Method Article

멀티플렉스 인공 세포 MicroEnvironment 배열의 제작

DOI:

10.3791/57377

⸱

September 7th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Integrated Cell-Material Sciences (WPI-iCeMS), Kyoto University, 2Department of Life Science and Technology, School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology, 3Biomaterials Center for Regenerative Medical Engineering, Foundation for Advancement of International Science, 4Faculty of Science and Natural Resources, Universiti Malaysia Sabah, 5Institute for Chemical Research, Kyoto University, 6Ecole Normale Supérieure

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 문서에서는 물리와 화학의 높은 처리량 조작 신호 세포 microenvironments vivo에서 흉내 낸 고을 다중화 인공 세포 MicroEnvironment (MACME) 배열 준비 하 상세한 방법론 단일 셀 프로 파일링 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)를 위한 최적의 휴대폰 환경을 식별 합니다.

Abstract

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단서, 성장 인자, 세포 외 매트릭스, 세포 상호 작용 등의 다양 한 세포 microenvironments에 의하여 이루어져 있다. 이러한 신호 잘 조율 된 그리고 생활 시스템에서 세포 기능 조절에 중요 한. 연구자의 숫자는 환경 요인과 원하는 세포 기능 간의 상관 관계를 조사 하려고 했습니다, 많은 알 수 없는 남아 있다. 이것은 같은 환경 신호에 vitro에, 모방 하 고 셀에 다른 환경 신호를 테스트 하는 동시에 적절 한 방법론의 부족 때문에 크게 이다. 여기, 우리는 미세 채널 및 높은 콘텐츠 단일 셀 분석, 줄기 세포 고기 다른 환경 요인에 의해 변경 될 검사를 다음 nanofiber 배열의 통합된 플랫폼을 보고 합니다. 설명 하기 위해이 플랫폼의 응용 프로그램,이 연구는 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs) 자기 갱신의 고기에 집중 한다. 여기, 우리 다중화 인공 세포 MicroEnvironment (MACME) 배열의 제작에 nanofiber 배열 및 미세 구조에 대 한 준비 절차를 제시. 또한, 프로 파일링, 여러 형광 마커, 여러 형광 이미징, 그리고 통계 분석, 얼룩 셀 단일 셀의 전체 단계 설명 합니다.

Introduction

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인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)1,2 자체 unlimitedly 확장 한다 갱신 하 고 신약 개발, 세포 기반 치료, 조직 공학 및 재생 의학 혁명을 수 있는 다양 한 조직 혈통으로 차별화 3 , 4 , 5 , 그러나 6. 일반 문화 요리와 결정 판,, 세포 확장을 위한 중요 한 요소는 정확한 물리적, 화학적 셀 조작 범위의 나노를 마이크로-미터, 세포 수준에서 사용 하도록 설계 되지 않았습니다 셀프-갱신, 그리고 감 별 법입니다. 이 단점을 해결 하기 위해 연구 세포 운명 결정 및 셀 기능4규제에 세포 microenvironments의 역할 조사 했습니다. 최근 몇 년 동안, 연구의 증가7,8 체 외에서세포 microenvironments를 재구성 하기 위해 실시 되었습니다. 나노 및 마이크로 ....

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Protocol

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1입니다. MACME 배열의 제작

참고: 모든 재료와 장비 자료 테이블에 나열 됩니다.

  1. 마스크의 nanofiber 배열 및 미세 구조에 대 한 금형에 대 한 준비
    1. Nanofiber 배열 및 3D 컴퓨터 그래픽 소프트웨어 패키지 (표 1)를 사용 하 여 미세 구조에 대 한 금형에 사용 되는 마스크의 3 차원 (3D) 이미지를 만듭니다.
      참고: 3D 이미지는 읽었고 3D 프린터에서 인쇄. 인쇄 마스크와 금형 단계 1.1.1에서 그래픽 소프트웨어를 사용 하 여 정의 하는 3 차원 이미지와 같은 크기 있다.
    2. 인쇄 마스크와 3 차원 프린터를 사용 하 여 이러한 설계에 따라 금형.
      참고: 이 프로토콜에서 UV 경화 수 지와 잉크 제트 같은 3D 프린터 사용된30이었다. 그러나 프린터 해상도 635 × 400 dpi 및 15 µ m x, Y 및 Z, 각각,, 실제 X Y 해상도 약 4 배 낮 았다.
  2. Nanofiber 배열 준비 (

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Results

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MACME 배열: 설계 및 제조: Nanofiber 기술 함께, 우리는 미세 세포 배양 및 심사 기술을 이전 hPSC 자체 갱신 또는 차별화35,36 (그림 1)에 대 한 최적의 조건을 식별 하기 위해 사용. 이것은 세포 배양 챔버와 조건을 정확 하 게 제어 하 고 확장 가능한42,,4344때문에 강력한 높은 처리량 세포 기반 분석을 설정 하는 데 적합. 여기, nanofiber 배열 간단한 nanofiber 증 착 방법, 3D 인쇄 마스크와 전기에 의해 준비 되었다. 미세 부품 쉽게 많은 시련과 오류를 통해 챔버 구조.......

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Discussion

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이 프로토콜 자격 갖춘된 hPSCs의 유지 보수에 대 한 강력한 문화 시스템 구축 첫 번째 심사 메서드를 보여 줍니다. 첫째, 우리는 다양 한 인공 소프트웨어와 통합 nanofiber 배열, MACME 배열 된 미세 장치를 사용 하 여 밀도 시드 셀 플랫폼을 준비 하는 방법을 설명 합니다. 두 번째, 양적 이미지 기반 단일 셀 형질 개별 세포 결과 및 다른 생 화 확 및 생물 기능에 의해 변경 하는 동작 수행된50 이었다. 이 프로토콜에서 GT nanofiber 시드 밀도 높은 초기 세포의 상태에 긍정적인 제어 ECM 단백질의 구성 된 환경 undifferentiated 상태;의 기능 특징 이었다 급속 한 확산45 와 안정적인 OCT4 식51. 이 관측은 "세포-기질" 및 "셀" 상호 작용 하는 분자 메커니즘 hPSCs의 pluripotency 영향을 미칠 수 표시.

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Acknowledgements

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우리는 인간의 ES 세포를 제공 하기 위한 iCeMS, 교토 대학에서 교수 N. 辻를 감사 합니다. 우리는 또한 감사 교수 A. 마루야마 도쿄 기술 연구소에서 원자 힘 현미경의 사용에 그의 지원에 대 한. 자금 아낌없이 제공 했다 일본 사회 과학의 프로 모션에 대 한 (JSP; 22350104, 23681028, 25886006, 및 24656502); 자금 또한 새로운 에너지와 산업 기술 종합 개발 기구 (NEDO)와 Terumo 생명 과학 재단에 의해 제공 했다. WPI iCeMS는 세계 최고의 국제 연구 센터 이니셔티브 (WPI), 교육, 문화, 스포츠, 과학 및 기술 (MEXT), 일본에 의해 지원 됩니다. 이 작품의 일부는 교토 대학 나노기술 허브와 AIST 나노 처리 시설 "나노기술 플랫폼 프로젝트" 일본 문 부 과학성의 후원에 의해 지원 되었다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
폴리스티렌 (PS)Sigma#182435평균 MW: 290,000, 평균 Mn: 130,000
폴리메틸글루타리미드(PMGI)MicroChemG113113
젤라틴(GT)SigmaG2625돼지 가죽에서 추출한 A형
Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트Doe Corning Toray#1064291PDMS 경화제 및 실리콘 엘라스토머 베이스가 이 키트의 구성 요소입니다.
OpenSCAD이것은 미세유체 장치의 금형을 설계하는 데 사용되는 무료 3D 컴퓨터 그래픽 소프트웨어(http://www.openscad.org/)입니다.
AutoCAD 2014Autodesk나노 섬유 어레이 준비에 사용되는 마스크 설계에 사용되는 3D 컴퓨터 그래픽 소프트웨어 (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview)입니다.
3D 프린터, AGILISTA-3000Keyence
UV 경화 수지, AR-M2KeyenceAgilista의 3D 프린팅에 사용됩니다.
아세트산시그마#338826≥ 99.99%
틸 아세테이트Sigma#270989무수, 99.8%
테트라하이드로퓨란(THF)시그마#401757
MSP-30T진공 장치마그네트론 스퍼터링 머신
Nunc OmniTrayThermo Fisher Scientific#242811이것은 나노 섬유 어레이가 생성되는 폴리스티렌 베이스 플레이트입니다. 이 플레이트 크기는 일반적으로 127.7 x 85.5mm입니다. 
건형 코로나 방전 가공기신코전기(주) 계측CFG-500이 편리한 장치는 프로토콜의 1.5단계 "MACME 어레이 어셈블리"에서 PDMS 계층의 바닥 표면을 활성화하기 위한 코로나를 생성하는 데 사용됩니다.
5mL 주사기TerumoSS-05SZ
스테인리스 스틸 무딘 바늘(23게이지)Nipro#2166외경과 길이는 각각 0.6mm와 32mm입니다.
고전압 전원 공급 장치TechDempaz
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochlorideDojindoW001
N-HydroxysoxynimideSigma#56480
Matrigel hESC 인증 MatrixCorning#354277이 단백질은 프로토콜에서 기저막 겔 매트릭스로 언급됩니다.
CellAdhere Vitronectin, Human, SolutionSTEMCELL Technologies#07004
TeSR-E8STEMCELL Technologies#05940인간 ES 및 iPS 세포 유지를 위한 무공급, 무이종 배양 배지
Y-27632Wako Pure Chemical Industries#253-00513
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol redThermo Fisher Scientific#12605028이것은 부착 포유류 세포의 해리를 위한 재조합 트립신 유사 프로테아제입니다.
Alexa Fluor 647 Azides가 포함된 Click-iT EdU 이미징 키트Thermo Fisher ScientificC10086온플레이트(on-plate) 형광 염색에서 증식 세포의 형광 라벨링은 이 키트의 제품 설명서에 따라 수행되었습니다.
Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugateThermo Fisher ScientificA13203
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Thermo Fisher ScientificD1306
Oct-3/4 항체 (C-10)Santa Cruz Biotechnologysc-5279
당나귀 안티 마우스 IgG H& L (DyLight 488)abcamab96875이것은 온-플레이트 형광 세포 염색에 사용되는 2차 항체입니다.
ECLIPSE Ti-ENikonCFI Plan Fluor 4×/0.13 N.A. 대물 렌즈(Nikon), CCD 카메라(ORCA-R2, Hamamatsu), 수은 램프(Intensilight, Nikon), XYZ 자동화 스테이지(엔코더가 있는 Ti-S-ER 전동 스테이지, Nikon) 및 4개의 형광 채널(DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon)
NIS-Elements AdvancedResearch Nikon은 자동 이미지 획득에 사용되는 현미경 이미징 소프트웨어입니다.
CellProfiler, 버전 2.1.0이것은 세포 이미지 분석(http://cellprofiler.org/)을 위한 무료 개방형 소프트웨어입니다.
RSOM 분석은 이 소프트웨어의 kohonen 패키지에 의해 수행됩니다. 이것은 무료로 사용할 수 있습니다(https://www.r-project.org/).
Cluster 3.0오픈 소스 클러스터링 소프트웨어(http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm)입니다. 비지도 계층적 클러스터링은 이 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다.
Java TreeView: 이 오픈 소스 소프트웨어(http://jtreeview.sourceforge.net/)는 클러스터링 데이터를 히트맵 및 덴드로그램으로 시각화하는 데 사용됩니다.
H9 인간 배아 줄기 세포WiCell 줄기 세포 은행WA09
에

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Ameen, C., et al.

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