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방법 논문

분리와 인간 성인 그리고 태아 심장 표본에서 파생 하는 기본 Epicardial 세포의 문화

7.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57370

⸱

2018년 4월 24일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Cell Biology, Leiden University Medical Center

이 논문에서

요약

epicardium 세포와 심근 벽에 성장 요소를 제공 하 여 개발 및 심장의 수리에 중요 한 역할을 하고있다. 여기, 우리는 연구와 그들의 발달 및 성인 특성의 비교 문화 인간의 기본 epicardial 셀 하는 방법을 설명 합니다.

초록

Epicardium, 심근, 취재는 상피 세포 층 필수적인 역할 심장 개발 과정 뿐만 아니라 있다 복구 응답 심장의 허 혈 성 손상 후. 활성화 되 면, epicardial 세포 재생 심근 세포를 제공 하 엽 전환 (응급) 상피로 알려진 프로세스를 받 다. 또한,는 epicardium 필수 paracrine 요인의 분 비를 통해 기여 한다. 감사 하기 위해 완벽 하 게는 epicardium의 재생 잠재력, 인간 세포 모델이 필요 합니다. 여기 우리 소설 셀 문화 모델 인간 성인 그리고 태아 심장 조직에서 파생 하는 기본 epicardial 파생된 셀 (EPDCs)을 개설 한다. EPDCs를 분리 하는 epicardium 심장 표본의 외부에서 해 부 이며 단일 세포 현 탁 액으로 처리. 다음으로, EPDCs 도금 고가 5 키 억제제 그들의 상피 표현 형을 유지 하기 위해 SB431542를 포함 하는 EPDC 매체에서 경작. 구급 대는 TGFβ와 자극에 의해 유발 됩니다. 이 방법을 수 있도록, 처음으로, 제어 환경에서 인간의 epicardial 응급 과정의 연구 심장 재생을 원조 할지도 모른다 EPDCs의 secretome에서 더 많은 통찰력을 얻고 촉진 한다. 또한,이 균일 한 접근 인간 성인 그리고 태아 epicardial 행동의 직접적인 비교에 대 한 수 있습니다.

서론

Epicardium, 봉투는 마음 임을 심장 개발 및 수리 (Smits 외 에 검토에 대 한 중요 한 중요성의 단일 셀 상피 층 1).는 epicardium proepicardial 기관, 개발의 기초에 있는 작은 구조에서에서 발생 하는 발달. 마우스, 그리고 4 주 후 임신 인간에서 발달 하루 E9.5, 셀 시작이 콜리플라워 구조에서 마이그레이션할 개발 심근2를 커버. 단일 상피 세포 층이 형성 되 면 epicardial 셀의 일부 엽 전환 (응급) 상피를 겪 습. 응급, 중 셀 셀 셀 유착 등 상피의 특성을 잃게 되 고 그들에 게 개발 심근으로 마이그레이션할 수 있는 능력을 주는 엽 형을 얻을. 비록 후자는 두 셀 형성된 epicardial 파생된 셀 (EPDCs) 섬유 아 세포, 평활 근 세포, 그리고 잠재적으로 cardiomyocytes와 내 피 세포3를 포함 하 여 여러 심장 세포 유형으로 분화 할 수 있다 토론 (Smits 외 에 검토에 따라 인구 남아 4). 또한,는 epicardium 규제의 성장과 vascularization5,6,,78심근에 교육적 paracrine 신호를 제공 한다. 여러 학문은 장애인된 epicardial 형성 발달 결함 심장 근육9,10, 맥 관 구조11및 전도 시스템12, 필수 강조에 리드 설명 했다 심장의 형성에 epicardium의 기여 금.

성인 심장에는 epicardium 휴면 레이어로 있으면, 비록 그것은 허 혈13시 다시 활성화 된다. Epicardial 다시 활성화 후 상해의 몇몇이 프로세스 심장 개발을 위한 확산 및 응급14, 이기는 하지만 설명 덜 효율적으로. 흥미롭게도, 비록 정확한 메커니즘은 완전히 이해 되지 않습니다, 복구 epicardial 기여와 함께, 예를 들어, Thymosin β415 처리에 의해 향상 시킬 수 있습니다 또는 mRNA VEGF A16, ameliorated 심장에 결과 수정 심근 경색 후 함수입니다. epicardium 따라서 부상된 심장의 내 생 수리를 강화 하는 재미 있는 셀 소스를 여겨진다.

심장 개발의 메커니즘은 덜 효율적인 방식 상해, 동안 자주 지는. Epicardial 활성 검색 확인 하 고 태아 및 성인 epicardium의 전체 용량을 비교할 수 있습니다 우리가 최고입니다. 또한, 치료 관점에서, 동물 실험, 뿐만 아니라 우리 인간의 epicardium의 응답에 관한 지식을 확장 중요 하다. 여기, 우리는 인간 성인 그리고 태아 epicardial 파생된 셀 (EPDCs)는 상피 세포 같은 형태학에 문화를 격리 하 고 구급 대를 유도 하는 방법을 설명 합니다. 이 모델을 우리는 탐구 하 고 성인과 태아 epicardial 셀 동작 비교 목표로 합니다.

이 프로토콜의 주요 장점은 철저 하 게 공부 하지는 인간의 epicardial 물자의 사용 이다. 중요 한 것은, 설명된 절연 및 세포 문화 프로토콜 두 태아 및 성인 자갈 EPDCs, 이러한 두 셀 소스 사이 직접적인 비교를 사용 하면 파생 단일 유니폼 방법의 제공 한다. 또한, 이후는 epicardium 격리 된 위치에 따라, 그것은 셀 실제로 epicardially 파생된17는 보장 된다.

인간의 EPDC 격리 방법을 이전 설립 되었습니다,이 주로 심장 또는 epicardial 조직의 조각 셀 문화 접시18,19에 도금는 파생물 프로토콜에 의존. 이 방법은 그로 인하여 세포는 부분적으로 마이그레이션하려면, 그들의 상피 표현 형을 잃고 그리고 자발적인 응급 수술 하는 경향이 더 위해 특별히 선택 합니다. 현재 프로토콜에서은 epicardium 상피 상태로 유지 하기 위해 고립 된 EPDCs를 허용 하는 단일 셀 솔루션으로 먼저 처리 됩니다. 이 메서드는 따라서 epicardial 응급 연구 단단한 체 외에 모델을 제공 합니다.

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프로토콜

인간의 조직 표본으로 모든 실험 라이덴 대학 메디컬 센터의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 고 헬싱키의 선언에. 모든 단계는 캐비닛 셀 문화 흐름에 멸 균 장비와 함께 수행 됩니다.

1입니다. 준비

  1. Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM 낮은 포도 당) 및 매체 199 (M199) 1:1 비율로 혼합 하 여 EPDC 매체를 준비 합니다. 10% 열 비활성화 소 태아 혈 청 (FBS, 열 56 ° C에서 25 분 비활성화) 추가 100 U/mL 페니실린 및 100 mg/mL 스 보충. 사전에 EPDC 매체는 37 ° C 물 욕조에 따뜻한.
  2. 미리 따뜻하게 트립 신 0.25%/EDTA (1:1) 37 ° C 물 목욕에서.
  3. 젤라틴과 웰 스 코트. 각 우물에 0.1% 젤라틴/PBS를 추가 하 고 37 ° c.에 적어도 15 분 동안 접시를 품 어 필요한 셀 문화 접시에 대 한 지침 표 1에 요약 되어 있습니다. 조심 스럽게 셀을 도금 하기 전에 모든 액체를 제거.
  4. 재고 솔루션 10 m SB431542 m (SB), 희석 DMSO (주의)를 준비 합니다. -20 ° c.에서 그들을 저장 고 원뿔 바닥 폴 리 프로필 렌 원심 분리기 튜브, Eppendorf 관 처럼 50 µ L aliquots 참고 SB aliquots는 한 번만 해빙 될 수 있습니다.

2. 검색 및 성인 및 태아 심장 표본 저장

  1. 수술 시 제거 시 직접 인간 성인 auricles 15 mL 50 mL 튜브에 저장 10 %FBS, 100 U/mL 페니실린, 4 ° c.에 100 mg/mL 스 포함 된 높은 포도 당 DMEM 샘플은 일반적으로 3-5 cm 크기에서 및 최대 저장 될 수 있다 해 부 후 48 h.
  2. 격리 후 24 h까지 4 ° C에서 EPDC 매체에서 선택 낙태 자료에서 얻은 태아 마음을 저장 합니다. 이 프로토콜에 대 한 샘플을 사용 하 여 12 월 22 일 주 사이 임신 나이. 참고 전체 심 혼은 epicardium의 격리에 대 한 사용할 수 있습니다.

3입니다. 절연 Epicardial 계층의

  1. 층 류 캐비닛에 PBS 가진 100 m m 세포-배양 접시를 준비 하 고 뚜껑에 PBS의 별도 작은 물방울 (~ 200 µ L)를 배치 합니다. 5 mL 미리 데워 진된 EPDC 매체에 15 mL 튜브를 채우십시오.
  2. 장소 세포 배양 접시에 조직 PBS 가득합니다. 조직 절차 동안 자주 습 하 게 다는 것을 확인 하십시오.
  3. 집게를 사용 하 여 그것을 벗 하 여 가능한 조직 샘플에서 epicardial 계층의 제거는 stereomicroscope를 사용 하 여.
    참고:로 매우 얇고, 투명 한 레이어는 밀접 하 게 심장 (그림 1A)의 바깥쪽에 준수는 epicardium은 인식할 수 있습니다. 이 격리를 방해 합니다 때문 epicardial 지방 조직 및 혈관으로 오염을 방지 하려고 합니다.
  4. 뚜껑에 PBS의 물방울에 epicardial 조직의 조각을 수집 합니다.
  5. (그림 1B), 메스를 사용 하 여 또는 작은 집게의 날카로운 팁을 사용 하 여 작은 조각 (0.5 m m3)으로 epicardial 조직을 잘라. 조각을 P1, 전달할 수 있어야 합니다 참고 000 피펫으로 팁 (단계 3.6).
  6. 1 mL의 트립 신 epicardial 조직에 추가 하 고 조각 및 p1, 000 피펫으로 팁 트립 신 수집. 조직 1.5 mL 원뿔 원심 분리기 튜브 (그림 1C)로 전송 합니다.
  7. ~ 60 rpm에서 떨고 있는 동안 10 분 동안 37 ° C 물 욕조에 튜브를 품 어.
  8. 물 탕에서 튜브를 제거 하 고 70% 에탄올 튜브의 외부를 청소.
  9. (그림 1D) 관의 바닥에 침 몰 하 고 신중 하 게 상쾌한 비활성화는 트립 신을 5 mL EPDC 매체를 포함 하는 15 mL 튜브에 epicardial 셀을 포함 하는 조직을 허용.
  10. 1 mL의 트립 신와 원뿔 원심 분리기 튜브에 남아 있는 조직을 보충 하 고 부드럽게 위아래로 pipetting으로 혼합.
  11. 3.7 3.10 단계를 두 번 반복 합니다. 마지막 단계에서 트립 신 보육의 30 분의 총 후 전송는 상쾌한 고 나머지 epicardial 조직 EPDC 매체를 포함 하는 관으로.
  12. 모든 세포는 EPDC 매체에 수집 되는 경우 부드럽게 통과 정지 10 mL 주사기 19-게이지 바늘으로 세포 (그림 1E) 기계적으로 해리를 새로운 15 mL 튜브에.
    참고: 방해 지 고 바늘을 방지 하기 위해 바늘을 통해 솔루션을 전달 하기 전에 아래로 pipetting으로 현 탁 액을 균질 있는지 확인 합니다.
  13. 더 세포 분열, 21-게이지 바늘 3.12 단계를 반복 합니다.
  14. 100 µ m 셀 거르는 50 mL 튜브 위에 놓고 10 mL 피 펫을 사용 하 여 모든 나머지 덩어리 (그림 1 층)을 제거 하는 여과기에 epicardial 셀을 포함 하는 매체를 전송 합니다.
  15. 5 mL EPDC 매체는 여과기에 pipetting 여 잔여 세포를 수집 여과기를 세척.
  16. 피펫으로 세포 현 탁 액 15 mL 튜브에 50 mL 튜브에서. 이후 셀 튜브의 바닥에 침 몰, pipetting 전에 솔루션 부드럽게 흔들어.
    참고:이 단계는 필요 하지, 하는 동안 작은 튜브 원심 분리 후 펠 릿의 시각화를 에이즈.
  17. 실내 온도 (그림 1G)에 5 분 동안 200 x g에서 원심.
  18. 상쾌한을 제거 하 고 필요한 양의 EPDC 매체 (표 1)에 셀 펠 릿 (그림 1 H) resuspend.
    참고: 태아 EPDCs 직접 ALK5 키 니 아 제 억제 물 (EPDC + SB)의 10 µ M를 포함 하는 EPDC 매체를 사용 합니다. 성인 세포 첫 대목 중 SB 없이 도금 될 수 있다.
  19. 세포 현 탁 액에 젤라틴 코팅 배양 배지 (그림 1I) 접시 우물의 크기는 epicardial 조직 샘플 (표 1)의 크기에 따라 달라 집니다. 참고 낮은 confluency 응급의 발생을 유발 한다.
  20. 37 ° c, 5% CO2 문화 접시에 연결할 셀 수 있도록 적어도 48 h에 대 한 인큐베이터에 셀을 놓습니다.

4입니다. EPDCs의 문화

  1. EPDC + SB 매체 매 3 일 보충.
  2. 적어도 3 일 마다 현미경을 사용 하 여 셀을 검사 합니다. 셀 도달 하면 confluency, 즉, 문화 접시 셀으로 완전히 덮여 때, 통로 표면 비율 1: 2에에서 셀. Note confluency 도달 ~ 5-10 일을 걸릴 수 있습니다.
    1. 매체와 함께, 예를 들면, 유리 피펫으로 피펫으로 또는 포부 시스템을 사용 하 여 발음
    2. 세포를 PBS를 추가 하 여 셀을 신중 하 게 씻어. 부드럽게 접시 소용돌이 PBS 발음.
    3. 접시에 트립 신을 추가 합니다. 부드럽게 회전 하는 트립 신으로 모든 세포를 커버 하 고 37 ° c.에 1 분 동안 접시를 품 어 접시
      참고: 사용 가능한 작은 트립 신으로 (표시: 6의 당 200 µ L 잘 플레이트)
    4. 접시 접시의 아래쪽에서 세포를 기계적으로 분리를 누릅니다. 현미경을 사용 하 여 시각적으로 세포 분리가 확인. 그렇지 않으면, 추가 분에 대 한 셀 문화 접시를 품 어.
    5. 셀에 EPDC + SB 매체의 필요한 볼륨을 추가 하 고 아래로, pipetting으로 resuspend 새로운 젤라틴 코팅 문화 접시에 세포 현 탁 액을 전송.
      참고: 일반적으로, 세포 수에 보관 통과 8까지 조약돌 형태학.

5입니다. EPDCs 구급 대의 유도

  1. 세계로 유도 하 trypsin 및 전송 새로운 젤라틴을 셀 4에 설명 된 대로 EPDC + SB 매체에서 표면 비율 1:2 웰 스를 코팅 하 고 37 ° C, 5% CO2에서 적어도 24 h에 대 한 품 어 세포 분열.
  2. 확인 경우 confluency은 50-70% 그리고 EPDCs 조약돌 형태학입니다.
    참고: Confluency 응급을 EPDCs의 능력을 영향을 줍니다.
  3. 세포에서 매체를 발음 하 고 신중 하 게 PBS와 세포 세척 (단계 4.2.1-참조 4.2.2).
  4. 1 ng/mL TGFβ3 EPDC 매체에와 세포를 자극 하 고 37 ° c, 5% CO2 5 일 동안 인큐베이터에 넣어. 참고는 자극, 동안 포함 하는 TGFβ3 EPDC 매체 필요가 없습니다 보충 되어야 합니다.
  5. 셀을 매일 모니터링 합니다. 5 일 후 응급 수술 하는 셀은 스핀 들 모양의 형태 (그림 2A)에 의해 인식 됩니다.
  6. 문화 스핀 들-모양 EPDCs EPDC 매체에 SB 또는 TGFβ의 추가 없이 4에서 설명 하는 방법. 일반적으로, 스핀 들-모양 EPDCs는 통로 20까지 양식 수 있습니다.
  7. Immunofluorescent 얼룩과 응급 발생 확인 F-말라 스트레스 섬유 (그림 2B)의 형성을 검출 하기 위하여 엽 마커 αSMA 또는 Vimentin 또는 phalloidin에 의해 항 체를 사용 하 여 또는 qRT-PCR를 사용 하 여 응급 관련 유전자 ( 에 대 한 예를 들어, WT1, Periostin, Col1A1, αSMA, N-Cadherin, MMP3, 달팽이, 민 달팽이) (그림 2C 와 표 2).

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결과

여기, 우리는 인간 성인 그리고 태아 심장 조직 (그림 1)에서 EPDCs를 분리 하는 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜 (그림 1A) 심장의 외부에는 epicardium의 쉽게 접근할 수 있는 위치를 활용합니다. 해 부 WT1 + epicardium 기본 subepicardial 기질 및 심근 조직 손상 (그림 1J) 유지 하는 동안 제거 됩니다 보여 줍니다 후 심장 auricle의 얼룩. 광범위 한 특성 EPDCs 익스프레스 epicardial 마커, 예를 들어, 다른 심장 상주 세포 유형, 예를 들면, PECAM1, ISL1, CD34, 및 TNNT2의 ALDH1A2, TBX18, KRT8, KRT19 및 부족 식 시연 전에 수행 되었습니다.

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토론

여기 우리는 상세한 프로토콜을 및 문화 기본 epicardial 세포 인간 성인 그리고 태아 심 혼에서 파생 된 설명 합니다. 이러한 세포의 광범위 한 특성은 이전에 게시17이었다. 우리는 두 세포 유형 상피 조약돌 모양의 셀 때 ALK5 키 니 아 제 억제 물 SB431542와 교양으로 유지할 수 있습니다 나타났습니다. 응급 개발 및 후 부상 응답 epicardial 활성화에 vivo에서 의 중요 한 부분 이다. 응급 수 공부 될이 메서드를 사용 하 여 TGFβ의 추가 의하여. 중요 한 것은, 이전 관찰 SB 제거 성인 EPDCs는만 자극17시 응급 수술 하는 동안 태아 EPDCs 빠르게 자발적인 응급을 받아야 합니다. 태아 EPDCs에서이 과정을 공부 하 고 최적의 성인 epicardium 손상 후 활성화 하는 방법을 이해에 도움이 수 있습니다.

제시 방법은 수술 하는 동안 ...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 연구는 네덜란드 조직에 대 한 과학적 연구 (NWO) (아래 016.146.079) 및 LUMC 연구 친교 AMS, 및 LUMC Bontius Stichting (MJG) 둘 다에 의해 지원 됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
둘베코' s 변형 된 독수리' s 미디엄 + GlutaMAXGibco21885-025
미디엄 199 Gibco31150-022
태아 소 세럼 Gibco10270-106
Trypsin 0.25%Invitrogen25200-056
Penicillin G sodium saltRothHP48
Streptomycin sulphateRothHP66
Trypsin 1:250 from bovine pancreasServa37289
EDTASigmaE4884
돼지 껍질의 젤라틴Sigma-AldrichG1890
배양 플레이트 6 웰Greiner 바이오 온657160
배양 플레이트 12 웰Corning3512
배양 플레이트 24 웰Greiner 바이오 원662160
SB 431542Tocris1614
디메틸 설폭사이드 (DMSO)Merck102931
100-1000&마이크로; L 필터링된 피펫 팁Corning4809
10-ml 피펫Greiner bio-one607180
5-ml 피펫Greiner bio-one606180
세포 배양 접시 100/20 mmGreiner bio-one664160
PBSGibco10010056또는 집에서 만든
멸균 Eppendorf 튜브 1.5 mLEppendorf
15ml 원심분리기 튜브Greiner bio-one188271
50ml 원심분리기 튜브Greiner bio-one227261
10mL 주사기Becton Dickinson305959
바늘 19 게이지Becton Dickinson301700
바늘 21 게이지Becton Dickinson304432
EASY스트레이너 Cell Sieves, 100 & micro; mGreiner 바이오 원542000
TGFβ 3 R& D 시스템243-B3
단클론 안티 액틴, &알파;-평활근시그마A2547 
안티 마우스 Alexa Fluor 555InvitrogenA31570
Alexa Fluor 488 PhalloidinInvitrogenA12379
Equipment
NameCompany카탈로그 번호Comments
Pipet P1,000GilsonF123602
Pipet 컨트롤러Integra155 015
실체현미경LeicaM80
도립광 현미경OlympusCK2
원심분리기Eppendorf5702
WaterbathGFL1083
0030120086

참고문헌

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