Chloropicrin 및 수소 불 화물 유발 각 막 상피 세포 상해에 대 한 높은 처리량 SiRNA 심사

요약

높은 처리량 작은 금지 RNA 검사 화학 각 막 상피 상해의 분자 메커니즘을 더 빠르게 명료를 도울 수 있는 중요 한 도구입니다. 여기, 우리는 개발 및 노출 모델 및 각 막 상피 부상 수소 불 화물 그리고 chloropicrin 유도의 높은 처리량 검열 방법의 유효성 검사 제시.

초록

Toxicant 유도 눈 부상 화학 빠르게 상당한 조직 손상을 입힐 잠재력을가지고 있기 때문에 진정한 눈 비상 이다. 아무 특정 치료제가이 부상 치료 존재 toxicant 유발 각 막 부상에 대 한 치료는 일반적으로 지원. 치료 및 노출에 대 한 관심에 치료제를 개발 하는 노력, 그것은이 상해의 분자 및 세포 메커니즘을 이해 하는 것이 중요 수. 있습니다 우리는 높은 처리량 작은 금지 RNA (siRNA) 심사의 활용 화학 각 막 상피 상해의 분자 메커니즘을 더 빠르게 명료를 도울 수 있는 중요 한 도구가 될 수 있습니다 제안 합니다. siRNA는 siRNA에 상 동을가지고 있는 19-25의 뉴클레오티드 긴 mRNA를 저하 하는 통로 입을 post-transcriptional 유전자를 활용 더블 좌초 RNA 분자는. 특정 유전자의 표현의 결과 감소는 toxicant에 세포질 응답에 그 유전자의 기능을 확인 toxicant 노출된 셀에 다음 공부 수 있습니다. 개발 및 체 외에 노출 모델 및 수소 불 화물 (HF) 및 chloropicrin (CP) 유도 눈 부상 (HTS)을 상영 하는 높은 처리량 방법의 유효성 검사는이 문서에 표시 됩니다. 하지만 우리는 이러한 두 가지 유독 선택, 우리의 방법 toxicant 노출 프로토콜에 사소한 수정 다른 유독의 연구에 적용 됩니다. SV40 큰 T 항 원 SV40 HCEC 연구에 대 한 선정 되었다 인간 각 막 상피 세포 선 불후. 세포 생존 능력 및 IL-8 생산 심사 프로토콜에서 끝점으로 선정 됐다. Toxicant 노출의 개발와 관련 된 몇 가지 과제 고 셀 문화 방법 HTS 연구에 대 한 적합 한 표시 됩니다. 이 유독 HTS 모델 설립 화학 눈 부상에 대 한 잠재적인 치료에 대 한 화면을 상해의 메커니즘을 이해 하기 더 연구에 대 한 수 있습니다.

서론

Toxicant 유도 눈 부상 화학 빠르게 상당한 조직 손상을 입힐 잠재력을가지고 있기 때문에 진정한 눈 비상 이다. 불행 하 게도, 아니 특정 치료제가이 부상 치료 존재에 toxicant 유발 각 막 부상에 대 한 치료 일반적으로 지원만 있습니다. 현재 치료 전략 일반적인 주로 같은 윤활제, 항생제, 국 소 치료 요법을 포함 하 고 cycloplegics 뒤에 소염제 (예를 들어, 스테로이드) 한 번 각 막^{1 epithelialized 다시 있다 ,2}. 최고의 현재 치료 치료 옵션을 사용할에 불구 하 고 장기적인 예 후는 일반적으로 진보적인 각 막 흐려 및 neovascularization^2,3가난.

동물 모델 화학 독성을 조사 하 고 상해의 메커니즘을 이해를 전통적으로 사용 되어 왔습니다. 그러나, 동물 연구는 시간이 소모 되 고 비싸다. 노력을 줄이기 위해 동물 실험도 있다. 예를 들어 유럽 연합에 도달 법안 (EC 1907/2006)를 동물 실험을 줄이기 위한 규정 있다. 규정 회사 동물 테스트 및 동물에 제안 된 테스트를 수행 하기 전에 유럽 화학 제품 기관에서 승인을 얻는 피하기 위하여 데이터 공유 요구 사항이 포함 됩니다. 규정에 따라 동물 실험 최후의 수단 이어야 한다. 또한 단계적으로 동물에서 화장품의 테스트 유럽 화장품 규정 (EC 1223/2009)이 있다. 동물 연구를 실시 하는 경우 그들이 3Rs의 원칙에 의해 인도 된다 (구체화, 감소, 및 교체), 더 자비 롭 동물 연구를 수행, 사용, 동물의 수를 감소 및 비 동물 대안을 사용 하 여 프레임 워크를 제공 하는 가능한 경우. 이러한 이유로 독물학 분야는 독성의 분자 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다 하 고 높은 처리량⁴에서 행 해질 수 있다 생체 외에서 분석을 채택 하고자 결정 했다. 이것은 기능 독극물 접근 어디 유독 전적으로 그들의 화학에 의해 보다는 오히려 그들의 기능에 의해 정의 됩니다. 단계는 또한, 기능 toxicogenomics 추구 특정 유전자 유독⁵의 효과에서 재생 역할을 이해 하. SiRNA 기술을 응용, 유독에 분자와 세포질 응답에 유전자 기능을 조사 하기 위해 화면 높은 처리량에 수행할 수 있습니다. siRNA는 19-25의 뉴클레오티드 긴 포스트 transcriptional 유전자 입을 통로 모든 포유류 세포⁶에 활용 하는 두 배 좌초 된 RNA 분자. 이 종합적으로 만들어지고 특정 유전자를 대상으로 설계 된. 셀에 도입 하는 경우는 siRNA 처리 되 고 한 가닥, 가이드 물가 RNA 유도 입을 복잡 한 (RISC)에 로드 됩니다. siRNA는 mRNA 분자에 상호 보완적인 영역에 RISC 지시 하 고 있는 RISC 저하는 mRNA. 특정 유전자의 표정 감소 결과. 특정 유전자의 표현의 결과 감소는 toxicant에 세포질 응답에 그 유전자의 기능을 확인 toxicant 노출된 셀에 다음 공부 수 있습니다. 이러한 접근은 더욱 CYP1A1^7,8의 a h R-종속 유도 리 민감성의 메커니즘 이해 하 사용 되었습니다.

화학 테러 위험 평가 (CTRA) 목록 및 독성 산업용 화학 물질 (TIC) 목록 선택 화학 물질의 독성과 테러, 전쟁, 또는 산업 재해 이벤트⁹중 출시 될 가능성에 따라 항목별로 나 누이고 있다. 우리는 siRNA 높은 처리량 검열 (HTS) toxicogenomic 접근 테러 사건에서 사용의 높은 위험에 확인 된 CTRA 목록 이용과의 연구에 적용 하 고 있다. 화학 생물;에 있는 불리 한 효과 이해 하고자 하는 전통적인 독물학 그러나, 우리는 더 욕망의 치료제 및 치료 접근을 가능 하 게, 개발을 알리는 목적으로 상해의 메커니즘을 이해 하는 분자 치료 개발에 대 한 대상으로 지정할 수 있는 발견. 몇 가지 방법으로이 노력 유사한 높은 처리량 siRNA 심사 및 약 발견 과정¹⁰에서 셀 기반 분석의 사용을 고려할 수 있습니다. 주요 차이점은 우리의 접근 방식에 다소 가능성이 크다 toxicant 노출의 치료에 대 한 높은 치료 가치와 단일 대상 될 것 이다 반면 그 약물 발견 일반적으로 치료 발견에 대 한 단 수 목표를 추구 될 것 이다. 우리 예상 어떤 효과적인 치료 패러다임 toxicant 노출에 대 한 높은 치료 가치를 달성 하는 다각적인 접근 방식이 필요로 하 고 toxicogenomic 데이터 극히 효과적인 치료 패러다임을 알릴 수 있습니다.

벤치탑 자동화 실험실 제약 또는 생명 공학 산업 밖에 서 높은 처리량 방법론을 제공합니다. 우리 연구소에서 생체 외에서 연구 역사적으로 낮은 처리량^11,,1213전통적인 분석 되었습니다. 지난 몇 년 동안, 우리의 실험실 벤치탑 높은 처리량 siRNA 심사를 수행 하기 위해 로봇의 사용에 전환 했다. 여기, 우리가 현재 눈 셀 모델의 세련미와 체 외에서 의 개발 수소 불 화물 (HF)와 chloropicrin (CP) 높은 처리량 siRNA 심사 적합에 대 한 노출 방법. 우리의 목표는 이러한 유독 응답에 세포질 상해를 조절 하는 분자를 식별 하는. 우리는 선택 하는 siRNA 도서관의 목표는 G 단백질 결합 된 수용 체, 단백질 kinases, 프로 테아 제, 가수분해, 이온 채널, 그리고 다른 잠재적으로 druggable 대상 포함 됩니다. HF와 CP 선정 됐다 연구에 대 한 상호 CTRA 목록 에이전트 산업 사고의 ToxNet 보고서를 통해 증기 노출^9,14눈 상해의 가장 중대 한 모험을 선물 하는 그를 찾을 수 있습니다. WWI¹⁵에 최 루 가스 CP (Cl₃CNO₂화학식, CAS 번호 76-06-2) 원래 사용 했다. 현재¹⁶nematicide, 살 균 제, 살충제는 농업 fumigant 및 기능으로 사용 됩니다. 수소 불 화물 (HF)는 정유 및 화학 fluorination 유기 화합물¹⁷의 알을 포함 하 여 프로세스에서 사용 됩니다. HF (화학식 HF, CAS 번호 62778-11-4)는 가스 이지만 수성 형태로 소산 (HFA, CAS 번호 7664-39-3). 따라서, 우리가 우리의 셀 HFA를 사용 하 여 선출 노출 모델. SV40 큰 T 항 원 SV40 HCEC 연구에 대 한 선정 되었다 인간 각 막 상피 세포 선 불후. 세포질 상해에 관련 된 목표 세포 죽음과 선 동적인 응답에 반영 해야 하기 때문에 세포 생존 능력 및 염증 성 마커 IL-8 끝점으로 선정 됐다. 특히, 대상 toxicant 노출에서 보호 역할을 한다면, 세포 죽음 또는 염증 성 cytokine 생산 증가 한다 때 대상 식 siRNA에 의해 저해. 반대로 부정적인 역할을 하는 대상에 대 한 사실 것입니다. 또한, 만성 염증 후 노출, 및 세포 죽음 통로 있는 내정간섭에 임상 결과^2,18이 향상 시킬 수 있습니다 각 막 병 리에 역할을 나타납니다.

프로토콜

1. 세포 문화 유지 보수

1. 37 ° C, 5% CO₂, 그리고 15% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)과 DMEM F-12에서 90% 습도에서 셀 라인 SV40-HCEC 성장 1 %L-글루타민, 10 µ g/L 표 피 성장 인자 (EGF), 그리고 5 mg/L 인슐린.
2. 셀 라인 (시드 밀도)에 따라 3 ~ 4 일 마다 그 confluency는 결코 문화 유지 관리 중 80%를 초과 하도록 통로.
3. 플라스 크를 사용 하 여 분리 솔루션 (모든 150 c m² 플라스 크에 대 한 14 mL 해결책)와 부 화 37 ° C에서 8 분 더 이상으로 보다에서 세포를 분리 합니다.
4. 세포 배양의 동등한 양으로 분리 솔루션을 무력화 하 고 160 x g에 7 분 동안 원심 분리 하 여 50 mL 원뿔 튜브에 세포를 작은.
5. 다시 중간 마다 150 c m² 플라스 크 (20 mL)에 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다.
6. 자동된 휴대용 셀 카운터와 씨앗 80 %confluency 초과 하지 않고 3 ~ 4 일 동안 성장할 수 있도록 하는 밀도에 새로운 플라스 크에 세포를 계산 합니다.

2. 플레이트 세포 실험에 대 한

1. 검사는 confluency를 위해 위상 대비 가벼운 현미경에 의해 SV40-HCECs의 플라스 크는 일반 셀 상태를 평가 하 고 80% 보다 작습니다.
2. 분리, 펠 렛, resuspend, 그리고 SV40-HCECs 1.3 1.6 셀 문화 유지 관리의 단계에서 설명한 대로 플라스 크에서 계산. 0.5 µ g/mL 날린 (HCORT 매체)를 포함 하는 SV40 HCEC 매체를 사용 하 여 셀을 resuspend.
3. 일회용 중간 병에 미리 데워 진된 HCORT 매체에서 17,857 셀/mL에서 SV40-HCECs의 현 탁 액을 준비 합니다.
   1. 접시를 시드할 수 수에 대 한 충분 한 양의 세포 현 탁 액을 준비 합니다.
   2. 14 x 96 잘 접시 모든 siRNA 도서관 접시 공부에 대 한 셀의 최소 씨앗
4. 병을 균등 하 게 셀을 중단, 자동된 액체 처리기의 궤도 통 둥지에 저수지로 충분 한 양의 세포 현 탁 액을 부 어 저장 셀 도금 동안 접시를 온난화 37 ° C에 세포 현 탁 액을 포함 하는 병의 소용돌이 프로세스입니다.
5. 자동된 액체 처리기를 사용 하 여 당 96 잘 접시의 매체의 70 µ L에서 잘 (5000 셀/cm²) 당 1000 세포의 밀도에 접시에 셀을 추가. 50 µ L/s를 사용 하 여 모든 단계 pipetting 속도.
   1. 100 rpm에서 시드 프로세스 동안 끊임없이 궤도 셰이 커를 실행 합니다.
   2. 3 세포 현 탁 액 (140 µ L 믹스 볼륨) 번 믹스 자동된 액체 처리기를 사용 하 여.
   3. 세포 현 탁 액의 140 µ L 발음 하 고 두 셀 문화 접시의 각 음에 70 µ L을 분배.
   4. 2.5.3-2.5.4 단계를 반복 하 여 모든 플레이트 셀 시드 있다.
   5. 시드 프로세스 중 필요에 따라 셀 서 스 펜 션 저수지를 리필.
6. 번호판을 시드 후 자동된 액체 처리기에서 그들을 제거 하 고 세포 문화 인큐베이터에 그들을 전송 하기 전에 그들을 실 온에서 30 분 동안 품 어.
7. 평가의 각 격판덮개에 대 한 모든 잘 셀 밀도 셀 문화 인큐베이터에 15%와 22% 합칠 사이 하지 않은 인테리어 웰 스는 연구에서 어떤 접시를 제외 하 고는 자동된 이미징 시스템을 사용 하 여 다음 아침.

3. transfect 세포 siRNA와

1. 미리 접시 당 80 siRNA 목표를 포함 하도록 구성 하는 공급 업체에서 siRNA 도서관 번호판을 취득 ( 그림 4참조), 열 1 및 12 비어.
2. 제조업체의 지침¹⁹에 따라 siRNA의 각 잘 2 pmol / µ L의 최종 농도에 siRNA 버퍼와 siRNA 도서관 플레이트 reconstitute
3. SiRNA의 4 pmol/잘와 0.3 µ L/잘 transfection 시 약의 시드 후 셀 24 h transfect. Transfection 시 약 제조업체의 프로토콜에 따라 모든 단계를 수행 (플레이트 레이아웃 그림 4 참조)²⁰.
   1. 모든 자동된 액체 처리기를 사용 하 여 transfections를 수행 하 고 사용 하는 25 µ L/s pipetting 속도 대 한 모든 단계. 페는 우물만을 해결 하기 위해 미리 구성 된 팁 상자를 사용 합니다.
   2. 6 복제 격판덮개의 세트 transfect 라이브러리 접시의 절반 이라고 "탑 플레이트 설정" top 사용 (siRNA, n 당 복제 6 = 6).
   3. 하단의 transfect 6 복제 격판덮개의 다른 세트를 라이브러리 접시의 절반 이라고 "하단 플레이트 설정"을 사용 하 여 (siRNA, n 당 복제 6 = 6).
   4. "풀 플레이트 세트" 라는 용어를 사용 하 여 라이브러리 siRNA와 페 12 셀 접시를 설명 하기 위해.
   5. 모든 가기 후 부정적인 풀 siRNA와 풀 플레이트 세트에 모든 접시의 우물 B2 B6 transfect와 하단 플레이트 세트 도서관 siRNA와 페 되어 있다.
   6. 또한 transfect 라이브러리 siRNA에는 영향을 받지 않는 고 부정적인 풀 siRNA와 노출 되지 않은 컨트롤 (상단 플레이트 세트)와 하단 플레이트 세트 한 될 것입니다 또 다른 2 개의 격판덮개의 우물 B2 B6.
4. 부드러운 모든 시간을 도청 하 여 모든 transfection 믹스 추가한 후 4 시간 및 혼합 셀 문화 인큐베이터에서 모든 셀 접시를 품 어.
5. 미리 데워 진된 HCORT 매체와 두 번 판 모든 우물을 세척 하는 자동화 된 액체 처리기를 사용 하 여 희석 PBS에서 1:5. 50 µ L/s를 사용 하 여 모든 단계 pipetting 속도.
   1. 각 우물에서 100 µ L를 발음 하 고 폐기물 저수지로 그를 버리고.
   2. 각 잘 100 µ L/잘 추가 미리 데워 진된 HCORT 매체 희석 1: 5에 PBS에 번호판의 수에 대 한 충분 한 양의 다른 저수지에 포함 된.
   3. 각 접시 3.5.1-3.5.2 단계를 반복 합니다.
      1. 필요에 따라 폐기물 저수지를 비어 있습니다.
      2. 리필 HCORT 매체와 저수지 1:5 필요에 따라 PBS에 희석.
   4. 각 우물에서 100 µ L를 발음 하 고 폐기물 공기 통으로 그를 버리고.
6. 100 µ L/잘 미리 데워 진 HCORT 매체, 격판덮개의 수에 대 한 매체의 충분 한 볼륨에 다른 저수지에 포함 된 접시의 모든 우물 refeed
   1. 필요에 따라 매체와 저수지를 리필.
7. 모든 격판덮개의 우물 c 2-c 6를 사용 하 여 컨트롤 비 페.
8. B7-B11 우물과 C7-C11 toxicant 노출 약물 및 차량 컨트롤로 사용할 비 페 모든 접시의 유지.

4. refeed 셀 다음 날

1. Refeed 판 모든 우물을 자동된 액체 처리기를 사용 합니다. 50 µ L/s를 사용 하 여 모든 단계 pipetting 속도.
   1. 각 우물에서 100 µ L를 발음 하 고 폐기물 저수지로 그를 버리고.
   2. 잘 100 µ L/잘 미리 데워 진된 HCORT 매체와는 다른 저수지에 포함 되어 있으며 매체 수 놓입니다에 번호판의 수에 대 한 충분 한 양의 각 refeed.
   3. 4.1.1와 4.1.2 refeed 모든 셀 접시를 필요에 따라 단계를 반복 합니다.
      1. 필요에 따라 폐기물 저수지를 비어 있습니다.
      2. 필요에 따라 매체와 저수지를 리필.

5. 긍정적인 컨트롤 추가

1. Transfection 후 2 일, 2 시간 노출, 전 HFA 노출에 사용할 수를 하 고 8 행 희석 저수지의 행 B HCORT 매체에서 긍정적인 제어 cardamonin의 62.5 µ M 솔루션을 준비 합니다.
   1. CP 노출에 대 한 준비 하 고 SKF 86002의 25 µ M 솔루션을 사용 합니다.
   2. 긍정적인 통제 테스트할 번호판의 수에 대 한 충분 한 볼륨을 준비 합니다.
2. HCORT 매체 (차량 통제)에 DMSO의 0.625% 솔루션을 준비 하 고 같은 저수지의 행 C에 추가.
   1. CP 노출에 대 한 준비 하 고 DMSO의 0.5% 솔루션을 사용 합니다.
   2. 차량 제어 테스트할 번호판의 수에 대 한 충분 한 볼륨을 준비 합니다.
3. 모든 단계에 대 한 자동된 액체 처리기 우물 B7-B11 및 각 셀 플레이트의 C7-C11 긍정 및 차량 컨트롤을 추가 하 고 50 µ L/s pipetting 사용을 빠르게 사용 합니다. 미리 구성 된 팁 상자를 사용 하 여 해결만 우물 양수와 차량 제어를 받게 됩니다.
   1. B7-B11 및 C7-C11 각 셀 격판덮개의 우물에서 매체의 10 µ L을 제거 하 고 행 G와 H의 8 행 희석 저수지에 버리고.
   2. 그 우물을 긍정 및 차량 제어의 10 µ L를 전송 하 고 3 번을 혼합.
4. 인큐베이터에이 셀 접시를 반환 합니다.
5. 단계 5.3에 5.4 모든 셀 접시 양수 받은 때까지 및 차량 제어를 반복 합니다.

6. HF 노출 배양된 세포의

주의: HFA 이다 부식성 그리고 유독한 심하게입니다.

1. 더블 니트 릴 장갑, 실험실 코트, 일회용 폴 리 에틸렌 소매 프로텍터와 안전 안경을 착용 하는 화학 증기 두건에서 모든 화학 노출 작업을 수행 합니다.
   1. 48% 솔루션으로 HFA를 취득 합니다.
   2. HFA 초순와 1%로 희석 하 고 안전을 개선 하기 위해 10 mL 두꺼운 벽 폴 리 에틸렌 튜브에 5 mL aliquots에 저장 합니다.
   3. 피 펫 팁 및 HFA와 유해 폐기물 스트림의 처리 전에 2.5% 칼슘 글 루 콘 산으로 남은 모든 액체 HFA 접촉 온 저수지 오염을.
2. 조사 각 siRNA 도서관 접시 준비 0.0036 %HFA 중간 솔루션 1%의 288 µ L을 추가 하 여 HFA 80 ml 150 mL 병에 미리 데워 진된 HCORT 매체의.
   1. 병의 소용돌이 10 분 동안 화학 증기 두건에서 37 ° C 배양 기에서 희석 HFA를 품 어.
3. 병 소용돌이 의해 다시 HFA 중간 솔루션을 혼합 하 고 따뜻한 접시에 시 약 저수지에 HFA 중간 솔루션을 추가 합니다.
4. 탠덤에서 일 두 기술자 노출을 수행 합니다.
   1. 12 채널 pipettor를 사용 하 여 셀 판의 내부 우물의 각에서 오른쪽 aspirate 100 µ L에 기술자를 있고 왼쪽 접시 기술자에 전달.
   2. 왼쪽에 기술자 HFA 중간 솔루션의 당 100 µ L를 추가 했습니다.
   3. Toxicant에 노출 되는 모든 셀 접시 6.4.1-6.4.2 단계를 반복 합니다.
   4. 또한 노출 되지 않은 컨트롤 격판덮개, HFA 중간 솔루션 대신 신선한 HCORT 매체를 활용 하 여 6.4.1-6.4.2 단계를 반복 합니다.
5. 20 분에 대 한 화학 연기 후드 인큐베이터에 접시를 놓고 셀 문화 인큐베이터에 그들을 반환 합니다.
6. 일단 모든 접시는 노출 하 고 셀 문화 인큐베이터에 반환을 표시 이전 긍정적인 제어 추가 단계 (단계 5.1-5.5)를 반복 합니다.

7. CP 노출 배양된 세포의

주의: CP 심하게 독성과 자극입니다.

1. 더블 니트 릴 장갑, 실험실 코트, 일회용 폴 리 에틸렌 소매 프로텍터와 안전 안경을 착용 하는 화학 증기 두건에서 모든 화학 노출 작업을 수행 합니다.
   1. CP를 획득 합니다.
   2. 5 %DMSO CP를 희석 하 고 안전을 개선 하기 위해 10 mL 섬광 튜브에 10 mL aliquots에 저장 합니다.
   3. 피 펫 팁 및 CP와 어떤 남은 액체 CP 유해 폐기물 스트림의 처리 전에 2.5% 나트륨 중 아 황산 염과의 접촉으로 온 저수지 오염을.
2. 미리 데워 진된 HCORT 매체 노출 펜/Strep 번호판의 수에 대 한 미리 데워 공영 x 1의 충분 한 볼륨을 준비 합니다.
3. 각 탑 플레이트 설정 또는 하단 플레이트 세트에 대 한 추가 5%의 8.04 µ L 미리 데워 진 HCORT 매체와 0.0008%의 최종 CP 농도 대 한 잘 섞어 약 50 mL 수를 DMSO에 CP. 튜브를 단단히 뚜껑 하 고 1 시간에 대 한 화학 증기 두건에서 37 ° C 배양 기에서 솔루션을 품 어.
   1. 각 탑 플레이트 설정 노출 하 고 CP는 매체의 50 mL 약 수에 추가 된 후 toxicant 정확 하 게 1 h 수신 하단 플레이트 설정 매체의 50 mL aliquots에 CP의 추가 시간.
4. 셀 문화 인큐베이터에서 상단 플레이트 설정 하 고 1 노출 되지 않은 컨트롤 플레이트를 제거 하 고 화학 증기 두건 잠복기의 끝의 가까이에서 그들을 배치.
5. 튜브를 거꾸로 하 여 CP 솔루션을 믹스와 다음 가만히 따르다 그것 시 저수지에 1 시간 잠복기의 끝에.
6. 탠덤에서 일 두 기술자 노출을 수행 합니다.
   1. 12 채널 pipettor를 사용 하 여 셀 판의 내부 우물의 각에서 오른쪽 aspirate 100 µ L에 기술자를 있고 왼쪽 접시 기술자에 전달.
   2. 왼쪽에 기술자 CP 중간 솔루션의 당 100 µ L를 추가 했습니다.
   3. Toxicant에 게시 하도록 설정 하는 상단 플레이트의 모든 세포 격판덮개 7.6.1-7.6.2 단계를 반복 합니다.
   4. 또한 CP 중간 솔루션 대신 신선한 HCORT 매체를 활용 하 여 노출 되지 않은 컨트롤 번호판에 대 한 단계 7.6.1 7.6.2를 반복 합니다.
7. 10 분 동안 화학 증기 두건에서 37 ° C 배양 기에서 접시를 놓습니다.
8. PBS와 HCORT 매체 1의 충분 한 볼륨 추가 펜/Strep 시 저수지 잠복기가 10 분의 끝의 가까이 x.
9. 12 채널 pipettor를 사용 하 여 셀 격판덮개에서 CP 솔루션을 제거 하 고 PBS의 당 100 µ L 잠복기가 10 분의 끝에 그것을 바꿉니다.
10. 바로 세포 격판덮개에서 PBS를 제거 하 고 HCORT 매체 1의 당 100 µ L 펜/Strep x.
11. 또한 노출 되지 않은 컨트롤 번호판에 대 한 단계 7.9 7.10를 반복 합니다.
12. 표준 셀 문화 인큐베이터에 셀 접시를 반환 합니다.
13. 하단 플레이트 설정 단계 7.3 7.12 반복 합니다.
14. 앞에서 설명한 모든 플레이트 노출 되 고 셀 문화 인큐베이터에 반환 후 긍정적인 제어 추가 단계 (단계 5.1-5.5)를 반복 합니다.

8. 샘플 수집 및 세포 생존 능력 분석 실험

1. 노출 후 24 시간 포도 당 10 g/L를 포함 하는 PBS에 0.5 mg/mL MTT 기판의 솔루션을 준비 하 고 37 ° C²¹에 따뜻한. 각 접시 수 분석에 대 한 기판의 10 mL를 준비 합니다.
2. 접시에 분석 될 수에 대 한 자동된 액체 처리기에 저수지에 MTT 기판 솔루션의 충분 한 볼륨을 추가 합니다.
3. 모든 단계에 대 한 샘플을 수집 하 여 MTT 기판 50 µ L/s pipetting을 사용 하 여 추가 자동된 액체 처리기 속도 사용 합니다. 팁 상자 수 분석을 그 우물만을 해결 하기 위해 미리 구성 합니다.
   1. 셀 플레이트, 그리고 두 384-잘 스토리지 접시의 각 보증금 42.5 µ L의 내부 60 우물에서 aspirate 95 µ L의 중간.
   2. 즉시 셀 번호판 MTT 기판 솔루션의 당 100 µ L을 추가 하 고 1.5 h에 대 한 셀 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 그들을 품 어.
   3. MTT 기판 솔루션 필요에 따라 저수지를 리필.
4. 1 시간에 대 한 셀 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 셀 접시를 품 어.
5. 384-잘 저장 번호판 봉인 하 고 후속 분석을 위해-80 ° C에서 그들을 저장 합니다.
6. 모든 상단 및 하단 플레이트 세트와 연결 된 노출 되지 않은 컨트롤에 대 한 8.3에서 8.5 단계를 반복 합니다.
   1. 원하는, 하지만 MTT 기판 솔루션 및 집합 플레이트 사이 전환할 때 추가 하는 때 그들을 세척 하는 경우 복제 사이의 팁을 다시 사용 합니다.
7. 1 h 부 화 후 자동된 액체 처리기에 저수지에 DMSO의 충분 한 볼륨을 추가 합니다.
8. 모든 단계에 DMSO를 추가 하 여 50 µ L/s pipetting 사용 자동된 액체 처리기 속도 사용 합니다.
   1. 각 셀 접시의 내부 우물에서 100 µ L를 발음 하 고 폐기물 저수지로 MTT 기판 솔루션을 삭제.
      1. 필요에 따라 폐기물 저수지를 비어 있습니다.
   2. 각 잘 100 µ L DMSO 오버레이 합니다.
      1. 필요에 따라 DMSO 저수지를 리필.
9. 3 분 판 통에 판을 흔들어.
10. 플레이트 분 광 광도 계를 사용 하 여 570, 690 nm에서 흡 광도 측정 한다.
11. 배경 빼기 고 노출 되지 않은 컨트롤에 의해 노출 된 흡 광도 값을 나누어 % 세포 생존 능력을 계산. 평균 unexposed 부정적인 풀 siRNA 제어를 사용 하 여 모든 대상에 대 한 % 세포 생존 능력 계산 하.

9. 측정 IL-8 셀 문화 Supernatants 농도

1. 측정에는 no를 사용 하 여 셀 문화 supernatants IL-8의 농도 구슬 기반 분석 결과 제조업체의 지침²²에 따라 씻어. 분석 결과 플레이트 레이아웃을 샘플 및 표준 곡선을 만듭니다.
2. -80 ° C 냉동 고에서 384-잘 저장 플레이트를 제거 하 고 실 온에서 녹여 간단히 원심 판 우물의 아래에 샘플을 수집 하.
3. 실행 분석 결과 접시의 수에 대 한 분석 결과 버퍼는 키트에 포함 된 안티-IL-8 수락자 구슬 및 biotinylated 안티-IL-8 항 체의 충분 한 볼륨을 확인 합니다. 안티 IL8 수락자 구슬의 50 µ L 및 biotinylated 안티-IL8 항 체 분석 결과 버퍼의 9.9 ml의 50 µ L의 비율을 사용 합니다.
   1. 멀티 채널 pipettor를 사용 하 여 검은 384-잘 저장 판에 구슬/항 체의 혼합물을 추가 합니다.
      1. 샘플 및 시험 접시 레이아웃에 따라 표준 곡선에 대 한 사용 하기 위해 지정 하는 웰 스에 수락자 구슬/항 체를 추가 합니다.
      2. 잘 실행 되도록 분석 결과 접시의 수에 대 한 당 충분 한 볼륨을 추가 합니다.
4. IL-8 1000 pg/mL 354 µ M를 포함 하는 셀 문화 매체를 사용 하 여 표준 reconstitute NaCl. 실행 분석 결과 접시의 수에 대 한 충분 한 볼륨을 확인 합니다.
5. 표준 곡선의 8 개의 이중 직렬 희석을 확인 합니다.
6. 분석 결과 플레이트 레이아웃에 따라 검은 384-잘 저장 판의 적절 한 우물을 3 중에 표준 곡선을 추가 합니다. 잘 실행 되도록 분석 결과 접시의 수에 대 한 당 충분 한 볼륨을 추가 합니다.
   1. 마찬가지로, 354 µ M를 포함 하는 셀 문화 매체를 추가 NaCl 배경 측정에 대 한 아무 IL-8.
7. 분석 결과 수행 하는 자동화 된 액체 처리기를 사용 합니다. 분석 결과 플레이트 레이아웃 지정 우물만을 해결 하기 위해 미리 구성 된 팁 상자를 사용 합니다. 50 µ L/s를 사용 하 여 모든 단계 pipetting 속도.
   1. 흰색 384-잘 얕은 잘 분석 결과 격판덮개의 우물에 수락자 구슬-항 체 혼합물의 8 µ L를 전송.
      1. 샘플 및 시험 접시 레이아웃에 따라 표준 곡선에 대 한 지정 된 우물에만 추가 합니다.
   2. 분석 결과 플레이트 레이아웃에 따라 얕은 잘 분석 결과 접시의 적절 한 우물에 표준 곡선의 2 µ L를 전송.
   3. 3.54 M NaCl 솔루션을 준비 하 고 자동된 액체 처리기에 얕은 저수지에 분석에 번호판의 수에 대 한 충분 한 볼륨을 추가 합니다.
   4. 4.5 µ L NaCl 해결책의 검은 384-잘 저장 판에 샘플을 전송 하 여 표준 곡선의 일치 하는 샘플의 소금 농도 조정 합니다.
   5. 세 번 사용 하 여 혼합 볼륨 30 µ L의 샘플을 혼합 하 고 얕은 흰색 샘플의 전송 2 µ L 잘 분석 결과 분석 결과 플레이트 레이아웃에 따라 접시.
      1. 도움말 샘플 번호판 사이 변경 합니다.
   6. 실 온에서 어둠 속에서 1 시간에 품 어.
   7. 실행 분석 결과 접시의 수에 대 한 분석 결과 버퍼에서 수락자 구슬의 충분 한 볼륨을 확인 합니다. 분석 결과 버퍼의 12.3 ml 보조 수락자 구슬의 200 µ L의 비율을 사용 합니다.
   8. 멀티 채널 pipettor를 사용 하 여 보조 구슬 검은 384-잘 저장 판 추가.
      1. 샘플 및 시험 접시 레이아웃에 따라 표준 곡선에 대 한 사용 하기 위해 지정 하는 웰 스에 보조 비즈를 추가 합니다.
      2. 잘 실행 되도록 분석 결과 접시의 수에 대 한 당 충분 한 볼륨을 추가 합니다.
   9. 자동된 액체 처리기를 사용 하 여 보조 구슬의 10 µ L 흰색 384-잘 얕은 잘 분석 결과 접시의 웰 스 전송.
      1. 샘플 및 시험 접시 레이아웃에 따라 표준 곡선을 받은 우물에만 추가 하 고 각 격판덮개 사이 팁 세척.
   10. 실 온에서 어둠 속에서 다른 시간에 품 어.
8. 접시 열판을 명확 하 고 분석 결과와 호환 플레이트 리더를 사용 하 여 스캔 분석 결과 봉인. 플레이트 및 검출기, 180 여기 시간, 및 550 측정 시간 사이의 0.2 m m 거리를 사용 하 여 검색에 대 한.
9. 스프레드시트에 IL-8 분석 실험에서 원시 데이터를 가져옵니다.
10. 자동화 곡선 IL-8 분석의 표준 곡선 맞춤을 사용 하 고 pg/ml 각 샘플에 대 한 원시 데이터를 변환.

결과

노출 방법 개발

우리는 세련 하 고 HTS 연구에 사용 하기 위해 인간 각 막 상피 세포 선 SV40-HCEC의 적합성을 평가. SV40 HCEC SV 40 큰 T 항 원을 사용 하 여 불멸 하 게 했다 고 Dhanajay Pal²³에서 선물 했다. 간결 하 게, 여기 제시 노출 방법론 개발에 탐구 하는 너무 많은 변수가 있었고 그래서, 우리가 생각 하는 연구 결과의 일부 샘플 더 광범위 하 게 적용 될 수 있습니다만 여러 이용과 제공 됩니다.

스파이크 또는 매체 교환에 의해 toxicant 노출

토론

본 모델의 HF와 CP 부상 연구에 대 한 심사는 높은 처리량 각 막 상피 세포의 개발에 우리의 방법 및 결과 설명 우리. 우리는 또한 HF 부상에 대 한 기본 siRNA 화면에서 결과 제시. TIC 상해 연구를 위한 HTS 모델의 개발에 많은 도전을 했다. 우리가 셀 문화 모델에 HF, HFA 또는 CP의 연구와 관련 된 문학에서 찾을 수 있는 방법은 작은 도움의 이었다. 불 소 이온에 대부분 생체 외에서 연구 구강 세포를 포함 하 고 (대 한 몇 가지 예제 참조^28,29) 나트륨 불 화물와 HF 또는 HFA를 활용. 체 외에 노출에 기관지 상피 세포의 CP 일부 방법론 Pesonen 그 외 여러분 에 의해 게시 되었습니다. ³⁰. 궁극적으로, 우리 도전과 변수가이 유독 필요한 HTS 개발에서 연구에 관련 된의 대다수와 HF, HFA...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Bravo 리퀴드 핸드링 플랫폼	, 애질런트 또는 동급	G5409A,
Bravo 플레이트 셰이커	, 애질런트 또는 동급	옵션: 159
Bravo 96LT 일회용 팁 헤드	, 애질런트 또는 동급	옵션: 178	96채널 대형 팁 피펫팅 헤드 장치
Bravo 96ST 일회용 팁 헤드	, 애질런트 또는 동급	옵션: 177	96채널 소형 팁 피펫팅 헤드 유닛
Bravo 384ST 일회용 팁 헤드	Agilent 또는 동급	옵션 179	384 채널 소형 팁 피펫팅 헤드 유닛
Bravo 96 250 μ L 멸균 장벽 팁	Agilent 또는 동급	19477-022
Bravo 384 30 μ L 멸균 장벽 팁	Agilent 또는 동급	19133-212
Bravo 384 70 μ L 멸균 장벽 팁	Agilent 또는 동급	19133-212
EnSpire 멀티모드 플레이트 리더	Perkin Elmer 또는 동등	2300-0000	AlphaLISA 분석 검출기 고출력 레이저 여기
IL-8 (인간) AlphaLISA 검출 키트	Perkin Elmer 또는 동급	AL224F	비세척 비드 기반 분석,
ProxiPlate-384 Plus, 흰색, 384-얕은 웰 마이크로플레이트	Perkin Elmer 또는	동급의 6008359
Lipofectamine, RNAiMAX	, Invitrogen 또는 동급	13778500	Transfection 시약
Opti-MEM, 1, Reduced Serum Medium	Invitrogen 또는 동급	31985070
TrypLE Express	Gibco 또는 동급	12605010	세포 박리 용액
IncuCyte Zoom	Essen Instruments 또는 동급	ESSEN BIOSCI 4473	인큐베이터 탑재 자동 현미경
Chloropicrin	Trinity Manufacturing 또는 동급의	N/A	급성 독성 및 자극성
DMEM-F12 세포 배양 배지	Invitrogen 또는	동등한 11330-057	HEPES 함유
소 태아 혈청	Invitrogen 또는 이와 동등한	1891471
Human epidermal growth factor(세포 배양 등급)	Invitrogen 또는 이와 동등한	E9644-.2MG
재조합 인간 인슐린(세포 배양 등급)	Invitrogen 또는 동등한	12585-014
Penicillin-Streptomycin solution(세포 배양 등급)	Invitrogen 또는 이와 동등한	15140122
Hydrocortisone (세포 배양 등급)	시그마 또는 동등한	H0888-10G
포도당  (세포 배양 등급)	시그마 또는 동급	G7021
PBS  (세포 배양 등급)	Sigma 또는 동급	P5493
siRNA	Dharmacon 또는 동급	다양한
티아졸릴, 블루, 테트라졸륨 브로마이드	, Sigma 또는 동급	M5655	MTT 분석 기질
siRNA 완충액	, Thermo 또는 동급	B002000
96웰 세포 배양 플레이트	Corning 또는 동급	CLS3595
T150 세포 배양 플라스크	Corning 또는 동급	CLS430825
BSL-2 세포 배양 후드	Nuaire 또는 동급	NU-540
300 mL 로봇 저장 탱크	Thermo 또는 동급	12-565-572
96개의 배플 자동화 저장소	Thermo 또는 동급	1064-15-8
500mL 멸균 일회용 보관 병	Corning 또는 동급	CLS430282
Microplate 히트 씰러	Thermo 또는 동급	AB-1443A
Microplate 열 밀봉 호일	Thermo 또는 동급	AB-0475
Cardamonin	Tocris 또는 동등한	2509	항염증제, 양성 대조군으로 사용
SKF 86002	Tocris 또는 이에 상응하는	2008	항염증제, 양성 대조군으로 사용
	DMSO 시그마 또는 동급	D8418
48% 불화 수소산	시그마 또는 동급	339261	부식성 및 급성 독성
1000 μ L 단일 채널 피펫터	Rainin 또는 동급	17014382
200 μ L 단일 채널 피펫터	Rainin 또는 이에 상응하는	17014391
20 μ L 단일 채널 피펫터	Rainin 또는 이에 상응하는	17014392
1000 μ L 12채널 피펫터	Rainin 또는 동급	17014497
200 μ L 12채널 피펫터	Rainin 또는 동급	17013810
20 μ L 12채널 피펫터	Rainin 또는 동급	17013808
피펫터 팁 1000 μ L	Rainin 또는 동급	의 17002920
피펫터 팁 200 μ L	Rainin 또는 동급	의 17014294
피펫터 팁 20 μ L	Rainin 또는 동급	17002928
화학 흄 후드	Jamestown Metal Products	MHCO_229
384웰 시료 보관 플레이트	Thermo 또는 동급	262261
염화나트륨	Sigma 또는 동급	S6191
50 mL 코니컬 튜브	Thermo 또는 동급	14-959-49A
혈청학 피펫 50 mL	Corning 또는 동급	07-200-576
혈청학적 피펫 25mL	Corning 또는 동급	07-200-575
혈청학적 피펫 10mL	Corning 또는 동급	07-200-574
혈청학적 피펫 5mL	Corning 또는 동급	07-200-573
SV40-HCEC 불멸화 인간 각막 상피 세포	N/A	N/A	이러한 세포는 상업적으로 이용 가능하지 않지만,
Sceptor Handheld Automated Cell Counter	Millipore 또는 GeneTitan
	급	00-0372
Affymetrix 24 및 96-array plates	Affymetrix 또는 동급의	901257; 901434
Draegger 논문에 인용된 연구자로부터 얻을 수 있습니다. tube HF	Draeger 또는 동급	8103251
Draegger tube CP	Draeger 또는 동급	의 8103421
Draegger 펌프	Draeger 또는 동급	6400000
Clear Plate seal,	Resesarch Products International 또는 동급	의
시약 저장용기	VistaLab Technologies 또는 동급	3054-1000
Xlfit	IDBS 또는 이에 상응하는	N/A	Excel 애드인으로 자동 곡선 피팅에 사용됨