높은 처리량 작은 금지 RNA 검사 화학 각 막 상피 상해의 분자 메커니즘을 더 빠르게 명료를 도울 수 있는 중요 한 도구입니다. 여기, 우리는 개발 및 노출 모델 및 각 막 상피 부상 수소 불 화물 그리고 chloropicrin 유도의 높은 처리량 검열 방법의 유효성 검사 제시.
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방법 논문
Chloropicrin 및 수소 불 화물 유발 각 막 상피 세포 상해에 대 한 높은 처리량 SiRNA 심사
이 논문에서
요약
초록
Toxicant 유도 눈 부상 화학 빠르게 상당한 조직 손상을 입힐 잠재력을가지고 있기 때문에 진정한 눈 비상 이다. 아무 특정 치료제가이 부상 치료 존재 toxicant 유발 각 막 부상에 대 한 치료는 일반적으로 지원. 치료 및 노출에 대 한 관심에 치료제를 개발 하는 노력, 그것은이 상해의 분자 및 세포 메커니즘을 이해 하는 것이 중요 수. 있습니다 우리는 높은 처리량 작은 금지 RNA (siRNA) 심사의 활용 화학 각 막 상피 상해의 분자 메커니즘을 더 빠르게 명료를 도울 수 있는 중요 한 도구가 될 수 있습니다 제안 합니다. siRNA는 siRNA에 상 동을가지고 있는 19-25의 뉴클레오티드 긴 mRNA를 저하 하는 통로 입을 post-transcriptional 유전자를 활용 더블 좌초 RNA 분자는. 특정 유전자의 표현의 결과 감소는 toxicant에 세포질 응답에 그 유전자의 기능을 확인 toxicant 노출된 셀에 다음 공부 수 있습니다. 개발 및 체 외에 노출 모델 및 수소 불 화물 (HF) 및 chloropicrin (CP) 유도 눈 부상 (HTS)을 상영 하는 높은 처리량 방법의 유효성 검사는이 문서에 표시 됩니다. 하지만 우리는 이러한 두 가지 유독 선택, 우리의 방법 toxicant 노출 프로토콜에 사소한 수정 다른 유독의 연구에 적용 됩니다. SV40 큰 T 항 원 SV40 HCEC 연구에 대 한 선정 되었다 인간 각 막 상피 세포 선 불후. 세포 생존 능력 및 IL-8 생산 심사 프로토콜에서 끝점으로 선정 됐다. Toxicant 노출의 개발와 관련 된 몇 가지 과제 고 셀 문화 방법 HTS 연구에 대 한 적합 한 표시 됩니다. 이 유독 HTS 모델 설립 화학 눈 부상에 대 한 잠재적인 치료에 대 한 화면을 상해의 메커니즘을 이해 하기 더 연구에 대 한 수 있습니다.
서론
Toxicant 유도 눈 부상 화학 빠르게 상당한 조직 손상을 입힐 잠재력을가지고 있기 때문에 진정한 눈 비상 이다. 불행 하 게도, 아니 특정 치료제가이 부상 치료 존재에 toxicant 유발 각 막 부상에 대 한 치료 일반적으로 지원만 있습니다. 현재 치료 전략 일반적인 주로 같은 윤활제, 항생제, 국 소 치료 요법을 포함 하 고 cycloplegics 뒤에 소염제 (예를 들어, 스테로이드) 한 번 각 막1 epithelialized 다시 있다 ,2. 최고의 현재 치료 치료 옵션을 사용할에 불구 하 고 장기적인 예 후는 일반적으로 진보적인 각 막 흐려 및 neovascularization2,3가난.
동물 모델 화학 독성을 조사 하 고 상해의 메커니즘을 이해를 전통적으로 사용 되어 왔습니다. 그러나, 동물 연구는 시간이 소모 되 고 비싸다. 노력을 줄이기 위해 동물 실험도 있다. 예를 들어 유럽 연합에 도달 법안 (EC 1907/2006)를 동물 실험을 줄이기 위한 규정 있다. 규정 회사 동물 테스트 및 동물에 제안....
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프로토콜
1. 세포 문화 유지 보수
- 37 ° C, 5% CO2, 그리고 15% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)과 DMEM F-12에서 90% 습도에서 셀 라인 SV40-HCEC 성장 1 %L-글루타민, 10 µ g/L 표 피 성장 인자 (EGF), 그리고 5 mg/L 인슐린.
- 셀 라인 (시드 밀도)에 따라 3 ~ 4 일 마다 그 confluency는 결코 문화 유지 관리 중 80%를 초과 하도록 통로.
- 플라스 크를 사용 하 여 분리 솔루션 (모든 150 c m2 플라스 크에 대 한 14 mL 해결책)와 부 화 37 ° C에서 8 분 더 이상으로 보다에서 세포를 분리 합니다.
- 세포 배양의 동등한 양으로 분리 솔루션을 무력화 하 고 160 x g에 7 분 동안 원심 분리 하 여 50 mL 원뿔 튜브에 세포를 작은.
- 다시 중간 마다 150 c m2 플라스 크 (20 mL)에 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다.
- 자동된 휴대용 셀 카운터와 씨앗 80 %confluency 초과 하지 않고 3 ~ 4 일 동안 성장할 수 있도록 하는 밀도에 새로운 플라스 크에 세포를 계산 합니다.
2. 플레이트 세....
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결과
노출 방법 개발
우리는 세련 하 고 HTS 연구에 사용 하기 위해 인간 각 막 상피 세포 선 SV40-HCEC의 적합성을 평가. SV40 HCEC SV 40 큰 T 항 원을 사용 하 여 불멸 하 게 했다 고 Dhanajay Pal23에서 선물 했다. 간결 하 게, 여기 제시 노출 방법론 개발에 탐구 하는 너무 많은 변수가 있었고 그래서, 우리가 생각 하는 연구 결과의 일부 샘플 더 광범위 하 게 적용 될 수 있습니다만 여러 이용과 제공 됩니다.
스파이크 또는 매체 교환에 의해 toxicant 노출
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토론
본 모델의 HF와 CP 부상 연구에 대 한 심사는 높은 처리량 각 막 상피 세포의 개발에 우리의 방법 및 결과 설명 우리. 우리는 또한 HF 부상에 대 한 기본 siRNA 화면에서 결과 제시. TIC 상해 연구를 위한 HTS 모델의 개발에 많은 도전을 했다. 우리가 셀 문화 모델에 HF, HFA 또는 CP의 연구와 관련 된 문학에서 찾을 수 있는 방법은 작은 도움의 이었다. 불 소 이온에 대부분 생체 외에서 연구 구강 세포를 포함 하 고 (대 한 몇 가지 예제 참조28,29) 나트륨 불 화물와 HF 또는 HFA를 활용. 체 외에 노출에 기관지 상피 세포의 CP 일부 방법론 Pesonen 그 외 여러분 에 의해 게시 되었습니다. 30. 궁극적으로, 우리 도전과 변수가이 유독 필요한 HTS 개발에서 연구에 관련 된의 대다수와 HF, HFA.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
면책 조항:이 문서에 표현 들 저자와 군대의 부, 국방부, 또는 미국 정부의 공식 정책 반영 하지 않습니다. 이 연구는 NIH/NIAID 사이의 USAMRICD, 부처간의 합의 의해 지원 되었고 일부 대학원 연구 참여 프로그램에는 미국 육군 의료 연구 연구소의 화학 방어에 약속에 의해 오크에 의해 관리 릿지 연구소 과학 미국 에너지 부와 USAMRMC 사이의 부처간 합의 통해 교육에 대 한.
감사의 글
이 연구로는 국립 연구소의 건강 중화 프로그램 부처간 계약 # AOD13015-001 지원 되었다. 우리는 그들의 노력과 전문 비디오 제작에 대 한 스테파니 Froberg 피터 허스트를 감사 하 고 싶습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Bravo 리퀴드 핸드링 플랫폼 | , 애질런트 또는 동급 | G5409A, | |
| Bravo 플레이트 셰이커 | , 애질런트 또는 동급 | 옵션: 159 | |
| Bravo 96LT 일회용 팁 헤드 | , 애질런트 또는 동급 | 옵션: 178 | 96채널 대형 팁 피펫팅 헤드 장치 |
| Bravo 96ST 일회용 팁 헤드 | , 애질런트 또는 동급 | 옵션: 177 | 96채널 소형 팁 피펫팅 헤드 유닛 |
| Bravo 384ST 일회용 팁 헤드 | Agilent 또는 동급 | 옵션 179 | 384 채널 소형 팁 피펫팅 헤드 유닛 |
| Bravo 96 250 μ L 멸균 장벽 팁 | Agilent 또는 동급 | 19477-022 | |
| Bravo 384 30 μ L 멸균 장벽 팁 | Agilent 또는 동급 | 19133-212 | |
| Bravo 384 70 μ L 멸균 장벽 팁 | Agilent 또는 동급 | 19133-212 | |
| EnSpire 멀티모드 플레이트 리더 | Perkin Elmer 또는 동등 | 2300-0000 | AlphaLISA 분석 검출기 고출력 레이저 여기 |
| IL-8 (인간) AlphaLISA 검출 키트 | Perkin Elmer 또는 동급 | AL224F | 비세척 비드 기반 분석, |
| ProxiPlate-384 Plus, 흰색, 384-얕은 웰 마이크로플레이트 | Perkin Elmer 또는 | 동급의 6008359 | |
| Lipofectamine, RNAiMAX | , Invitrogen 또는 동급 | 13778500 | Transfection 시약 |
| Opti-MEM, 1, Reduced Serum Medium | Invitrogen 또는 동급 | 31985070 | |
| TrypLE Express | Gibco 또는 동급 | 12605010 | 세포 박리 용액 |
| IncuCyte Zoom | Essen Instruments 또는 동급 | ESSEN BIOSCI 4473 | 인큐베이터 탑재 자동 현미경 |
| Chloropicrin | Trinity Manufacturing 또는 동급의 | N/A | 급성 독성 및 자극성 |
| DMEM-F12 세포 배양 배지 | Invitrogen 또는 | 동등한 11330-057 | HEPES 함유 |
| 소 태아 혈청 | Invitrogen 또는 이와 동등한 | 1891471 | |
| Human epidermal growth factor(세포 배양 등급) | Invitrogen 또는 이와 동등한 | E9644-.2MG | |
| 재조합 인간 인슐린(세포 배양 등급) | Invitrogen 또는 동등한 | 12585-014 | |
| Penicillin-Streptomycin solution(세포 배양 등급) | Invitrogen 또는 이와 동등한 | 15140122 | |
| Hydrocortisone (세포 배양 등급) | 시그마 또는 동등한 | H0888-10G | |
| 포도당 (세포 배양 등급) | 시그마 또는 동급 | G7021 | |
| PBS (세포 배양 등급) | Sigma 또는 동급 | P5493 | |
| siRNA | Dharmacon 또는 동급 | 다양한 | |
| 티아졸릴, 블루, 테트라졸륨 브로마이드 | , Sigma 또는 동급 | M5655 | MTT 분석 기질 |
| siRNA 완충액 | , Thermo 또는 동급 | B002000 | |
| 96웰 세포 배양 플레이트 | Corning 또는 동급 | CLS3595 | |
| T150 세포 배양 플라스크 | Corning 또는 동급 | CLS430825 | |
| BSL-2 세포 배양 후드 | Nuaire 또는 동급 | NU-540 | |
| 300 mL 로봇 저장 탱크 | Thermo 또는 동급 | 12-565-572 | |
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| 500mL 멸균 일회용 보관 병 | Corning 또는 동급 | CLS430282 | |
| Microplate 히트 씰러 | Thermo 또는 동급 | AB-1443A | |
| Microplate 열 밀봉 호일 | Thermo 또는 동급 | AB-0475 | |
| Cardamonin | Tocris 또는 동등한 | 2509 | 항염증제, 양성 대조군으로 사용 |
| SKF 86002 | Tocris 또는 이에 상응하는 | 2008 | 항염증제, 양성 대조군으로 사용 |
| DMSO 시그마 또는 동급 | D8418 | ||
| 48% 불화 수소산 | 시그마 또는 동급 | 339261 | 부식성 및 급성 독성 |
| 1000 μ L 단일 채널 피펫터 | Rainin 또는 동급 | 17014382 | |
| 200 μ L 단일 채널 피펫터 | Rainin 또는 이에 상응하는 | 17014391 | |
| 20 μ L 단일 채널 피펫터 | Rainin 또는 이에 상응하는 | 17014392 | |
| 1000 μ L 12채널 피펫터 | Rainin 또는 동급 | 17014497 | |
| 200 μ L 12채널 피펫터 | Rainin 또는 동급 | 17013810 | |
| 20 μ L 12채널 피펫터 | Rainin 또는 동급 | 17013808 | |
| 피펫터 팁 1000 μ L | Rainin 또는 동급 | 의 17002920 | |
| 피펫터 팁 200 μ L | Rainin 또는 동급 | 의 17014294 | |
| 피펫터 팁 20 μ L | Rainin 또는 동급 | 17002928 | |
| 화학 흄 후드 | Jamestown Metal Products | MHCO_229 | |
| 384웰 시료 보관 플레이트 | Thermo 또는 동급 | 262261 | |
| 염화나트륨 | Sigma 또는 동급 | S6191 | |
| 50 mL 코니컬 튜브 | Thermo 또는 동급 | 14-959-49A | |
| 혈청학 피펫 50 mL | Corning 또는 동급 | 07-200-576 | |
| 혈청학적 피펫 25mL | Corning 또는 동급 | 07-200-575 | |
| 혈청학적 피펫 10mL | Corning 또는 동급 | 07-200-574 | |
| 혈청학적 피펫 5mL | Corning 또는 동급 | 07-200-573 | |
| SV40-HCEC 불멸화 인간 각막 상피 세포 | N/A | N/A | 이러한 세포는 상업적으로 이용 가능하지 않지만, |
| Sceptor Handheld Automated Cell Counter | Millipore 또는 GeneTitan | ||
| 급 | 00-0372 | ||
| Affymetrix 24 및 96-array plates | Affymetrix 또는 동급의 | 901257; 901434 | |
| Draegger 논문에 인용된 연구자로부터 얻을 수 있습니다. tube HF | Draeger 또는 동급 | 8103251 | |
| Draegger tube CP | Draeger 또는 동급 | 의 8103421 | |
| Draegger 펌프 | Draeger 또는 동급 | 6400000 | |
| Clear Plate seal, | Resesarch Products International 또는 동급 | 의 | |
| 시약 저장용기 | VistaLab Technologies 또는 동급 | 3054-1000 | |
| Xlfit | IDBS 또는 이에 상응하는 | N/A | Excel 애드인으로 자동 곡선 피팅에 사용됨 |
참고문헌
- Randleman, B. Drugs, Diseases and Procedures. Hampton, R. , Medscape. (2011).
- Fish, R., Davidson, R. S. Management of ocular thermal and chemical injuries, including amniotic membrane therapy. Current Opinion in Ophthalmology. 21 (4), 317-321 (2010).
- Wang, X.
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