여기 우리는 식별 하 고 격리 GM-CSF 골수성 세포 고속 셀 정렬 사용 하 여 구동의 다 수에 대 한 메서드를 제공 합니다. Ly6C 및 CD115 식에 따라 5 가지 인구 (일반적인 골수성 창시자, granulocyte/macrophage 창시자, monocytes, monocyte 파생 된 대 식 세포 및 monocyte 파생 된 DCs)를 확인할 수 있습니다.
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방법 논문
골수성 창시자 및 정렬 전략 소설 셀을 사용 하 여 Murine 골에서 수지상 세포 선구자의 큰 숫자의 생성
이 논문에서
요약
초록
문화 monocyte 파생 된 모 수석 세포 (moDC) Granulocyte-대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF)를 사용 하 여 마우스 골 수에서 생성 된의 최근 이전 감사 보다 더 이질적인 것 인정 되었습니다. 이러한 문화는 정기적으로 뿐만 monocyte 파생 된 moDC 대 식 세포 (moMac), 및 monocytes 등도 일부 덜 개발 된 셀 포함. 이 프로토콜의 목표는 일관 된 방법을 제공 식별 및 분리는 많은 종류의 세포가이 문화에 대 한 개발로 서 그들은, 특정 기능 추가 조사 될 수 있도록. 여기에 제시 된 정렬 전략 4 인구 둘 다는 표현 정도 세포에 의해 그들은 GM-CSF 중심 문화에서 개발 Ly6C 및 CD115의 식을 기반으로 먼저 세포를 분리 합니다. 이 4 개의 인구는 일반적인 골수성 창시자 또는 CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage 창시자 또는 GMP (Ly6C +, CD115-), monocytes (Ly6C +, CD115 +), 및 monocyte 파생 된 세포 또는 moMac (Ly6C-, CD115 +)를 포함합니다. CD11c는 Ly6C-, CD115-인구 내에서 두 개의 인구를 구분 하는 정렬 전략에도 추가 됩니다: CMP (CD11c-) 및 moDC (CD11c +). 마지막으로, 두 개의 인구는 Ly6C-, CD115 + 인구 MHC 클래스 II 식의 수준에 따라 내 더 구별 될 수 있습니다. MoMacs 익스프레스 MHC 종류 II, 더 낮은 수준의 높은 MHC 종류 II를 표현 하는 monocyte 파생 된 DC 전조 (moDP) 하는 동안. 이 메서드는 여러 발달 고유 인구 숫자의 신뢰할 수 있는 격리에 대 한 다양 한 기능과 발달 분석에 대 한 충분 한 있습니다. 우리는 하나 같은 기능 판독, 이러한 종류의 세포 차동 응답 Pathogen-Associated 분자 패턴 (PAMPs) 자극을 강조.
서론
Murine 골 수 세포는 사이토카인의 경작 Granulocyte-대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF)은 널리 이용 방법으로 큰 숫자 1, monocyte 파생 된 모 수석 세포 (moDC;로 알려진 염증 DC)를 생성 하 2,3,,45. 이 세포의 수지상 세포 (DC) 함수 6,,78의 학문의 다양 한에서 매우 유용 되었습니다. 일반적으로, 이러한 murine 골 수 세포 교양 6-8 일 이며 수지상 세포 기능 5의 연구를 위해 사용 됩니다. 이러한 문화 오래 되어 고려 했다 주로 균질 성, 차별화 된 moDC의 대부분의 구성 된. 최근에, 그것은 분명이 6-8 일 문화 기간의 끝에, 차별화 된 monocyte 파생 된 세포 (moMacs) 9
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프로토콜
모든 동물 작업 치료와 국립 보건원의 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에 설명 된 권장 사항에 따라 어 번 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다.
1입니다. 골 수 컬렉션에 대 한 준비
- 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 1640 매체 10% 태아 종 아리 혈 청, 2mm 글루타민과 0.22 μ m 진공 필터 플라스 크 단위의 상단에 50 µ M 2-mercaptoethanol 보충의 솔루션을 추가 하 여 250 mL 완전 한 미디어를 준비 하 고 진공을 적용.
참고: 완전 한 매체 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 최대 2 개월까지. - 150 mL 살 균 H2O 500 mL 플라스 크에 100% 에탄올의 350 mL를 혼합 하 여 70% 에탄올 솔루션을 준비 합니다.
- 4 ° c 설정된 원심 분리기
- 포 셉, 메스, 및 70% 에탄올에가 위를 소독.
- 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 세 60 mm 페 트리 접시에 완전 한 미디어의 5 mL를 추가 합니다.
- 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 50 mL 원뿔 튜브를 완전 한 미디어의 30 mL를 추가 합니다.
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결과
가능 하 고, 실행 가능한 세포로 분석을 위해 사용할 수 있는 많은 채널을 유지 하기 위해에서 매우 작고 매우 세부적인 이벤트 (일반 게이트 모든 적용 됩니다 도트 그림 1A에플롯)를 제외 하 고 측면 분산형에 따라 선택 일상적으로 했다. 이 제어 전략은 안정적으로 죽은 세포를 제외 하는 경우를 확인 하려면 우리는 7-아미노 악티노마이신 d (7-AAD) (그림 1B) 스테인드. 7AAD는 DNA 죽음과 죽어가는 세포 막 침투성 때문에 얼룩 그리고 가능한 세포에 의해 제외 됩니다. GM-CSF 배양된 골 수 세포 수확 후 (PH)와 1, 3, 그리고 5 박사 셀 분석 PH 즉시 즉시 분석의 일반 FSC/SSC 게이트 뼈에서 갓 격리 된 셀에 적용 된 7 AAD 긍정적인 세포의 약 10%를 했다 수 (그림 1, 수.......
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토론
이 프로토콜 GM-CSF 구동 시 조 및 전조 세포 유형 분석 생 화 확 적인 분석 실험, 세포 기능 시험관또는 주입 비보의 분석 실험 등의 여러 종류에 대 한 충분 한 숫자의 분리를 촉진 한다. 이 메서드는 신뢰할 수 있는 격리 및 식별이이 통로 그 차별화 된 셀 형식으로 개발의 초기에 셀의 더 일반적으로 사용 하는 monocyte 파생 된 모 수석 세포 개발의 분야에서 상당한 사전을 나타냅니다. 이전 연구에 격리.
창시자 및 생체 외에서 골 수에서 생성 하는 선구자의 격리에 대 한 이전 프로토콜 골수성 세포 18의 마커로 CD31와 Ly6C 얼룩 또는 증식 조상 세포 17 식별 CFSE 얼룩에 의존 . CFSE Naik에 의해 설명 하는 프로토콜을 얼룩이 지는 Flt3L 기반 DC 창시자와 선구자 17.......
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공개 사항
저자는 공개 충돌이 있다.
감사의 글
우리는 앨리슨 교회 새에 어 번 대학교 학교의 수의학 흐름 Cytometry 시설, 오 번 대학에서 분자 생물학 프로그램 및 휴대 하는 NIH에서 EHS R15 R15 AI107773 하 고 자금에 대 한 기술 지원에 대 한 감사 여름 연구 자금 PBR을에 대 한.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| 태아 송아지 혈청(FCS) | HyClone | SV30014.04 | 완전 배지를 보충하고 FWB |
| GlutaMAX | Gibco | 35050 | 완전 배지 |
| 2-메르캅토에탄올(2-ME) | MP 생물의학 | 190242 | 보충하여 완전한 배지 |
| 75mM 진공 필터를 | Thermo Scientific | 156-4045 | 완전한 매체를 살균하기 위해 |
| ACK 용해 버퍼 | Lonza | 10-548E | 적혈구 |
| HBSS 버퍼 | Corning | 21-020-CM | 적혈구 용해 후 백혈구 구 |
| 산염 완충 식염수 (PBS), Dulbecco의 | Lonza | 17-512F | 는 내독소가 없어야합니다. 4 °에서 냉각; C |
| 35 & 마이크로; m 세포 필터 | Falcon | 352235 | 세포 분석기를 통과하기 전에 덩어리를 분해합니다. |
| GM-CSF | Biosource | PMC2011 | 10ng/mL의 사용 가능한 농도 |
| 후 골수 세포용 | 조직 배양 처리 플레이트 | VWR | 10062-896 |
| Anti-Ly6C, 클론 HK1.4 | Biolegend | 128018 | |
| Anti-CD115, 클론 AFS98 | Tonbo Bioscience | 20-1152-U100 | |
| Anti-CD11c, 클론 HL3 | BD Biosciences | 557400 | CMP와 MoDC를 구별하기 위해 |
| MoFlo XPD 유세포 분석기 | Beckman Coulter | ML99030 | |
| BD Accuri C6 | BD Biosciences | 660517 | |
| 100% 에탄올 | Pharmco-Aaper | 111000200CSPP | |
| 60 mm 페트리 디쉬 | Corning, Inc | 353002 | |
| 50 mL 원추형 튜브 | VWR | 21008-242 | |
| C57BL/6 마우스 | 잭슨 연구소 | 000664 | 여성; 10-20주 된 |
| Biosafety Hood | Thermo Scientific | 8354-30-0011 | |
| 10 mL 주사기 | BD Biosciences | 301604 | |
| 23 G 바늘 | BD Biosciences | 305145 | |
| 원심분리기 5810 R | eppendorf | 22625501 | |
| FlowJo Software v10 | BD Biosciences | Version 10 | flowjo.com |
참고문헌
- Zhan, Y., Xu, Y., Lew, A. M. The regulation of the development and function of dendritic cell subsets by GM-CSF: more than a hematopoietic growth factor. Mol Immunol. 52, 30-37 (2012).
- Zhan, Y., et al.
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재인쇄 및 허가
