분리와 인간 성인 그리고 태아 심장 표본에서 파생 하는 기본 Epicardial 세포의 문화

요약

epicardium 세포와 심근 벽에 성장 요소를 제공 하 여 개발 및 심장의 수리에 중요 한 역할을 하고있다. 여기, 우리는 연구와 그들의 발달 및 성인 특성의 비교 문화 인간의 기본 epicardial 셀 하는 방법을 설명 합니다.

초록

Epicardium, 심근, 취재는 상피 세포 층 필수적인 역할 심장 개발 과정 뿐만 아니라 있다 복구 응답 심장의 허 혈 성 손상 후. 활성화 되 면, epicardial 세포 재생 심근 세포를 제공 하 엽 전환 (응급) 상피로 알려진 프로세스를 받 다. 또한,는 epicardium 필수 paracrine 요인의 분 비를 통해 기여 한다. 감사 하기 위해 완벽 하 게는 epicardium의 재생 잠재력, 인간 세포 모델이 필요 합니다. 여기 우리 소설 셀 문화 모델 인간 성인 그리고 태아 심장 조직에서 파생 하는 기본 epicardial 파생된 셀 (EPDCs)을 개설 한다. EPDCs를 분리 하는 epicardium 심장 표본의 외부에서 해 부 이며 단일 세포 현 탁 액으로 처리. 다음으로, EPDCs 도금 고가 5 키 억제제 그들의 상피 표현 형을 유지 하기 위해 SB431542를 포함 하는 EPDC 매체에서 경작. 구급 대는 TGFβ와 자극에 의해 유발 됩니다. 이 방법을 수 있도록, 처음으로, 제어 환경에서 인간의 epicardial 응급 과정의 연구 심장 재생을 원조 할지도 모른다 EPDCs의 secretome에서 더 많은 통찰력을 얻고 촉진 한다. 또한,이 균일 한 접근 인간 성인 그리고 태아 epicardial 행동의 직접적인 비교에 대 한 수 있습니다.

서론

Epicardium, 봉투는 마음 임을 심장 개발 및 수리 (Smits 외 에 검토에 대 한 중요 한 중요성의 단일 셀 상피 층 ¹).는 epicardium proepicardial 기관, 개발의 기초에 있는 작은 구조에서에서 발생 하는 발달. 마우스, 그리고 4 주 후 임신 인간에서 발달 하루 E9.5, 셀 시작이 콜리플라워 구조에서 마이그레이션할 개발 심근²를 커버. 단일 상피 세포 층이 형성 되 면 epicardial 셀의 일부 엽 전환 (응급) 상피를 겪 습. 응급, 중 셀 셀 셀 유착 등 상피의 특성을 잃게 되 고 그들에 게 개발 심근으로 마이그레이션할 수 있는 능력을 주는 엽 형을 얻을. 비록 후자는 두 셀 형성된 epicardial 파생된 셀 (EPDCs) 섬유 아 세포, 평활 근 세포, 그리고 잠재적으로 cardiomyocytes와 내 피 세포³를 포함 하 여 여러 심장 세포 유형으로 분화 할 수 있다 토론 (Smits 외 에 검토에 따라 인구 남아 ⁴). 또한,는 epicardium 규제의 성장과 vascularization⁵

프로토콜

인간의 조직 표본으로 모든 실험 라이덴 대학 메디컬 센터의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 고 헬싱키의 선언에. 모든 단계는 캐비닛 셀 문화 흐름에 멸 균 장비와 함께 수행 됩니다.

1입니다. 준비

1. Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM 낮은 포도 당) 및 매체 199 (M199) 1:1 비율로 혼합 하 여 EPDC 매체를 준비 합니다. 10% 열 비활성화 소 태아 혈 청 (FBS, 열 56 ° C에서 25 분 비활성화) 추가 100 U/mL 페니실린 및 100 mg/mL 스 보충. 사전에 EPDC 매체는 37 ° C 물 욕조에 따뜻한.
2. 미리 따뜻하게 트립 신 0.25%/EDTA (1:1) 37 ° C 물 목욕에서.
3. 젤라틴과 웰 스 코트. 각 우물에 0.1% 젤라틴/PBS를 추가 하 고 37 ° c.에 적어도 15 분 동안 접시를 품 어 필요한 셀 문화 접시에 대 한 지침 표 1에 요약 되어 있습니다. 조심 스럽게 셀을 도금 하기 전에 모든 액체를 제거.
4. 재고 솔루션 10 m SB431542 m (SB), 희석 DMSO (주의)를 준비 합니다. -20 ° c.에서 그들을 저장 고 원뿔 바닥 폴 리 프로필 렌 원심 분리기 튜....

결과

여기, 우리는 인간 성인 그리고 태아 심장 조직 (그림 1)에서 EPDCs를 분리 하는 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜 (그림 1A) 심장의 외부에는 epicardium의 쉽게 접근할 수 있는 위치를 활용합니다. 해 부 WT1 + epicardium 기본 subepicardial 기질 및 심근 조직 손상 (그림 1J) 유지 하는 동안 제거 됩니다 보여 줍니다 후 심장 auricle의 얼룩. 광범위 한 특성 EPDCs 익스프레스 epicardial 마커, 예를 들어, 다른 심장 상주 세포 유형, 예를 들면, PECAM1, ISL1, CD34, 및 TNNT2의 ALDH1A2, TBX18, KRT8, KRT19 및 부족 식 시연 전에 수행 되었습니다.

토론

여기 우리는 상세한 프로토콜을 및 문화 기본 epicardial 세포 인간 성인 그리고 태아 심 혼에서 파생 된 설명 합니다. 이러한 세포의 광범위 한 특성은 이전에 게시¹⁷이었다. 우리는 두 세포 유형 상피 조약돌 모양의 셀 때 ALK5 키 니 아 제 억제 물 SB431542와 교양으로 유지할 수 있습니다 나타났습니다. 응급 개발 및 후 부상 응답 epicardial 활성화에 vivo에서 의 중요 한 부분 이다. 응급 수 공부 될이 메서드를 사용 하 여 TGFβ의 추가 의하여. 중요 한 것은, 이전 관찰 SB 제거 성인 EPDCs는만 자극¹⁷시 응급 수술 하는 동안 태아 EPDCs 빠르게 자발적인 응급을 받아야 합니다. 태아 EPDCs에서이 과정을 공부 하 고 최적의 성인 epicardium 손상 후 활성화 하는 방법을 이해에 도움이 수 있습니다.

제시 방법은 수술 하는 동안 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
둘베코' s 변형 된 독수리' s 미디엄 + GlutaMAX	Gibco	21885-025
미디엄 199	Gibco	31150-022
태아 소 세럼	Gibco	10270-106
Trypsin 0.25%	Invitrogen	25200-056
Penicillin G sodium salt	Roth	HP48
Streptomycin sulphate	Roth	HP66
Trypsin 1:250 from bovine pancreas	Serva	37289
EDTA	Sigma	E4884
돼지 껍질의 젤라틴	Sigma-Aldrich	G1890
배양 플레이트 6 웰	Greiner 바이오 온	657160
배양 플레이트 12 웰	Corning	3512
배양 플레이트 24 웰	Greiner 바이오 원	662160
SB 431542	Tocris	1614
디메틸 설폭사이드 (DMSO)	Merck	102931
100-1000&마이크로; L 필터링된 피펫 팁	Corning	4809
10-ml 피펫	Greiner bio-one	607180
5-ml 피펫	Greiner bio-one	606180
세포 배양 접시 100/20 mm	Greiner bio-one	664160
PBS	Gibco	10010056	또는 집에서 만든
멸균 Eppendorf 튜브 1.5 mL	Eppendorf
15ml 원심분리기 튜브	Greiner bio-one	188271
50ml 원심분리기 튜브	Greiner bio-one	227261
10mL 주사기	Becton Dickinson	305959
바늘 19 게이지	Becton Dickinson	301700
바늘 21 게이지	Becton Dickinson	304432
EASY스트레이너 Cell Sieves, 100 & micro; m	Greiner 바이오 원	542000
TGFβ 3	R& D 시스템	243-B3
단클론 안티 액틴, &알파;-평활근	시그마	A2547
안티 마우스 Alexa Fluor 555	Invitrogen	A31570
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379
Equipment
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
Pipet P1,000	Gilson	F123602
Pipet 컨트롤러	Integra	155 015
실체현미경	Leica	M80
도립광 현미경	Olympus	CK2
원심분리기	Eppendorf	5702
Waterbath	GFL	1083

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