이 프로토콜 설명 줄기 세포 생체 외에서 전기 자극 및 줄기 세포 시드 비 계를 사용 하 여 후속 vivo에서 이식에 대 한 비 전도성 고분자 계에서의 시드 수 있도록 셀 문화 시스템의 제조를 최소 침 습 기법입니다.
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이 논문에서
요약
초록
줄기 세포 치료 치료, 흥미 진 진한 선으로 등장은 하지만 최적의 전달 방법 불분명 남아. 뇌졸중 모델에서 줄기 세포를 전달 하기 위해 수십 년 동안 microinjection의 기술을 사용 하는 동안이 기술은 주입 전에 줄기 세포를 조작 하는 능력의 부족에 의해 제한 됩니다. 이 문서는 전기 전도성 폴리머 비를 사용 하 여 줄기 세포 배달에 대 한 하는 방법을 자세히 설명 합니다. 전도성 고분자 비 계를 사용 하 여 줄기 세포의 전기 자극 세포 생존, 염증 반응, 및 시 냅 스 리 모델링에 관련 된 줄기 세포의 유전자를 변경 합니다. 전기 거치기 후 발판에 줄기 세포는 원심 중간 대뇌 동맥 폐색 쥐 모델에서 intracranially 이식 수 있습니다. 이 프로토콜 전도성 고분자 비 계를 통해 줄기 세포를 조작 하는 강력한 기법을 설명 하 고 추가 줄기 세포 기반 치료를 개발 하는 새로운 도구를 만듭니다.
서론
스트로크는 세계에서 사망의 두 번째 주요 원인이 이며 미국에서 죽음의 다섯 번째 주요 원인. 이러한 높은 사망률에도 불구 하 고 뇌졸중 복구에 대 한 치료는 현재 가능한 의료 옵션 현재 사용할 수 있는1와 도전 남아 있습니다. 현재 다루고 있는 유일한 40 줄기 세포를 활용 하는 허 혈 성 뇌졸중의 임상 시험 300 개에 대 한 있다. 이전 연구 결과 줄기 세포 치료 선 수리2,3에 유익한 영향을 미칠 것으로 나타났습니다. 두뇌 파생 된 neurotrophic 요인 (BDNF) 등 thrombospondin-1 (THBS-1) 이식된 인간의 신경 조상 세포 (hNPCs)에서 발표 Paracrine 요인의 증가와 관련 된 메커니즘을 통해 향상 된 기능 복구를 나타났습니다. 시 냅 스 형성, angiogenesis, 수지상 분기 및 새로운 axonal 계획 뿐 아니라 면역 시스템4,,56변조. 그러나, 줄기 세포의 최적의 전송 방법 애매 남아 있습니다.
뇌에 성공적인 줄기 세포 배달 도전 남아 있습니다. 현재, 주사 가능한 히드로 및 고분자 스 캐 폴딩 시스템 줄기 세포 제공 도입 되었습니다. 이러한 전달 방법 이식 시 줄기 세포를 보호 뿐만 아니라 호스트의 염증 반응과 hypoxic 조건7,,89 를 포함 하 여 가혹한 포스트 치기 환경에서 보호를 제공 , 그러나 10., 가장 일반적으로 사용 되는 재료는 불활성,11셀 연속 변조 (즉, 전기 자극)의 사용을 제한 하. 전기 자극 차별화, 이온 채널 밀도, 그리고 줄기 세포12neurite 결과 영향을 미치는 큐입니다. 불활성 고분자에 비해 전도성 고분자는 전기 자극 및 줄기 세포2의 조작에 대 한 현재 수 있도록 수행할 수 있습니다. 그러나,는 전기 자극 neurotrophic 요인 릴리스 (즉, BDNF와 THBS-1)를 변조 하는 정확한 메커니즘은 아직 완전히 탐험.
이 프로토콜에서 우리는 전도성 고분자 비 계, polypyrrole (PPy), 체 외에 전기 자극에 대 한 수 있도록 구성 된 셀 문화 시스템을 구성 하는 단계를 설명 합니다. 셀 문화 체계를 조작 하는 방식으로 인해 줄기 세포 시드 비 계 요정 경색 피 질에의 후속 주입이 가능 하다. 이 시스템에 대 한 우리 전기 전제 발판에 줄기 세포 이식 전에 짧은 시간 동안. 전기 자극에 따라 셀을 들고 전도성 고분자 발판 성공적으로 intracranially 최소 침 습 방법을 사용 하 여 이식 합니다.
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프로토콜
모든 줄기 세포 및 동물 절차 및 실험실 동물 관리 (SCRO 616 및 APLAC 31909)에 스탠포드 대학의 행정 패널에 의해 스탠포드의 줄기 세포 연구 감독 위원회에 의해 승인 되었다.
1입니다. 이토 유리 에칭
- 인듐 주석 산화물 (ITO) 준비-유리의 전도성 저쪽 마스킹 에이전트를 배치 하 여 커버 유리 슬라이드.
참고: 대부분의 상용 투명 테이프는 마스킹 요원으로 사용할 수 있습니다.- 블레이드를 사용 하 여 초과 마스크를 제거, 최종 이토 디자인만 원하는 모양 떠나는 유리에.
- 질소 산의 5% (v/v) 및 에칭 솔루션을 준비 하는 증기 두건 안쪽 유리 비 커에 HCl의 45% (v/v) 결합 한다.
- 핫 플레이트와 온도계를 사용 하 여 솔루션을 에칭의 온도 70 ° c.에 유지 되도록
- 에칭 솔루션에는 70 ° C에 도달 하면, 2 분 초과 이토 레이어를 제거를 위한 솔루션으로 마스크-이토 유리 슬라이드를 놓습니다.
참고: 테이프 마스킹 산 성 솔루션에 노출에서 이토 레이어를 보호합니다. - 솔루션에서 슬라이드를 제거 하 고 이온된 (DI) H2o.로 그것을 씻어합니다
- 조심 스럽게 제거 나머지 이토 그대로 되도록 멀티 미터를 사용 하 여 마스크와 측정 저항. 원하는 에칭된 면의 해독 약 0 Ω 이어야 한다.
2입니다. Pyrrole 솔루션의 준비
- 1000 mL 유리병에 디 H2o.의 600 mL에 70 g 나트륨 dodecylbenzenesulfonate (NaDBS)의 해산
- 일단는 NaDBS 해산 솔루션에 0.2 M pyrrole의와 디 H2O의 386 mL 14 mL를 추가 합니다.
- 커버 알루미늄 호 일로 솔루션 및 4 ° c.에 저장
3. 전기 Polypyrrole 이토 유리에의
- 따뜻한 실내 온도에 pyrrole 솔루션 NaDBS redissolved 완전히 때까지.
참고:이 약 15 ~ 20 분 정도 걸립니다. - Pyrrole 솔루션의 25 mL 비 커에 붓으십시오.
- 멀티 미터를 에칭된 이토 유리를 연결 하 고 슬라이드 pyrrole 솔루션에 잠수함.
- 0 Ω 저항 측면 플래티넘 메쉬 참조 전극으로 직면 하 고 있는지 확인 합니다.
- PPy의 멀티 미터 (전류 3 mA/cm2 에서 4 시간에 대 한)를 사용 하 여 ITO 표면에 전기 도금을 시작 하는 전류를 적용 합니다.
- 멀티 미터 및 세척 전기-PPy 디 H2O 잔여 계면 활성 제를 제거 하에서 ITO 유리를 제거 합니다.
- 부드럽게 면도날을 사용 하 여 이토 유리에서 전기 PPy 플레이트를 분리 합니다.
- 실 온에서 PPy 접시를 저장.
4입니다.입니다 (PDMS)의 준비
- 주걱과 무게 접시 사용 하, 경화제의 2 세대와 기본 에이전트의 18 g을 혼합 하 고 두 10 cm x 8 cm 유리 금형에 혼합물을 부 어.
- 15-20 분 동안 진공 챔버를 사용 하 여 금형에서 거품을 제거 합니다.
- 3 h 70 ° C 오븐에 금형을 놓습니다.
- 일단 냉각, 금형에서는 PDMS를 제거 하려면 평평한 주걱을 사용 합니다.
5. 시험관에 전기 자극 챔버의 제조
- 압력솥 (WxL, 2.5 c m x 12.5 c m) 금속 접시와 흐름 1 시간 동안 120 ° C에서 밸브.
- 템플릿으로 챔버 슬라이드를 사용 하 여, PDMS의 두 조각을 잘라.
참고: PDMS의 한 조각 셀 챔버 내에서 두 개의 인접 한 사각형의 배 기판 가진 셀 챔버의 경계 역할을 합니다. 다른 PDMS 조각 챔버의 경계에 대 한 개요입니다.- 잘라 안쪽에 밖으로 셀을 정사각형 모양 실과 셀 챔버의 모양을 일치. PDMS의 두 조각의 전반적인 모양은 직사각형 이며 챔버 슬라이드의 일치를 확인 합니다.
- 맨 아래에서 다음과 같은 자료를 레이어: (1) 금속 격판덮개, (2) (단편), 없이 PDMS (3) PPy 플레이트 (PDMS에 수직), (단편)와 (4) PDMS 및 (5) 셀 챔버.
- 일단 완벽 하 게 정렬 기구를 함께 클램프.
- 금속 와이어의 두 60 cm 조각 잘라내어 실버 붙여넣기를 사용 하 여 챔버의 외부에서 돌출 PPy 플레이트의 각 끝에 1 개의 철사를 연결. 전선은 충분히 인큐베이터의 외부에 장치에서 확장을 확인 합니다.
- 일단은 풀 치료 강화와 에폭시와 와이어 연결 인감.
- 적용된 분야는 각 챔버에 동일 다는 것을 확인 하는 멀티 미터를 사용 하 여 저항을 기록 합니다.
- 이식, 제거 와이어; unclamp 셀 챔버 및 PDMS 그리고 그들 전도성 발판에서 별도. 이식 장비의 차원은 약 1 m m x 3 m m x 0.25 m m입니다.
6. 인간의 신경 조상 세포 (hNPCs) PPy에 도금
- 2 시간 동안 UV 빛에서 조립된 챔버를 소독.
- 1 시간 후 조립 회전 90 °를 실.
- 살 균 후 코트 코팅 기판의 800 µ L와 아래쪽 챔버의 PPy의 표면 하 고 1 시간에 5% CO2 에서 37 ° C에서 인큐베이터의 PPy 접시에 공고히 기판 허용.
- 1 시간 후 챔버에서 상쾌한을 제거 하 고 부드럽게 잘 당 DPBS Ca + Mg의 1 mL로 씻어.
참고:로이 코팅 기판의 분리로 인해 강제로 PPy의 표면 세척 하지 마십시오. - 신선한 셀 미디어를 사용 하 여 기계적으로 부드러운 pipetting으로 조직 배양 접시에서 챔버와 함께 사용 하기 위해 배양된 세포 분열.
참고: 셀 분리 시 90-100% 합칠 이어야 한다. - HNPC 펠 릿 8000 x g에서 5 분간 원심 분리를 사용 하 여 수집.
- hemocytometer를 사용 하 고 100, 000 셀/c m2의 볼륨에서 셀 resuspend.
- 각 챔버 잘 (100000 셀/cm2 미디어의 1 ml에서)으로 100000 세포를 플레이트.
- 5%에서 37 ° C에서 인큐베이터 챔버 돌아가기 CO2.
7. 전기 자극의 hNPCs
- 챔버에 세포를 뿌리기 후에 1 일 파형 발생기를 사용 하 여 셀에 전기 자극을 적용.
- 자극, 전에 잘 각 약 실에서 오래 된 미디어를 제거 하 고 신선한 미디어의 800 µ L를 보충 합니다.
- 미디어를 변경한 후 약 실 인큐베이터에 다시, 인큐베이터에서 철사 연장 놓고 파형 발생기에 첨부
- 1 시간에 100 Hz와 ±400 mV에서 구형 파 신호를 세포에 자극을 적용 합니다.
- 자극 후 철사를 제거 하 고 또 하루 5% CO2와 37 ° C에서 설정 하는 인큐베이터에서 챔버를 품 어.
- 세포 생존 능력 및 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR) 다음 제조 업체의 프로토콜을 포함 하 여 이후 생물 학적 분석을 수행 합니다.
8. PPy 이식 Vivo에서
- T 세포 결핍에 원심 중간 대뇌 동맥 (dMCA) 폐색 선 모델 수행 성인 남성 누드 쥐 (NIH RNU 230 ± 30 g)로2위에서 설명한. 이식 1 주일 게시물 dMCA 폐색을 수행 합니다.
- 수술 전에 1 일 그들의 감 금 소 물에 쥐에 암 피 실린 (1 mg/mL)을 제공 합니다.
- Anesthetize 사용 하 여 유도 챔버 쥐 isoflurane 흡입을 통해 관리의 0.5-3 %mg / kg.
- 발가락 핀치 반사 응답의 부족에 의해 쥐의 anesthetization를 확인 합니다.
- 동물 마 취 동안 막, 호흡 패턴, 색상과 직장 온도 15 분 마다 모니터링을 계속 합니다.
- 일단 anesthetization 확인, 건조를 방지 하기 위해 쥐의 눈에 인공 눈물을 적용 합니다.
- 무 균 기술 멸 균 장갑, 그리고 메 마른 외과 용 드 레이프13를 사용 하 여이 절차 동안 유지 됩니다 확인 하십시오. 살 균 분야 내 메 마른 외과 기구를 유지.
- 마 취는 쥐를 실행 하는 동안 왼쪽된 피 위에 craniectomy 드릴. 경질을 엽니다.
- 수술 마이크로-얇은 바늘을 사용 하 여 뇌에서 dura mater를 제거 합니다.
- 쥐 피에 체 외에 시스템에서 전도성 건설 기계를 이식.
참고: 우리의 실험에 대 한 우리 생체 외에서 3 일 hNPC 도금 후에서 건설 기계에 이식합니다.- 중간 선 병 변 주로 반영 피 질에 플을 놓습니다.
- 발판은 배치 후, 이식 피부 폐쇄 움직임을 방지 하기 위해 surgicel을 놓습니다.
- 봉합 사 상처 고 쥐 buprenorphine SR stereotaxic 수술 및 dMCA 폐색과 관련 된 통증을 관리 하기 위해 1 mg/kg의 복용량에 피하 주입
- 의식 회복 쥐 복구에 놓습니다.
- 결코 방치 동물 그것은 의식 하는 동안.
- 그것은 완전히 의식을 얻을 때까지 다른 동물을 배치 하지 마십시오.
- 매일 몸 무게 감소, 감소 음식/물 섭취, 감소 손질/빗질 외 투, 자발적인 활동 감소/증가, 비정상적인 자세, 탈수/피부 tenting, 오목 눈, 숨기기, 자기 절제, 등 통증의 흔적에 대 한 동물을 모니터링 빠른 호흡, 오픈 짖 어 대 호흡, 경련, 떨림, 떨림과 발성 합니다.
- 그들이 먹고, 마시고, 손질, 고 무게;를 얻고 나타날 때까지 동물을 매일 모니터링 그리고 체중 증가 후 다음 주간입니다.
- CO2 흡입 및 euthanization (으로 동물 정상적인 산소 공급 게시물 CO2 흡입으로 인해 부활 하지 것 이다)의 보조 확인을 통해 초기 euthanization 술 안 먹고 나타나는 어떤 동물에 발생 하 고 초기 수술; 후 무게를 얻고 고통을;에 나타납니다. 때문에 모터 피 질 적자를 예상 보다 더 큰 행동 테스트를 완료할 수 없습니다 나타납니다.
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결과
그림 1 에 표시 된 회로도 hNPCs 및 잠재적인 다운스트림 응용 프로그램의 전기 자극의 전체 워크플로 나타냅니다. 줄기 세포 치료에서 현재 한계 줄기 세포 염증, 허 혈 성 조건 등 거친 후 이식 환경에 노출 되는 것 이다.입니다. 이러한 어려운 조건을 가능성이 그들의 치료 효능14,15제한합니다. 이 환경에서 hNPCs를 보호 하기 위해 전도성 비 계를 사용 하 여 전기 늘어진 통해 hNPCs 치료 혜택을 증가 수 있습니다. 이 줄기 세포 전달 기술에서는 첫 번째 단계는 전기 접근2,16를 사용 하 여 전도성 비 계의 개발 이다. 우리 건설 기계 생체 적합성을 특징 하 고 hNPCs와 전기 늘어진 특성에 ...
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토론
증거를 성장 소설 뇌졸중 치료로 줄기 세포의 약속을 입증 했다. 이 약속은 적어도 40 진행 중이거나 완료 된 임상 시험을 머리 맡에 줄기 세포 치료제를 사전 중요 한 노력에 결과 있다. 선 병 급성 모욕 후 과정이 없다 신경 복구를 방지 하기 때문에 줄기 세포 치료 라는 독특한 신경 장애를 제공 합니다. 줄기 세포 강화 된 뇌졸중 복구의 정확한 기계 장치는 불분명 남아 있습니다. 신생, synaptogenesis, 및 시 냅 스 리 모델링 모두 중요 한 것을 보여줘 왔다. BDNF 등 THBS-1 시 냅 스 형성에 대 한 중요 한 분자는 제거 하는 경우 뇌졸중 복구 장애인된6,19입니다. hNPCs 수많은 동물 모델20,21에서 뇌졸중 후 기능적 복구를 개선 했습니다. 메커니즘은 hNPCs의 효과가 남아 완전히 이해 하...
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공개 사항
저자는이 작품을 선언 하 전혀 충돌의 관심이 없다.
감사의 글
QRT-PCR 기계의 사용에 감사 박사 Kati Andreasson (부의 신경과 및 신경 과학, 스탠포드 대학) 하 고. 일은 스탠포드 학부의 학장의 박사 친목 (사운드) 국립 연구소의 건강 보조금 K08NS098876 (P.M.G.)을 지원 했다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| FGF-Basic | Invitrogen | CTP0261 | 작업 매체용 20ng/mL |
| Matrigel | Corning | cb40234a | 1:200 희석 |
| LIF 단백질, Recom. Hum. (10 µ g/mL) | EMD Millipore | LIF1010 | 10ng/mL 작업 매체용 |
| Sylgard 184 실리콘 3.9kg | Fisherbrand | NC0162601 | |
| 염산 | Fisherbrand | SA56-4 | |
| 질산 농축액(인증) ACS, Fisher Chemical | Fisherbrand | SA95 | |
| ITO Glass | Delta Technologies | CG-40IN-0115 | |
| 나트륨 도데실벤젠설포네이 | Sigma | 289957-1KG | |
| Pyrrole | Sigma | 131709-500ML | 빛과 실온으로부터 pyrrole 용액을 보호하십시오 |
| 8 웰 유리 슬라이드 챔버 | Thermo Sci Nuc | 125658 | 세포실을 분리하고 멸균된 상태로 보관하십시오 |
| . 평면 브래킷, 3"x1" | McMaster-Carr | 1030A4 | |
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| 와 Mg, 페놀 레드 | 제네시스 없음 | 25-508C | |
| AB2 ArunA 신경 세포 배양 미디어 키트 | Aruna Biomedical | ABNS7013.2 | |
| hNP1 인간 신경 전구체 확장 키트 | Aruna Biomedical | hNP7013.1 | |
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| 멀티미터 | Keysight | E3641A | |
| 웨이브폼 발생기 | Keysight | 33210A-10MHz | |
| Pt 메시 | Sigma-Aldrich | 298107-425MG | 참조 전극, 치수, 1x1 cm |
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| Frazier Micro Dissecting | Hook Harvard Apparatus | 52-2706 |
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