조직의 최소 금액을 사용 하 여 초파리의 Permeabilized 섬유에 미토 콘 드리 아 산소 소비량의 측정

요약

이 논문에서 초파리의 permeabilized 직업적인의 고해상도 respirometry를 사용 하 여 산소 소비량을 측정 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 조직의 고전적인 미토 콘 드 리아 격리 기술에 비해 최소한의 금액을 요구 하 고 얻은 결과 더 순수 관련.

초록

과일 파리, 초파리 melanogaster, 물질 대사 연구에 대 한 새로운 모델을 나타냅니다. 실제로, 초파리 인간의 장기에 동종 구조, 높은 보존된 대사 경로가지고 있고 시간의 짧은 기간에 다른 근본적인 메커니즘의 연구를 수 있는 비교적 짧은 수명을. 그러나 그것은,, 그 세포 신진 대사, 미토 콘 드리 아 호흡에 필수적인 메커니즘 중 하나는 되어 철저 하 게 조사 하지이 모델에 놀라운. 초파리에서 미토 콘 드리 아 호흡의 측정 일반적으로 개인의 매우 많은 수를 요구 하 고 얻은 결과 매우 재현할 수 있기 때문에 가능성이 높습니다. 여기, 조직 초파리에서의 최소한의 금액을 사용 하 여 미토 콘 드리 아 산소 소비량의 정확한 측정을 허용 하는 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 직업적인 해 부 이며 모두 기계적으로 날카로운 집게와 화학적 사포닌, 교차 하는 세포 막, 미토 콘 드리 아 호흡을 조절 하는 다른 화합물을 수 있도록 permeabilized. Permeabilization, 후 프로토콜 여러 억제제에는 uncoupler에 그들의 응답에 뿐만 아니라 다른 기판 산화 전자 교통 시스템 (ETS)의 다른 단지의 용량을 평가 하기 위해 수행 됩니다. 이 메서드는 미토 콘 드리 아 아직 다른 세포질 구성 요소와 상호 작용 하기 때문에 미토 콘 드 리아 형태 보존 더 순수 관련으로 미토 콘 드 리아 격리를 사용 하 여 방법에 비해 많은 장점을 제공 합니다. 또한, 샘플 준비는 빠르게, 그리고 얻은 결과 매우 재현. 미토 콘 드리 아 호흡의 평가와 물질 대사 연구에 대 한 모델 초파리의 장점을 결합 하 여 새로운 통찰력 공개, 될 수 있는 중요 한 특히 때 파리 발생 하는 다른 환경 또는 병 태 생리 조건입니다.

서론

과일 파리, 초파리 melanogaster 사용 되었습니다 모델 생물으로 서 유전자 연구에 대 한¹세기 이상. 이 유 기체의 연구만 sex-linked 상속², 돌연변이 속도³, 신경 시스템의 개발 및 세포 운명 결정⁴에 대 한 중요 한 기초 지식을 주도 하지 않은 하지만 또한 최근 등장으로 Alzheimer와 Parkinson의^5,6등 여러 질병에 고유의 메커니즘을 연구를 유용한 도구입니다. 또한, 그들은 시간의 짧은 기간 동안 많은 수에서 올려질 수 있고 짧은 수명으로 노화 과정을 공부 하는 인기 있는 모델입니다. 그들은 또한 인간의 장기는 심장, oenocytes (hepatocyte 같은 셀), 지방 기관 (간 및 백색 지방 조직으로 유사 하 게 작동), 인슐린 생산 세포 (췌 장 β 세포에 해당), 동종 구조를가지고 뿐만 아니라 hemolymph 수송 대사 산물 (척추 동물의 혈액과 유사)⁷. 또한, 중앙 통로 중간 대사 (인슐린/인슐린 같은 성장 인자....

프로토콜

1. 시 약 준비

1. 해 부 및 조직의 permeabilization에 대 한 다음 솔루션을 준비 합니다.
   1. 보존 솔루션 준비: 2.77 m m 케이크₂EGTA, 7.23 m K m₂EGTA, 5.77 m m 나₂ATP, 6.56 m m MgCl₂, 황소자리, 20 mM 15 mM 나₂phosphocreatine, 이미 20 m m, 0.5 m m dithiothreitol, 그리고 50mm K-MES, pH 7.1 (저장 될 수 있다 -20 ° C).
   2. 사포닌 솔루션 준비: 보존 솔루션의 1 mL에 사포닌의 5 밀리 그램 (신선한 매일 준비).
2. 호흡의 측정에 대 한 다음 솔루션을 준비 합니다.
   1. 호흡 매체 준비: 120 m m KCl, 5mm KH₂포₄, 3 mM HEPES, 1mm EGTA, 1 mM MgCl₂및 0.2 %BSA (w/v), pH 7.2.
   2. 기판, uncoupler, 억제제를 준비 합니다. H₂O, 모든 기질을 녹이 고 에탄올 (malonate는 H₂O 희석)를 제....

결과

위에 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 미토 콘 드리 아 산소 소비의 대표 추적 그림 2에 제공 됩니다. Pyruvate와 malate permeabilized 근육 섬유 함께 챔버에 주입 이라고 CI 누출 호흡, 즉, 복잡 한 ETS의은 의해 자극 하는 경우는 NADH 생산 pyruvate와 통해 malate의 산화는 tricarboxylic 산 주기 (CI)입니다. 이 호흡 속도 동안 미토 콘 드 리아 산소 주로 ATP synthase 활성화 (누출)³⁰때 미토 콘 드리 아를, intermembrane 공간에서 교차 하는 양성자 양성자 누출, 즉에 대 한 보상 유지 됩니다. ADP, ATP synthase 활성화 하며 전자 전송 때 I (CI-OXPHOS), ATP에 ADP의 동시 인 산화와 복잡 한 4 인 미토 콘 드 리아 산소 소비를 증가.......

토론

이 연구에서는 초파리에서 미토 콘 드리 아 산소 소비량의 측정 전에 샘플 준비 하는 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 기간 및 필요한 개인의 수의 점에서 특히 미토 콘 드리 아 격리를 사용 하 여 프로토콜에 관련 된 다른 문제를 극복 하기 위해 개발 되었다. 일반적으로 조직의 여러 개인에 게 서 얻은 큰 금액을 요구 하는 미토 콘 드 리아 격리 사용 대신,이 실험에서 몇 초파리의 직업적인 permeabilized 근육 섬유에 수행 됩니다. 이 프로토콜에만 3 개인 최적의 결과를 표시할 필요 합니다. 따라서, 다양 한 시간 포인트에서 미토 콘 드리 아 산소 소비량의 측정으로 동기화 하는 데 같은 나이의 같은 섹스의 작은 그룹을 더 달성 가능 하다.

첫째, 그것은 같은 나이, 성별, 스트레인의 초파리를 사용 하는 것이 중요 하 고 결과 (그림 6), 낮은 분포도를 동일한 조건에서 제기 호흡 나이, 성별, 유전자 형, 그리고 파리의 다이어트와 함께 변경할.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
고해상도 호흡기 측정기 Oxygraph O2K	Oroboros Instruments, 인스브루크, 오스트리아	10022-02	스타트업 O2K 호흡계 키트
O2K-적정 세트	Oroboros Instruments, 인스브루크, 오스트리아	20820-03	다양한 볼륨의 Hamilton 주사기
Datlab 소프트웨어	Oroboros Instruments, 인스브루크, 오스트리아	20700	데이터 수집 및 분석용 소프트웨어
세밀한 팁이 있는 항자성 펜치	VWR	82027-400
Secura225D-1S-DQE	Sartorius AG, Goettingen, Germany		Semi-micro balance (여러 회사에서 배포)
Drosophila melanogaster 야생형 w1118	Bloomington Drosophila 재고 센터, IN, USA		br/> 저장 조건: 24 ° C
에틸렌 글리콜 -비스 (2- 아미노 에틸 에테르) -< > N < / em>, N< / em>, N < / em> ′ , N< / em> 프라임 테트라 아세트산	Sigma-Aldrich	E4378	EGTA 보관 조건 : RT
KOH	Sigma-Aldrich	P1767	주의 : 금속 부식성, 급성 독성, 피부 부식, 심각한 눈 손상, 급성 수생 독성. 저장 조건: RT
CaCO3	Sigma-Aldrich	C4830	저장 조건: RT
Na2ATP	Sigma-Aldrich	A2383	저장 조건: -20 ° C
MgCl2.6H2O	Sigma-Aldrich	M9272	저장 조건: RT
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625	저장 조건: RT
Na2Phosphocreatine	Sigma-Aldrich	P7936	저장 조건: -20 ° C
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513	저장 조건: RT
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D0632	저장 조건: 2-8 ° C
MES 수화물	Sigma-Aldrich	M8250	보관 조건:
퀼라야 껍질에서 추출한 RT 사포닌	Sigma-Aldrich	S7900	Saponin 보관 조건: RT 용액 준비: 보존 용액 1mL에 5mg. 매일 신선하게 준비하십시오.
KCl	Sigma-Aldrich	P9541	저장 조건: RT
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P9791	저장 조건: RT
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	저장 조건: RT
BSA	Sigma-Aldrich	05470	저장 조건: 2-8 ° C
Na2S2O4	Sigma-Aldrich		157953 디티오나이트나트륨. 주의: 자체 발열 물질 및 혼합물, 급성 독성, 급성 수생 독소 만성 수생 독성. 저장 조건: RT
나트륨 피루브산	시그마-알드리치	P2256	피루브산 저장 조건: 2-8 ° C 용액 준비: MilliQ 물에서. 매일 신선하게 준비하십시오.
L-(-)-말산	Sigma-Aldrich	M1000	Malate 보관 조건: RT 용액 준비: MilliQ 물에서. KOH로 중화하고 -20°C에서 보관하십시오.
아데노신 5'-디포스페이트 모노칼륨 염 수화물	시그마-알드리치	A5285	ADP 저장 조건: -20 ° C 용액 준비: MilliQ 물에서. KOH로 중화하고 -80°C에서 보관합니다.
말의 심장에서 추출한 사이토크롬 c	Sigma-Aldrich	C7752	사이토크롬 c 저장 조건: -20 ° C 용액 준비: MilliQ 물에서. -20 °C에서 보관하십시오.
L-프롤린	시그마-알드리치	P0380	프롤린<브르/> 보관 조건: RT 용액 준비: MilliQ 물에서. -20 °C에서 보관하십시오.
나트륨 숙시 네이트 이염 기성 육수 화물	시그마 - 알드리치	S2378	숙시 네이트 < / > 보관 조건 : RT 용액 준비 : MilliQ 물에서. HCl로 중화하고 -20°C에서 보관하십시오.
sn-글리세롤 3-인산 비스(시클로헥실암모늄) 염	시그마-알드리치	G7886	글리세롤-3-인산 저장 조건: -20 ° C 용액 준비: MilliQ 물에서. HCl로 중화하고 -80°C에서 보관하십시오.
카르보닐 시안화물 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존	, 시그마-알드리치	C2920	FCCP. 주의 : 급성 독성, 피부 민감성, 만성 수생 독성. 보관 조건 : RT 용액 준비 : 절대 에탄올. -20°C의 유리병에 보관하십시오.
로테논	시그마-알드리치	R8875	주의: 급성 독성, 피부 자극성, 눈 자극성, 특정 표적 장기 독성(호흡 시스템), 급성 수생 독성, 만성 수생 독성. 용액 준비: 절대 에탄올. -20°C의 어두운 바이알에 보관하십시오.
말론산	시그마-알드리치	M1296	말로네이트. 주의: 급성 독성, 심각한 눈 손상. 보관 조건: RT 용액 준비: MilliQ 물에. KOH로 무력화하세요. 매일 신선하게 준비하십시오.
Streptomyces sp의 안티마이신 A.	시그마-알드리치	A8674	안티마이신 A. 주의: 급성 독성, 급성 수생 독성, 만성 수생 독성. 저장 조건: -20 ° C 용액 준비: 절대 에탄올. -20 °C에서 보관하십시오.
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine	Sigma-Aldrich	T7394	TMPD 저장 조건: RT 용액 준비: MilliQ 물에서. 어두운 유리병에 보관하십시오. -20 °C.
(+)-나트륨 L-아스코르브산염	시그마-알드리치	A4034	아스코르브산염 보관 조건: RT 용액 준비: MilliQ 물에서. 어두운 유리병에 보관하십시오. -20 °C.
NaN3	Sigma-Aldrich	S2002	아지드화나트륨. 주의: 급성 독성(구강 및 피부), 특정 표적 장기 독성(뇌), 수생 독성, 만성 수생 독성.  용액 준비: MilliQ 물에서. -20 °C에서 보관하십시오.

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