합성 작은 분자의 높은 처리량 화면 모델 식물 종, 애기 thaliana에 실시 됐다. 액체 처리 로봇에 대 한 개발이 프로토콜 앞으로 화학 유전학 스크린, 식물 생리학에 영향을 미치는 새로운 작은 분자의 발견을 가속의 속도가 증가 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
화학 유전학은 점점 해독 식물 유전자 중복 또는 치 전통 유전학에 고집 불통 될 수 있는 특성을 채용 되 고 있습니다. 그러나, 생리 되는 합성 분자의 확률이 낮습니다; 따라서, 분자의 수천은 그 관심을 찾기 위해 테스트 되어야 한다. 액체 처리 로봇 시스템은 샘플, 속도는 화학 라이브러리 오류 최소화/표준화 이외에 상영 될 수 증가의 큰 숫자를 처리 하기 위해 설계 되었습니다. 벤치 탑 멀티 채널 액체를 사용 하 여 프로토콜 애기 thaliana (애기)에 50000 작은 분자의 도서관의 높은 처리량 앞으로 화학 유전학 스크린을 달성 하기 위해 필요한 최소한의 개발 되었다 로봇을 처리 기술 자가 참여. 이러한 프로토콜을 3,271 작은 분자는 그 표시 phenotypic 변경 발생 발견 되었다. 1,563 화합물 짧은 뿌리, 1,148 화합물 변경 채색, 383 화합물 발생 루트 머리와 다른, 비-, 분류 변경 및 177 화합물 저해 발 아를 유도 한다.
서론
지난 20 년 동안에서 식물 생물학 분야에서 연구자는 큰 진전을 화학 유전학 방법, 앞으로 및 역방향, 세포 벽 생 합성, 골격, 호르몬 생 합성에 대 한 우리의 이해를 개량 하 고 신호, gravitropism, 병 인, 퓨 린 생 합성, 그리고 endomembrane,12,3,,45를 인신 매매. 앞으로 화학 유전학 기술을 관심의 고기 식별 가능 하며 특정 프로세스의 genotypic 토대를 이해 연구 반대로, 반대로 화학 유전학 미리 결정된 단백질 대상6상호 작용 하는 화학 물질을 찾고 있습니다. 애기 때문에 매핑되고 주석 그것의 게놈은 작은, 식물 생물학에서 이러한 발견의 최전선에 왔다. 그것은 짧은 생성 시간, 그리고 여러 돌연변이/기자 라인 탈 subcellular 기계7의 식별을 용이 하 게 사용할 수 있다.
천천히 앞으로 화학 유전 스크린의 진행, 초기 심....
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프로토콜
1. 희석 라이브러리 만들기
- 레이블을 625 희석 도서관 판, 화학 라이브러리에서 해당 그들의 접시에 일치 하는지 확인. 또한, 5 갤런 저수지에 콘솔 드라이브를 통해 그들을 전달 하 여 흐름 및 흐름 호스를 멀티 채널 팁 세척 자동화 기구 포지 셔 너 (ALP)를 연결 ( 재료의 표참조).
- 컴퓨터에 액세스 하 고 물을 회람 하기 위하여 멀티 채널 팁 세척 ALP 장치 컨트롤러의 연결을 통해 세척 펌프를 켭니다. 이 끌 것 이다 자동으로 프로토콜의 끝에.
- 부하, 손을 스태커 10에 의해에 연결 된 호텔 A-D (그림 4, 스태커);에서 다음 순서로 스태커 회전 목마 객실 1, 96-잘 V 4에서 AP96 P20 피 펫 팁의 한 상자-바닥 접시 객실 2-5에서에서 두 위 접시는 정렬된 라이브러리와 두 낮은 접시 재고 농도 포함 하는 (그림 5, 스태커) 빈. 또한, 객실 6, 및 4 개의 96 잘 V AP96 P20 피 펫 팁의 1 개의 상자를 로드-정렬된 라이브러리와 2 개의 낮은 격판덮개의 재고 농도 포함 하 2 개의 상단 플레이트와 객실 7-9에서에서 하단 플레이트 빈 (
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결과
정확 하 고 효율적으로 특성화 해 현미경 농도 검사에서 작은 분자의 추가에 따라 고기 기능은 애기. 에 앞으로 화학 유전학의이 방법의 최종 목표 모든 50000 화합물 상영 되어 했다 때 관찰 하는 고기 다양 한 되었고 여러 가지 클래스 (그림 2)에 깨진 수 있습니다. 그림 3A -F 해 현미경 저 배율에서 관찰 된 고기의 예를 보여 줍니다. 일부 고기 결정적이 결과 (그림 3G, H) 제공. 이러한 화학 더 낮은 복용량에 다른 표현 형을 제공 하지 않은 되도록 낮은 농도에 필적 했다.
불 쌍 한 결과 여러 가지 이유로 발생할 .......
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토론
이 프로토콜은 애기에 앞으로 화학 유전학 스크린 달성에 연구자를 지원 하도록 설계 되었습니다. 우리가 제공 하는 대표적인 결과 50000 화합물 (그림 2 및 그림 3)의 화면에서 가장 큰 앞으로 화학 유전학 스크린 중의 하나는9,,1323날짜에 애기에 수행. 액체 처리 로봇의 사용에는 더 효율적인 희석 라이브러리 및 라이브러리 생성을 차단, 속도 소설 화합물의 효율성을 향상 사용할 수 있습니다. 높은 처리량 자연에서 화면에 용량을 증가 감소 하는 노동 연구원 대신 동행 했다. 이 기술은 작은 씨앗이 나 해 현미경으로 보이는 식물을 수용할 수 있는 96 잘 접시와 함께 사용 하도록 설계 되었습니다. 큰 씨앗에 맞게 큰 우물 접시를 활용 하 여 처리량과 디자인.......
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공개 사항
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
감사의 글
우리가 건설 하 고 중요 한 토론을 위한 Jozsef 황새, 미첼 리치몬드, Jarrad Gollihue, 그리고 안드레아 산체스 감사합니다. Phenotypic 사진에 대 한 박사 Sharyn 페리입니다. 이 자료는 협력 계약 번호 1355438에서 국립 과학 재단에서 지 원하는 작업을 기반으로 합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Keyboard | Local Provider | N/A | 프로토콜 설계 및 운영에 사용 Biomek FX |
| Mouse | Local Provider | N/A | 프로토콜 설계 및 운영에 사용 Biomek FX |
| Computer Screen | Local Provider | N/A | 프로토콜 설계 및 운영에 사용 Biomek FX |
| Computer | Local Provider | N/A | 프로토콜 설계 및 운영에 사용 Biomek FX |
| DIVERSet Diverse Screening Library | ChemBridge | N/A | Chemical library |
| Biomek Software Beckman | Coulter | N/A | Biomek FX Device Controller 실행 및 설계 |
| Beckman Coulter | 719366 | 워터 펌프/팁 세척 스테이션 작동 | |
| Stacker Carousel Pendent | Beckman Coulter | 148240 | Biomek 수동 작동 스태커 캐러셀 |
| Biomek 스태커 캐러셀 | Beckman Coulter | 148520 | 모든 것을 수용하는 로터리 유닛 FX Stacker 10의 |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | 스크린용 구성 요소를 수용하는 엘리베이터 유닛 |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | 스크린용 구성 요소를 수용하는 엘리베이터 유닛 |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | 스크린의 구성 요소를 수용하는 엘리베이터 유닛 |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | 스크린의 구성 요소를 수용하는 엘리베이터 유닛 |
| Biomek FX | Beckman Coulter | https://www.beckman.com/liquid-handlers | 원하는 작업을 수행하는 로봇 |
| Accuframe | Artisan Technology Group | 76853-4 | 프레임 암을 사용하여 구성 요소를 적절하게 배치 |
| 프레이밍 픽스처 | Beckman Coulter | 719415 | Accuframe |
| Multichannel Tip Wash ALP | Beckman Coulter | 719662 | 에탄올 수조 후 팁 |
| 세척 팁 로더 ALP | Beckman Coulter | 719356 | 암에 팁을 공압식으로 적재 |
| 공기 압축기 | 현지 공급자 | N/A | 공압 팁 로딩을 위한 공기 제공 |
| MasterFlex 콘솔 드라이브 | Cole-Parmer | 77200-65 | 다중 채널 팁 와셔 에어 호스를 통해 물을 순환시키는 데 사용되는 펌프 |
| 로컬 공급자 | N/A | 공기 압축기에서 팁 로더 물 호스로 공기 제공 | |
| 로컬 공급자 | N/A | 5갤런 예비에서 팁 와셔까지 물 제공 | |
| 정적 ALP의 | Beckman Coulter | 는 Biomek FX와 함께 제공됩니다 | 장비 지원 |
| 5 갤런 리저브 | 현지 공급자 | N/A | 는 팁 청소 과정에서 더러운 물을 재순환시킵니다. |
| 그리퍼 | Beckman Coulter | Biomek FX가 함께 제공됩니다 | . 장비를 잡아서 올바른 위치로 이동시킵니다. |
| 96-채널 200 &마이크로; L 헤드 | Beckman Coulter | 는 Biomek FX와 함께 제공됩니다 | 스크린 내에서 사용되는 96 개의 팁을 보유합니다 |
| AP96 P200 피펫 팁 | Beckman Coulter | 717251 | 스크리닝 라이브러리 |
| 96 Well Flat Bottom Plate | Costar | 9018 | 스크린의 시각화를 돕습니다 |
| 96 Well V-Bottom Plate | Costar | 3897 | 희석 라이브러리 |
| AlumaSeal 96의 저장을 돕습니다. 씰링 필름 | MedSci | F-96-100 | 화학 라이브러리 및 희석 라이브러리 저장용 씰 |
| 플라스틱 지퍼락 샌드위치 백 | 현지 공급업체 | N/A | 스크린의 습한 환경을 보장하기 위해 사용 |
| AP96 P20 피펫 팁 | Beckman Coulter | 717254 | 희석 라이브러리 생성에 사용 |
| 성장 챔버 | Percival | AR36L3 | 표현형을 위한 씨앗 발아 visulization |
| 주걱 | 현지 공급자 | N/A | 액체 파종에 실패한 씨앗이 적절하게 실패한 우물에 추가할 씨앗을 보유 |
| 이쑤시개 | 지역 공급자 | N/A | 주걱에서 우물로 씨앗 밀어 |
| Murashige 및 Skoog 기초 염 혼합물 | PhytoTechnology Laboratories | M524 | MS 매체 혼합물에 추가 |
| MES 유리산 일수화물 | Fisher Scientific | pH 감소를 위해 MS 매체에 ICN19483580 첨가 | |
| 한천 분말 | Alfa Aesar | 9002-18-0 | 종자 현탁액을 지원하기 위해 매체의 두께 증가 |
| 5M KOH | Sigma-Aldrich | 484016 | pH를 적절한 수준으로 증가 |
| 1L 매체 보관 병 | Corning | 1395-1L | 스크린에 충분한 매체 수용 |
| 폴리프로필렌 원심 분리기 튜브 | Corning | 431470 | vernilization 전에 종자를 살균합니다 |
| pH 프로브 | Davis Instruments | YX-58825-26 | 미디어 ALP |
| (Automated Labware Positioners) 사용자 매뉴얼 | Beckman Coulter | PN 987836 | Biomek FX의 수반 장비 설정 지원 |
| Biomek 2000 Stacker Carousel 사용자 가이드 | Beckman Coulter | 609862-AA | Stacker Carousel |
| 설정 지원Biomek FX 및 FXP 실험실 자동화 워크스테이션 사용자 매뉴얼 | Beckman Coulter | PN 987834 | 멀티채널 포드를 구성하는 데 사용 |
| Biomek FXP 실험실 자동화 워크스테이션 고객 시작 가이드 | Beckman Coulter | PN B32335AB | Biomek FX |
| Biomek 소프트웨어 사용자 설명서 | Beckman Coulter | PN 987835 | 설정하고 이해하는 데 사용됩니다. 소프트웨어 |
참고문헌
- Blackwell, H. E., Zhao, Y. Chemical genetic approaches to plant biology. Plant Physiol. 133 (2), 448-455 (2003).
- Dejonghe, W., Russinova, E. Plant chemical genetics: From phenotype-based screens to synthetic biology. Plant Physiol. 174 (1), 5-20 (2017).
- Mc....
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