수 있도록. 여기에 제시 된 정렬 전략 4 인구 둘 다는 표현 정도 세포에 의해 그들은 GM-CSF 중심 문화에서 개발 Ly6C 및 CD115의 식을 기반으로 먼저 세포를 분리 합니다. 이 4 개의 인구는 일반적인 골수성 창시자 또는 CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage 창시자 또는 GMP (Ly6C +, CD115-), monocytes (Ly6C +, CD115 +), 및 monocyte 파생 된 세포 또는 moMac (Ly6C-, CD115 +)를 포함합니다. CD11c는 Ly6C-, CD115-인구 내에서 두 개의 인구를 구분 하는 정렬 전략에도 추가 됩니다: CMP (CD11c-) 및 moDC (CD11c +). 마지막으로, 두 개의 인구는 Ly6C-, CD115 + 인구 MHC 클래스 II 식의 수준에 따라 내 더 구별 될 수 있습니다. MoMacs 익스프레스 MHC 종류 II, 더 낮은 수준의 높은 MHC 종류 II를 표현 하는 monocyte 파생 된 DC 전조 (moDP) 하는 동안. 이 메서드는 여러 발달 고유 인구 숫자의 신뢰할 수 있는 격리에 대 한 다양 한 기능과 발달 분석에 대 한 충분 한 있습니다. 우리는 하나 같은 기능 판독, 이러한 종류의 세포 차동 응답 Pathogen-Associated 분자 패턴 (PAMPs) 자극을 강조.

서론

Murine 골 수 세포는 사이토카인의 경작 Granulocyte-대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF)은 널리 이용 방법으로 큰 숫자 ^{1, monocyte 파생 된 모 수석 세포 (moDC;로 알려진 염증 DC)를 생성 하 2,3,,45}. 이 세포의 수지상 세포 (DC) 함수 ^6,,78의 학문의 다양 한에서 매우 유용 되었습니다. 일반적으로, 이러한 murine 골 수 세포 교양 6-8 일 이며 수지상 세포 기능 ⁵의 연구를 위해 사용 됩니다. 이러한 문화 오래 되어 고려 했다 주로 균질 성, 차별화 된 moDC의 대부분의 구성 된. 최근에, 그것은 분명이 6-8 일 문화 기간의 끝에, 차별화 된 monocyte 파생 된 세포 (moMacs) ^9,,1011의 큰 하위 집합 뿐 아니라 실제로 많은 moDC 되었다. 우리 자신의 연구 더 적은 개발된 세포, monocytes, moDC 전 (moDP) 등의 다른 하위 집합 ¹⁰7 일 후에 낮은 주파수에서 문화에 남아 있는 것을 보여주는이 발견을 확대 했습니다. 따라서, 수지상 세포 (DC) 함수 사용 하 여이 시스템에 의해 생성 된 셀의 연구 이전 감사 보다 세포 유형의 광범위 한 코 호트의 응답을 반영 수 있습니다.

우리는 훌륭한 제의로 GM-CSF 생성 moDC 차별화 ^12,,1314의 마지막 단계에서 이러한 세포의 기능에 관련 된 연구에서 배웠습니다. 그러나, 우리가 이해 크게 이들의 발달 경로 대 한 세포 ^2,,1516 어떻게 그리고 언제 그들은 구체적인 전시의 같은 기능: 병원 체 관련 분자에 응답 패턴 (PAMPs), 식 균 작용, 항 원 처리 및 프레 젠 테이 션 ¹³, 그리고 항균 활동. 기존의 Flt3L 기반 DC 창시자와 선구자의 많은 수의 격리 프로토콜 보고 ¹⁷되었습니다. 이러한 고유한 인구의 격리 carboxyfluorescein succinimidyl 에스테 르 (CFSE)를 사용 하 여 달성 되었다-스테인드 골 수 세포 (세포를 분할 추적)와 3 일 동안 Flt3L에 문화. 셀은 비재귀 긍정적인 세포의 고갈 그리고 조상과 전조 인구 CD11c 식 ¹⁷을 기반으로 정렬 했다. GM-CSF 중심 문화에서 DC의 이른 창시자를 식별 하기 위해 Leenen의 그룹에 의해 또 다른 방법은 CD31 Ly6C ¹⁸에 따라 셀을 정렬 했다. 초기 목표는 창시자 및 GM-CSF 기반 moDC의 선구자는 비슷한 방법을 만드는 것 이었다. GM-CSF에 의해 생성 된 특정 세포 유형으로 인해 우리는 접근 및 전략 개발의 초기 및 이후 단계에서 표현 했다 분자의 식에 따라 정렬 적응. 우리가 궁극적으로 결정 하는 Ly6C, CD115 (CSF-1 수용 체), CD11c ¹⁰종류 구별이 셀에 대 한 최고의 마커를 했다.

여기, 우리 GM-CSF에 의해 구동 하는 차별화의 통로 따라 개발의 일부의 단계에서 세포의 분리 방법 제시: 일반적인 골수성 조상 (CMP), Granulocyte Macrophage 조상 (GMP), monocyte, monocyte 파생 된 대 식 세포 (MoMac) 및 monocyte 파생 된 DC (MoDC). MoMac 인구 수 추가 분리 될 기반 MHC 클래스 II 식의 수준에 moDC 전조 인구 (moDP) ¹⁰공개. 우리가 활용 고속 형광 활성화 셀이 5 인구 Ly6C, CD115, 및 CD11c의 식에 따라 분리 (FACS) 전략을 정렬 합니다. PAMP 자극에 대 한 답변을 공개 하는 기능 분석에서 이러한 셀의 시험 다음 보여 줍니다.

프로토콜

모든 동물 작업 치료와 국립 보건원의 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에 설명 된 권장 사항에 따라 어 번 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다.

1입니다. 골 수 컬렉션에 대 한 준비

1. 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 1640 매체 10% 태아 종 아리 혈 청, 2mm 글루타민과 0.22 μ m 진공 필터 플라스 크 단위의 상단에 50 µ M 2-mercaptoethanol 보충의 솔루션을 추가 하 여 250 mL 완전 한 미디어를 준비 하 고 진공을 적용.
   참고: 완전 한 매체 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 최대 2 개월까지.
2. 150 mL 살 균 H₂O 500 mL 플라스 크에 100% 에탄올의 350 mL를 혼합 하 여 70% 에탄올 솔루션을 준비 합니다.
3. 4 ° c 설정된 원심 분리기
4. 포 셉, 메스, 및 70% 에탄올에가 위를 소독.
5. 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 세 60 mm 페 트리 접시에 완전 한 미디어의 5 mL를 추가 합니다.
6. 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 50 mL 원뿔 튜브를 완전 한 미디어의 30 mL를 추가 합니다.

2입니다. Murine 골 수 세포 수집

1. 안락사에 대 한 2013 미국 수의 의학 협회 (AVMA) 지침에 의해 설정 된 규칙에 따라 CO₂ 마 취 법에 의해 C57BL/6 마우스를 안락사.
2. 제거 하 고 뒷 다리를 제거.
   1. 75% 에탄올, 뒷 다리와 몸통을 포화 곡선된 조직이 위 고관절 주위 피부를 통해 얕은 상처를 확인. 근육을 드러내는 발목 쪽으로 엉덩이에서 피부를 당겨 단단히 집게를 사용 하 여. 가 위를 사용 하 여 제거 피부 플랩.
   2. 전체 뒷 다리 대 퇴 골/고관절 보다 뼈를 통해 서 절단 하 여 제거 합니다.
      참고: 살 균 그 지역을, 뿐만 아니라 에탄올 제공 하 고 깨끗 한 상처에 도움이 되며 샘플을 오염에서 머리카락을 방지.
   3. 다리 골 수확에 대 한 새 위치로 전송 됩니다, 경우 완전 한 미디어에 다리 잠수함.
3. 살 균 biosafety 내각에서 working 전송 다리 접시는 이전 준비 중.
4. 그냥 잘라가 위를 사용 하 여 발목 아래 신중 하 게 최대한 근육과 탄성 결합 조직 제거. 두 번째 준비 페 트리 접시를 청소 뼈를 전송 합니다.
   참고: 모든 근육을 제거 하지 않아도 됩니다, 하지만 너무 많은 나머지 조직이 어려울 수 있습니다 그것은 골 수 밖으로 플러시.
5. 대 퇴 골, 무릎 및 경골을 구분 합니다.
   1. 집게를 사용 하 여 무릎에서 다리를 개최 하 고 골 수를 찾습니다.
      참고: 골 캐비티 내부에 뼈는 대 퇴 골 및 경골의 끝으로 상단에 희미 한 붉은 선으로 표시 됩니다.
      1. 가 위를 사용 하 여 다음과 같이 3 개의 상처를 확인 합니다.
         1. 바로 골 수 끝에 나타나는 위에 경골을 잘라.
         2. 무릎 관절 아래 그냥 잘라.
         3. 무릎 관절 위에 그냥 잘라.
         4. 고관절 대 퇴 골에 여전히 연결 되어, 바로 고관절 아래 컷.
      2. 페 트리 접시에 3 개의 파편을 반환 하 고 다른 다리에이 과정을 반복.
6. 대 퇴 골과 경골에서 골을 플러시.
   1. 23 G 바늘으로 50 mL 원뿔 튜브, 및 모자에서 완전 한 미디어 10 mL 주사기를 채우십시오.
   2. 세 번째 준비 페 트리 접시 위에 집게와 뼈를 잡고, 뼈 운하에 바늘을 삽입 하 고, (또는 여러 클러스터는 그대로 "플러그"로 나타날 수 있습니다) 세포 밖으로 홍 조를 통해 미디어를 밀어. 뼈를 통해 서 더 많은 색깔을 볼 수 있다 때까지 반복 합니다. 필요에 따라 미디어와 주사기를 다시 채우십시오.
7. epiphyses 호감.
   1. 두 번째 페 트리 접시에 무릎 모자 집게, 단단히 잡고 하 고 주사기의 팁과 무릎을 매쉬. epiphyses 빨간색 이상 될 때까지 계속 합니다.
8. 주사기를 사용 하 여 전송 셀에서 두 번째 및 세 번째 페 트리 접시 50 mL 튜브. 부드럽게 위아래로 pipetting으로 덩어리를 해체. 거품을 생성 하지 마세요. 10 분 동안 250 x g 4 ° c에서 원심 분리기.
9. 붉은 혈액 세포를 lyse
   1. 혈 청 학적인 피 펫과 상쾌한을 제거 하 고, 터치 하 여 펠 릿을 꺼내 실 온에서 1 분에 대 한 ACK (염화 염화 칼륨) 세포의 용 해 버퍼의 1 mL에 배양 하 여 붉은 혈액 세포를 lyse.
   2. 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, HBSS (행 크 스 균형 소금 솔루션) 버퍼의 40 mL를 추가 합니다.
10. 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 필터링 셀 비록 70 µ m 셀 거르는 새로운 50 mL 원뿔 관으로. 10 분 동안 250 x g 4 ° c에서 원심 분리기.
11. 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 완전 한 미디어의 40 mL로 세척 하 고 표면에 뜨는 셀을 제거 합니다. 10 분 동안 250 x g 4 ° c에서 원심 분리기.
    참고:이 단계에서 계보 긍정적인 세포 FACS 또는 자기 열 정화에 의해 제거할 수 있습니다. 그러나, 림프 톨 문화에 긴 기간을 유지 하지 됩니다. 거의 모든 결 석 하는 혈통 긍정적인 세포의 많은 수는 Ly6C-CD115-인구 비보 전골 수에에서 존재, 하루 5 (그림 2).
12. 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 상쾌한, 제거 하 고 골 셀 1 x 10⁶ 셀/mL의 조밀도에 재조합 마우스 GM-CSF의 10 ng/mL와 함께 완전 한 미디어 문화.
    참고: 일반적으로, 4 x 10⁷ 총 세포 수 수 수확 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 후. 그러나, 기대 2 x 10⁷ 조금 초보자를 위한 최대 5 x 10⁷ 셀 경험된 수확기에 대 한.
13. 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 세포 조직 문화 접시에 전송 하 고 37 ° c 5% CO₂에서 품 어. 각 씨앗 24-잘 접시를 사용 하 여 경우 세포 현 탁 액 2 mL와 잘.
14. 모든 48 h 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 미디어의 절반을 제거 하 고 신선한 완전 한 미디어와 GM-CSF 대체.
    참고: 문화 수 유지 9 일. 그러나, 구성 시간이 지남에 변경 됩니다. 자세한 내용은 섹션 3을 참조 하십시오.

3. 선택 정렬의 하루

1. 시간이 지남에 셀 인구 구성 변화로 원하는 셀의 가장 높은 번호를 생성 하는 일을 선택 합니다.
2. 1 x 10⁷ 셀 당 GM-CSF에 문화의 3, 5, 및 7 일 후 각 인구의 예상된 셀 항복 게시물 정렬 표 1을 참조 하십시오.

4. 얼룩이 전략

1. 셀의 작은 aliquots를 사용 하 여 제어 샘플을 준비 하. 흠 없는 컨트롤, 보상 제어 샘플 하나만 형광 항 체 각, 물 포함 고 형광-마이너스-1 제어 하나, 일반적인 형광 해당 채널에 대 한 제어를 제외 하 고는 모든 항 체에 추가 합니다. 기본, 보조, 포함 간접적인 라벨을 사용 하 고 모두 기본 및 보조.
   참고: Phycoerythrin (PE) 및 allophycocyanin (APC) 태그 항 체 제공 최소한의 출혈과 뚜렷한 분리에 함께 사용 될 때. 그러나, 형광 색소 옵션이 제한 됩니다, 경우 CD115는 표현 상대적으로 낮은 수준에서 Ly6C은 매우 높은 수준에서 표현 하는 동안. 따라서, 밝은 형광은 필요한 안티-CD115, 그리고 안티-Ly6C 형광 이상의 출혈을 방지 하기 위해 선택 됩니다.
2. 3 mL 50 mL 원뿔 튜브, 혈 청 태아 종 아리와 함께 냉장된 Dulbecco의 버퍼링 하는 인산 염 (DPBS)의 97 mL를 혼합 하 여 100 mL FACS 워시 버퍼 (FWB)의 준비 하 고 얼음 목욕에.
3. 한 피 펫을 사용 하 여 부드럽게, 그러나 철저 하 게, 플라스틱 셀 아래로 느슨하게 부착 셀을 꺼내 려.
4. 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 50 mL 원뿔 튜브에 세포를 전송 합니다. 10 분 동안 250 x g 4 ° c에서 원심 분리기.
   1. 셀 볼륨 50 mL를 초과 하는 경우 튜브의 필요한 수를 셀을 전송 하 고 착 단계에서 결합.
5. 부드럽게 부는 상쾌한 어 하 고 혈 청 학적인 피 펫으로 FWB의 30 mL를 추가 하 여 수송과 세포를 씻어. 10 분, 4 ° C에서 250 x g 에서 centrifuge 고 세척을 반복 합니다.
   참고: 높은 세포 죽음을 예상 하는 경우 셀 세척 될 수 있다와 FWB와 낮은 0.5% 태아 종 아리 혈 청 (FCS). 이 세포 응집 되지 것입니다.
6. 일시 중지 하 고 항 체 제조 업체의 지시 당 세포 얼룩.
   1. 5 x 10⁷ 셀 FWB의 1 mL를 일시 중단 하 고 2 µ g 각 안티-Ly6C 및 안티-CD115 (의 연구자의 선택) fluorophores 표시를 추가 합니다. 더 CMP 구별 moDC (둘 다은 Ly6C-CD115-), 추가 안티-CD11c 항 체의 2 µ g (CMP는 CD11c^-; moDC는 CD11c⁺). 얼음에 30 분 동안 품 어.
      참고: 그림 3 Ly6C-PE와 CD115 APC를 사용 하 여 생성 되었습니다.
7. 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 10 분 동안 4 ° C에서 250 x g 에서 FWB, 그리고 원심 분리기의 10 mL를 추가 합니다.
8. 부드럽게 부는 상쾌한 어 하 고 혈 청 학적인 피 펫으로 FWB의 30 mL를 추가 하 여 수송과 세포를 씻어. 10 분, 4 ° C에서 250 x g 에서 centrifuge 고 세척을 반복 합니다.
9. 셀을 중단 하기 전에 철저 하 게 펠 릿을 꺼내 려 튜브를 터치 합니다. 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 1 x 10⁷ 셀/mL FWB의 세포를 중단 하 고 35 µ m 셀 필터를 통해 필터링. 폴 리 프로필 렌 튜브에 필터링 된 셀 전송 정렬 준비가 될 때까지 얼음에 배치 하는 혈 청 학적인 피 펫을 사용 합니다.
   참고: 지금까지 폴 리 프로필 렌, 사용할 수 없는 경우에 단백질 코팅 (무 지방 건조 우유 또는 FCS) 폴리스 티 렌 튜브 바인딩을 줄이기 위해 사용할 수 있습니다.

5. 설정 제어 샘플에 따라 게이츠

참고: 고속 흐름 스트림의 압력 때문에 세포 파쇄를 방지 하려면 셀 정렬에 대 한 100-130 µ m 노즐을 사용 합니다.

1. 흠 없는 컨트롤 실행 (단계 4.1 참조) 셀 정렬 통해 작은 파편 (낮은 앞으로 분산형;를 제외 하려면 게이트를 적용 하 고 FSC) 및 매우 세분화 된 (높은 쪽 분산형; SSC) 입자입니다.
   1. 분석에 후기 (monocytes, moMac/MoDP, 및 MoDC), 더 큰 셀 (높은 FSC)만 포함 하도록 게이팅 적용 됩니다.
   2. 생존 얼룩 사용 중인 경우 사용 하 여 이러한 스테인드, 비-가능한 이벤트 (예를 들어 그림 1에 설명 된다)를 제외 하.
2. 셀 정렬 통해 단일 형광 제어 샘플을 실행 하 고 필요에 따라 보상을 조정 합니다.
3. 다중 표시 된 샘플의 샘플을 실행 합니다. 4 개의 명료한 인구를 관찰: Ly6C + CD115-(GMPs) Ly6C + CD115 + (monocytes), Ly6C-CD115 + (moMacs/moDP), 및 Ly6C-CD115-(CMPs/moDCs). 각 4 개의 주요 인구를 분리 하는 게이트를 적용 합니다.
   참고: CMPs와 moDC Ly6C-CD115-표현 형을 공유합니다. 그러나, 그들은 분화 될 수 있다 CD11c 식에 따라: CMP 부족 CD11c, MoDCs 익스프레스 CD11c 반면.

6입니다. 고립 된 인구의 수집

1. 적어도 20%를 달성 하기 위해 충분 한 FCS를 추가 하 여 컬렉션 튜브를 준비 최종 농도 전체. 예를 들어 5 mL 튜브를 사용 하는 경우 정렬, 전에 FCS의 1 mL을 추가 하 고 5 mL 전체 볼륨에 도달할 때 튜브를 제거.
2. 막 회전율과 항 체 이해를 방지 하기 위해, 일종에 걸쳐 4 ° C에서 모든 샘플 (혼합 및 정렬)을 유지 합니다.
   1. 만약 이것이 가능 하지, 유지 가능한 얼음에 정렬 하 고 필요에 따라 정렬에 aliquots를 전송 하는 셀을 포함 하는 관.
   2. 또한, 모든 20-30 분 얼음 정렬된 샘플 전송.
3. 원하는 셀 수를 수집한 후에 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 새로운 원뿔 튜브에 세포를 전송. 10 분 동안 250 x g 4 ° c에서 원심 분리기.
   1. 각 수집 된 인구에서 작은 aliquots에 정렬 후 분석 순도 확인 합니다.
4. 제거는 상쾌한, FWB 및 두 세척의 총 10 분 반복에 대 한 250 x g 4 ° c에서 원심 분리기의 10 mL에 일시 중지.
   참고: 그것은 펠 릿을 dislodging 없이 모든 상쾌한을 제거 하려면 어려울 수 있습니다. 피 펫 팁 진공 라인을 연결 제거 도울 수 있습니다. 사용할 수 없는 경우는 상쾌한 펠 릿 분리의 경우 신선한 튜브에 수집 될이 좋습니다.
5. 두 번째 세척 후에 상쾌한을 제거 합니다.
6. 경우 사용자의 실험 디자인 셀 다시 경작 될 지시, 단계 2.12-2.14. 그렇지 않으면, 셀 즉각적인 분석을 위해 사용 될 경우 원하는 프로토콜에 따라 셀을 준비 합니다.
   참고: 일반적인 기능 분석의 예는 그림 4에 포함 됩니다.

결과

가능 하 고, 실행 가능한 세포로 분석을 위해 사용할 수 있는 많은 채널을 유지 하기 위해에서 매우 작고 매우 세부적인 이벤트 (일반 게이트 모든 적용 됩니다 도트 그림 1A에플롯)를 제외 하 고 측면 분산형에 따라 선택 일상적으로 했다. 이 제어 전략은 안정적으로 죽은 세포를 제외 하는 경우를 확인 하려면 우리는 7-아미노 악티노마이신 d (7-AAD) (그림 1B) 스테인드. 7AAD는 DNA 죽음과 죽어가는 세포 막 침투성 때문에 얼룩 그리고 가능한 세포에 의해 제외 됩니다. GM-CSF 배양된 골 수 세포 수확 후 (PH)와 1, 3, 그리고 5 박사 셀 분석 PH 즉시 즉시 분석의 일반 FSC/SSC 게이트 뼈에서 갓 격리 된 셀에 적용 된 7 AAD 긍정적인 세포의 약 10%를 했다 수 (그림 1, 수...

토론

이 프로토콜 GM-CSF 구동 시 조 및 전조 세포 유형 분석 생 화 확 적인 분석 실험, 세포 기능 시험관또는 주입 비보의 분석 실험 등의 여러 종류에 대 한 충분 한 숫자의 분리를 촉진 한다. 이 메서드는 신뢰할 수 있는 격리 및 식별이이 통로 그 차별화 된 셀 형식으로 개발의 초기에 셀의 더 일반적으로 사용 하는 monocyte 파생 된 모 수석 세포 개발의 분야에서 상당한 사전을 나타냅니다. 이전 연구에 격리.

창시자 및 생체 외에서 골 수에서 생성 하는 선구자의 격리에 대 한 이전 프로토콜 골수성 세포 ^{18의 마커로 CD31와 Ly6C 얼룩 또는 증식 조상 세포 17 식별 CFSE 얼룩에 의존} . CFSE Naik에 의해 설명 하는 프로토콜을 얼룩이 지는 Flt3L 기반 DC 창시자와 선구자 ¹⁷...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
RPMI 1640	Corning	15-040-CV
태아 송아지 혈청(FCS)	HyClone	SV30014.04	완전 배지를 보충하고 FWB
GlutaMAX	Gibco	35050	완전 배지
2-메르캅토에탄올(2-ME)	MP 생물의학	190242	보충하여 완전한 배지
75mM 진공 필터를	Thermo Scientific	156-4045	완전한 매체를 살균하기 위해
ACK 용해 버퍼	Lonza	10-548E	적혈구
HBSS 버퍼	Corning	21-020-CM	적혈구 용해 후 백혈구 구
산염 완충 식염수 (PBS), Dulbecco의	Lonza	17-512F	는 내독소가 없어야합니다. 4 °에서 냉각; C
35 & 마이크로; m 세포 필터	Falcon	352235	세포 분석기를 통과하기 전에 덩어리를 분해합니다.
GM-CSF	Biosource	PMC2011	10ng/mL의 사용 가능한 농도
후 골수 세포용	조직 배양 처리 플레이트	VWR	10062-896
Anti-Ly6C, 클론 HK1.4	Biolegend	128018
Anti-CD115, 클론 AFS98	Tonbo Bioscience	20-1152-U100
Anti-CD11c, 클론 HL3	BD Biosciences	557400	CMP와 MoDC를 구별하기 위해
MoFlo XPD 유세포 분석기	Beckman Coulter	ML99030
BD Accuri C6	BD Biosciences	660517
100% 에탄올	Pharmco-Aaper	111000200CSPP
60 mm 페트리 디쉬	Corning, Inc	353002
50 mL 원추형 튜브	VWR	21008-242
C57BL/6 마우스	잭슨 연구소	000664	여성; 10-20주 된
Biosafety Hood	Thermo Scientific	8354-30-0011
10 mL 주사기	BD Biosciences	301604
23 G 바늘	BD Biosciences	305145
원심분리기 5810  R	eppendorf	22625501
FlowJo Software v10	BD Biosciences	Version 10	flowjo.com