이 프로토콜 설명 줄기 세포 생체 외에서 전기 자극 및 줄기 세포 시드 비 계를 사용 하 여 후속 vivo에서 이식에 대 한 비 전도성 고분자 계에서의 시드 수 있도록 셀 문화 시스템의 제조를 최소 침 습 기법입니다.
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이 논문에서
요약
초록
줄기 세포 치료 치료, 흥미 진 진한 선으로 등장은 하지만 최적의 전달 방법 불분명 남아. 뇌졸중 모델에서 줄기 세포를 전달 하기 위해 수십 년 동안 microinjection의 기술을 사용 하는 동안이 기술은 주입 전에 줄기 세포를 조작 하는 능력의 부족에 의해 제한 됩니다. 이 문서는 전기 전도성 폴리머 비를 사용 하 여 줄기 세포 배달에 대 한 하는 방법을 자세히 설명 합니다. 전도성 고분자 비 계를 사용 하 여 줄기 세포의 전기 자극 세포 생존, 염증 반응, 및 시 냅 스 리 모델링에 관련 된 줄기 세포의 유전자를 변경 합니다. 전기 거치기 후 발판에 줄기 세포는 원심 중간 대뇌 동맥 폐색 쥐 모델에서 intracranially 이식 수 있습니다. 이 프로토콜 전도성 고분자 비 계를 통해 줄기 세포를 조작 하는 강력한 기법을 설명 하 고 추가 줄기 세포 기반 치료를 개발 하는 새로운 도구를 만듭니다.
서론
스트로크는 세계에서 사망의 두 번째 주요 원인이 이며 미국에서 죽음의 다섯 번째 주요 원인. 이러한 높은 사망률에도 불구 하 고 뇌졸중 복구에 대 한 치료는 현재 가능한 의료 옵션 현재 사용할 수 있는1와 도전 남아 있습니다. 현재 다루고 있는 유일한 40 줄기 세포를 활용 하는 허 혈 성 뇌졸중의 임상 시험 300 개에 대 한 있다. 이전 연구 결과 줄기 세포 치료 선 수리2,3에 유익한 영향을 미칠 것으로 나타났습니다. 두뇌 파생 된 neurotrophic 요인 (BDNF) 등 thrombospondin-1 (THBS-1) 이식된 인간의 신경 조상 세포 (hNPCs)에서 발표 Paracrine 요인의 증가와 관련 된 메커니즘을 통해 향상 된 기능 복구를 나타났습니다. 시 냅 스 형성, angiogenesis, 수지상 분기 및 새로운 axonal 계획 뿐 아니라 면역 시스템4,,56변조. 그러나, 줄기 세포의 최적의 전송 방법 애매 남아 있습니다.
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프로토콜
모든 줄기 세포 및 동물 절차 및 실험실 동물 관리 (SCRO 616 및 APLAC 31909)에 스탠포드 대학의 행정 패널에 의해 스탠포드의 줄기 세포 연구 감독 위원회에 의해 승인 되었다.
1입니다. 이토 유리 에칭
- 인듐 주석 산화물 (ITO) 준비-유리의 전도성 저쪽 마스킹 에이전트를 배치 하 여 커버 유리 슬라이드.
참고: 대부분의 상용 투명 테이프는 마스킹 요원으로 사용할 수 있습니다.- 블레이드를 사용 하 여 초과 마스크를 제거, 최종 이토 디자인만 원하는 모양 떠나는 유리에.
- 질소 산의 5% (v/v) 및 에칭 솔루션을 준비 하는 증기 두건 안쪽 유리 비 커에 HCl의 45% (v/v) 결합 한다.
- 핫 플레이트와 온도계를 사용 하 여 솔루션을 에칭의 온도 70 ° c.에 유지 되도록
- 에칭 솔루션에는 70 ° C에 도달 하면, 2 분 초과 이토 레이어를 제거를 위한 솔루션으로 마스크-이토 유리 슬라이드를 놓습니다.
참고: 테이프 마스킹 산 성 솔루션에 노출에서 이토 레이어를 보호합니다. - 솔루션에서 슬라이드를 제거 하 고 이온된 (DI) H2o.로 그것을 씻어합....
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결과
그림 1 에 표시 된 회로도 hNPCs 및 잠재적인 다운스트림 응용 프로그램의 전기 자극의 전체 워크플로 나타냅니다. 줄기 세포 치료에서 현재 한계 줄기 세포 염증, 허 혈 성 조건 등 거친 후 이식 환경에 노출 되는 것 이다.입니다. 이러한 어려운 조건을 가능성이 그들의 치료 효능14,15제한합니다. 이 환경에서 hNPCs를 보호 하기 위해 전도성 비 계를 사용 하 여 전기 늘어진 통해 hNPCs 치료 혜택을 증가 수 있습니다. 이 줄기 세포 전달 기술에서는 첫 번째 단계는 전기 접근2,16를 사용 하 여 전도성 비 계의 개발 이다. 우리 건설 기계 생체 적합성을 특징 하 고 hNPCs와 전기 늘어진 특성에 .......
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토론
증거를 성장 소설 뇌졸중 치료로 줄기 세포의 약속을 입증 했다. 이 약속은 적어도 40 진행 중이거나 완료 된 임상 시험을 머리 맡에 줄기 세포 치료제를 사전 중요 한 노력에 결과 있다. 선 병 급성 모욕 후 과정이 없다 신경 복구를 방지 하기 때문에 줄기 세포 치료 라는 독특한 신경 장애를 제공 합니다. 줄기 세포 강화 된 뇌졸중 복구의 정확한 기계 장치는 불분명 남아 있습니다. 신생, synaptogenesis, 및 시 냅 스 리 모델링 모두 중요 한 것을 보여줘 왔다. BDNF 등 THBS-1 시 냅 스 형성에 대 한 중요 한 분자는 제거 하는 경우 뇌졸중 복구 장애인된6,19입니다. hNPCs 수많은 동물 모델20,21에서 뇌졸중 후 기능적 복구를 개선 했습니다. 메커니즘은 hNPCs의 효과가 남아 완전히 이해 하.......
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공개 사항
저자는이 작품을 선언 하 전혀 충돌의 관심이 없다.
감사의 글
QRT-PCR 기계의 사용에 감사 박사 Kati Andreasson (부의 신경과 및 신경 과학, 스탠포드 대학) 하 고. 일은 스탠포드 학부의 학장의 박사 친목 (사운드) 국립 연구소의 건강 보조금 K08NS098876 (P.M.G.)을 지원 했다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| FGF-Basic | Invitrogen | CTP0261 | 작업 매체용 20ng/mL |
| Matrigel | Corning | cb40234a | 1:200 희석 |
| LIF 단백질, Recom. Hum. (10 µ g/mL) | EMD Millipore | LIF1010 | 10ng/mL 작업 매체용 |
| Sylgard 184 실리콘 3.9kg | Fisherbrand | NC0162601 | |
| 염산 | Fisherbrand | SA56-4 | |
| 질산 농축액(인증) ACS, Fisher Chemical | Fisherbrand | SA95 | |
| ITO Glass | Delta Technologies | CG-40IN-0115 | |
| 나트륨 도데실벤젠설포네이 | Sigma | 289957-1KG | |
| Pyrrole | Sigma | 131709-500ML | 빛과 실온으로부터 pyrrole 용액을 보호하십시오 |
| 8 웰 유리 슬라이드 챔버 | Thermo Sci Nuc | 125658 | 세포실을 분리하고 멸균된 상태로 보관하십시오 |
| . 평면 브래킷, 3"x1" | McMaster-Carr | 1030A4 | |
| TWO PART SILVER PAINT 14G | 전자 현미경 과학 | 1264214 | 에 두 부분(1:1)을 Ca |
| 와 Mg, 페놀 레드 | 제네시스 없음 | 25-508C | |
| AB2 ArunA 신경 세포 배양 미디어 키트 | Aruna Biomedical | ABNS7013.2 | |
| hNP1 인간 신경 전구체 확장 키트 | Aruna Biomedical | hNP7013.1 | |
| 비접촉 플로우 조절 밸브, 니켈 도금 황동, 3/32"에서 5/8" 튜브 OD | McMaster-Carr | 5330K22 | |
| 멀티미터 | Keysight | E3641A | |
| 웨이브폼 발생기 | Keysight | 33210A-10MHz | |
| Pt 메시 | Sigma-Aldrich | 298107-425MG | 참조 전극, 치수, 1x1 cm |
| LIVE/DEAD 생존력/세포 독성 키트, 포유류 세포용 | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
| BDNF | 써모 피셔 사이언티픽 | ||
| Hs02718934_s1 바트1 | 써모 피셔 사이언티픽 | ||
| Hs00962908_m1 GAPDH | 써모 피셔 사이언티픽 | ||
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| Thermo Scientific Shandon 스테인리스 스틸 메스 블레이드 핸들, 20-25번 블레이드 보유 | Fisherbrand | 53-34 | |
| Walter Stern 메스 블레이드 시리즈 300 | Fisherbrand | 17-654-456 | |
| QuantStudio 6 Flex 실시간 PCR 시스템 | Thermo Fisher Scientific | 4484642 | |
| Frazier Micro Dissecting | Hook Harvard Apparatus | 52-2706 |
참고문헌
- Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The Science of Stroke: Mechanisms in Search of Treatments. Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).
- George, P. M., et al. Electrical Preconditioning of Stem Cells with a Conductive Polymer Scaffold Enhances Stroke Recovery....
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