간단한 Cytometry 결정 체 외에서 항 체 의존의 향상 뎅기열 바이러스 Zika 바이러스 미리 혈 청을 사용 하 여 분석 결과 기반으로

요약

우리는 Zika 바이러스 미리 혈 청 뎅기열 바이러스 기자 바이러스 성 입자를 사용 하 여 감염의 항 체 의존 향상을 측정 하기 위한 간단 하 고 쉬운 프로토콜을 설명 합니다.

초록

감염의 항 체 의존 향상 뎅기열 바이러스 성 병 인에 중요 한 역할을 보여줘 왔다. 허용 되지 않는 세포에 감염을 강화 하기 위하여 항 체 또는 혈 청의 용량을 측정 하는 전통적인 분석 패 분석 실험에 의해 다음 미디어에 바이러스 출력을 사용 하 여 감염을 계량에 의존 했습니다. 더 최근에, 이러한 분석 붙일 레이블된 항 체를 사용 하 여 셀 라인에서 뎅기열 바이러스 (DENV) 감염을 검사 있다. 이러한 두 방법 모두 이러한 기술의 광범위 한 사용을 제한 하는 제한 사항이 있습니다. 여기, 우리가 설명 하는 간단한 체 외에서 분석 결과 사용 하 여 뎅기열 바이러스 기자 바이러스 성 입자 (RVPs) 녹색 형광 성 단백질 및 항 체 의존 향상 (ADE) 붉은 털에서 얻은 혈 청을 사용 하 여 DENV 감염의 검사 K562 셀을 나타내는 원숭이 Zika 바이러스 (ZIKV) 감염 후 16 주. 이 기술은 신뢰할 수 있는, 포함 하는 셀의 최소한의 조작, 라이브 복제 유능한 바이러스의 사용을 포함 하지 않습니다 이며 cytometry 사용 하 여 양적 판독을 얻으려면 높은 처리량 형태로 수행할 수 있습니다. 또한이 분석 결과 항 체 의존 향상 (ADE) 황열병 바이러스 (YFV), 일본 말 뇌염 바이러스 (JEEV), 웨스트 나 일 바이러스 (WNV) RVPs를 사용할 수 있는 등 다른 flavivirus 감염의 검사에 쉽게 적응 될 수 있다. 분석 결과 설정의 용이성, 데이터를 분석 하 고 결과 해석 하면 높은 대부분의 실험실 설정 의무가 있습니다.

서론

감염의 항 체 의존 향상 (ADE) 그것에 의하여 부분적으로 cross-reactive 항 체 응답 바이러스의 serotype에 의해 유도 된 향상 증가 바이러스 성 복제 및 니 바이러스의 다른 serotype의 과정 이다. 에이드는 뎅기열 바이러스 (DENV) 감염 4 주요 serotypes는 유행에서 광범위 하 게 문서화 되었습니다. 환자의 하위 집합에서 ADE 뎅 그 열 출혈 성 열 (DHF)와 연결 됩니다. 우리는 최근에 Zika 바이러스 (ZIKV) 감염 에이드의 DENV 체 외 발생 가능성이 DENV 니 vivo에서¹ 의 향상에 기여 하는 DENV cross-reactive 항 체 응답의 상당히 높은 수준의 유도 나타났습니다. ^{, 2}. 항 체 의존 향상 분석 실험은 관련 바이러스 2 차 감염을 강화 flavivirus 감염의 병 인에 중요 한 통찰력을 제공 하 고 알려주는 항 체의 능력을 평가 하는 유용한 도구는 백신의 개발입니다.

분석 결과 설명 여기 감염을 일반적으로 허용 하지 않은 K562 셀 함께 DENV RVPs를 사용 합니다. RVPs는 구조적으로 그대로 복제 무능 한 DENV 바이러스....

프로토콜

여기에 설명 된 프로토콜을 설명 하는 데 사용 하는 혈 청 샘플 평가 및 실험 동물 관리 인증 협회에서 지 내게 및 지역, 주에 대 한 신경 및 연방 정책 이었던 붉은 털 원숭이에서 가져온 국제 (AAALAC)-시설 인가. 모든 동물 실험 했다 검토 하 고 승인 기관 동물 관리 및 사용 위원회 샘플 공유 프로토콜 조직을 통해 인수 했다.

1. 주 1

참고: BSL-2 실험실에서 조직 문화에 사용 되는 살 균 층 류 biosafety 캐비닛에 아래 설명 된 모든 단계를 수행 합니다.

1. 혈 청 샘플 실 온에서 해 동 하 고 무 균 튜브에 각 혈 청 샘플의 100 µ L를 전송. 열 물 목욕 또는 온도 조정 가능한 thermomixer 56 ° C에서 30 분 동안 비활성화. 1:1,000 찬 RPMI-10 (10% 태아 둔감 한 혈 청와 RPMI)를 사용 하 여 1: 1에서 배열 하는 혈 청 샘플의 10 연속 희석을 확인 합니다.
2. 살 균 96 잘 V-하단 플레이트의 각 음을 순차적으로 희석된 혈 청 샘플의 10 µ L를 전송 합니다. 고 하지 않고 혈 청 견본과 RPMI-10만 RVPs와 혈 청 샘플 없이 제어 웰 스, RVPs와 RPMI-10의 두 세트를 포함 ....

결과

4 붉은 털 원숭이 ZIKV 감염 후 수집 된 16 주 및 DENV-1을 향상 시키기 위해 그들의 잠재력에 대 한 테스트에서 세라, K562 셀에 2, 3, 4 감염. 동물 감염 후 7 일에 의해 탐지의 제한 된 수준에 거부 하는 감염 후 3 일 ~ 10⁵ 부 ZIKV 플라즈마의 RNA/mL의 x 1의 피크 니를 했다. 아니 니 16 주 후 감염에서 플라즈마에서 발견 되었다. 그리고, RVP 분석 결과 수행 위의 프로토콜에 설명 된 대로, 수집 된 데이터 분석 했다.

GFP + 셀을 식별 하는 데 사용 하는 제어 전략은 그림 1에 표시 됩니다. 초기 게이트 autofluorescent 남자를 제외 하 고 금감위 A vs FSC-헤에 따라 단일 셀 포함 설정 다음 플롯 표시; 단일 셀에서에서 .......

토론

DENV 및 ZIKV 같은 Flaviviruses 상 동^13,14서로와 cross-react 항 체를 생성 하는 그들의 둘 다 구조와 비 구조 단백질의 중요 한 증거를 공유 합니다. 이러한 cross-reactive 항 체 응답을 향상 시키기 위해 표시 되었습니다 감염의 vivo에서 그리고 생체 외에서 분리 serotype 또는 다른 관련 flaviviruses^1,2. 교차 감염을 강화 하기 위하여 잠재적인 질병의 관리에 대 한 고도 백신 개발에 대 한 중요 한 의미를 갖는다.

전통 문화를 기반으로 분석 혈 청의 존재 감염 라이브 DENV로 감염 되는 비 허용 셀을 사용 합니다. 감염의 표준 패 분석 실험^11.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DENV 1-4 RVP	통합 분자	RVP-501
K562 세포	ATCC	CCL-243
RPMI	Corning	10-040-CV
FBS	GE lifesceinces	SH 30910.03	RPMI-10
페니실린-스트렙토마이신	MP 생체 의학	1670049	100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10
HEPES	Cellegro	25-060-Cl	0.025M
(100배;)	Sigma	M7145	1x in RPMI-10
나트륨 피루브산	Cellegro	25-000-Cl	1mM in RPMI-10
L-glutamine	Fisher Scientific	MT25005CI
멸균 V-바닥 플레이트	Thomas Scientific	333-8001-01V
BD Falcon 폴리프로필렌 5ml FACS 튜브	VWR	60819-728
비멸균 U-바닥 플레이트	Falcon	Ref 353910	에 대한 고처리량 대안
	Denville	P7127
200uL 멸균 피펫 팁	Denville	P3020 CPS
20uL 멸균 피펫 팁	Denville	P1121
50-200uL 멀티채널 피펫	Denville	P3975-8-B
5-50uL 멀티채널 피펫	Denville	P3975-9-B
20% 포마데하이드	Tousimis	#1008B
수조	ThermoFisher	TSCOL35
thermomixer	Eppendorf	2231000387	열 비활성화를 위한 수조의 대안
CO2 인큐베이터	ThermoFisher	13-998-213
에탄올	Sigma Aldrich	E7023
액체 표백제	Fisher Scientific	NC9724348
Flowjo 9.8	TreeStar, Inc.		유세포 분석 소프트웨어
BD FACSDiva 6.1.2	Becton Dikinson
BD LSR II 유세포 분석기	Becton Dikinson
Liquid Bleach	Fisher Scientific	NC9724348

RPMI-10 MEM 비필수 아미노산 용액의 FACS 튜브 5mL, 멸균, 혈청학적 피펫