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방법 논문

높은 처리량 앞으로 화학 유전학의 화면 애기 thaliana 을 액체 처리 로봇의 사용을 최적화

6.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57393

⸱

2018년 4월 30일

 ,  , 
1Department of Horticulture, University of Kentucky

이 논문에서

요약

합성 작은 분자의 높은 처리량 화면 모델 식물 종, 애기 thaliana에 실시 됐다. 액체 처리 로봇에 대 한 개발이 프로토콜 앞으로 화학 유전학 스크린, 식물 생리학에 영향을 미치는 새로운 작은 분자의 발견을 가속의 속도가 증가 합니다.

초록

화학 유전학은 점점 해독 식물 유전자 중복 또는 치 전통 유전학에 고집 불통 될 수 있는 특성을 채용 되 고 있습니다. 그러나, 생리 되는 합성 분자의 확률이 낮습니다; 따라서, 분자의 수천은 그 관심을 찾기 위해 테스트 되어야 한다. 액체 처리 로봇 시스템은 샘플, 속도는 화학 라이브러리 오류 최소화/표준화 이외에 상영 될 수 증가의 큰 숫자를 처리 하기 위해 설계 되었습니다. 벤치 탑 멀티 채널 액체를 사용 하 여 프로토콜 애기 thaliana (애기)에 50000 작은 분자의 도서관의 높은 처리량 앞으로 화학 유전학 스크린을 달성 하기 위해 필요한 최소한의 개발 되었다 로봇을 처리 기술 자가 참여. 이러한 프로토콜을 3,271 작은 분자는 그 표시 phenotypic 변경 발생 발견 되었다. 1,563 화합물 짧은 뿌리, 1,148 화합물 변경 채색, 383 화합물 발생 루트 머리와 다른, 비-, 분류 변경 및 177 화합물 저해 발 아를 유도 한다.

서론

지난 20 년 동안에서 식물 생물학 분야에서 연구자는 큰 진전을 화학 유전학 방법, 앞으로 및 역방향, 세포 벽 생 합성, 골격, 호르몬 생 합성에 대 한 우리의 이해를 개량 하 고 신호, gravitropism, 병 인, 퓨 린 생 합성, 그리고 endomembrane,12,3,,45를 인신 매매. 앞으로 화학 유전학 기술을 관심의 고기 식별 가능 하며 특정 프로세스의 genotypic 토대를 이해 연구 반대로, 반대로 화학 유전학 미리 결정된 단백질 대상6상호 작용 하는 화학 물질을 찾고 있습니다. 애기 때문에 매핑되고 주석 그것의 게놈은 작은, 식물 생물학에서 이러한 발견의 최전선에 왔다. 그것은 짧은 생성 시간, 그리고 여러 돌연변이/기자 라인 탈 subcellular 기계7의 식별을 용이 하 게 사용할 수 있다.

천천히 앞으로 화학 유전 스크린의 진행, 초기 심사 과정 및 관심8의 화합물의 목표를 결정 하는 두 가지 주요 병목을 확인 하 고 있습니다. 작은 분자 선택의 속도 증가에서 주요 원조 자동화 및 자동화 된 장비9의 사용 이다. 액체 처리 로봇 작은 분자의 큰 도서관을 처리 하기 위한 훌륭한 도구입니다 그리고 생물 과학10에서 진행을 운전에 도움이 되었습니다. 여기에 제시 된 프로토콜은. 빠른 속도로 생리 활성 작은 분자의 식별 사용 심사 프로세스와 관련 된 병목을 완화 하도록 설계 되었습니다. 이 기술은 노동의 원리 탐정에 경제적 비용 감소 연산자 대신 시간 부담 감소.

지금까지, 대부분의 화학 라이브러리 분석으로 150, 000와 일부 몇 가지 709,,1112,,1314, 로 일부 10000 그리고 20000 화합물 사이 개최 15 , 16. 여기 소개 하는 프로토콜 ( 재료의 표참조) 50000 화합물의 분자 라이브러리에 구현 된, 더 큰 앞으로 화학 유전학 중 화면 날짜에 실시 애기. 이 프로토콜 발견 제 초 제, 살충제의 발견, 살 균 제에 관련 된으로 특히 증가 효율성과 속도 앞으로 화학 유전학에 관한 현재 트렌드에 맞는 발견, 발견, 및 암 생물학17 마약 ,,1819,,2021. 비록 여기 애기와 구현,이 프로토콜을 쉽게 될 수 세포 배양, 포자, 그리고 잠재적으로 심지어 곤충을 96-384 / 1536-잘 접시에서 액체 매체에서. 작은 크기로 인해 애기는 의무가 96 잘 접시에서 심사. 그러나, 우물에 고르게 씨앗 배포는 도전 이다. 손 시드 노동 집약, 하지만 정확한 이며 96 잘 접시에 씨앗을 분배 하도록 하는 장치는, 그들은 저렴 하 게 구입할. 여기, 우리가 어떻게이 단계 피할 수 단지 작은 손실 정확도에 보여줍니다.

이 방법의 전반적인 목표는 애기 더 관리에 대 한 큰 화학 라이브러리 사용을 통해 액체 처리 로봇의 정확도 저하 없이 심사 수 있도록 했다. 이 메서드를 사용 하 여 초기 희석 시리즈 관리 및 후속 phenotypic 화면, 빠른 시각화 해 현미경 그리고 급속 한 샘플의 수를 완료 하는 데 걸린 시간을 감소 하 여 연구원의 효율성 향상 새로운 생리 활성 작은 분자의 id입니다. 그림 1 4 단계에서이 프로토콜의 주요 결과를 보여 줍니다.

figure-introduction-1
그림 1: 앞으로 화학 유전학 스크린의 전체 워크플로. 4 주요 단계의 각각에 대 한 몇 가지 세부 사항에 설명 하는 프로토콜의 개요. 1: 화학 라이브러리, 2 수신: 3 희석 라이브러리 만들기: 심사 접시, 및 4: 잠복기 및 심사 번호판을 시각화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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프로토콜

1. 희석 라이브러리 만들기

  1. 레이블을 625 희석 도서관 판, 화학 라이브러리에서 해당 그들의 접시에 일치 하는지 확인. 또한, 5 갤런 저수지에 콘솔 드라이브를 통해 그들을 전달 하 여 흐름 및 흐름 호스를 멀티 채널 팁 세척 자동화 기구 포지 셔 너 (ALP)를 연결 ( 재료의 표참조).
  2. 컴퓨터에 액세스 하 고 물을 회람 하기 위하여 멀티 채널 팁 세척 ALP 장치 컨트롤러의 연결을 통해 세척 펌프를 켭니다. 이 끌 것 이다 자동으로 프로토콜의 끝에.
  3. 부하, 손을 스태커 10에 의해에 연결 된 호텔 A-D (그림 4, 스태커);에서 다음 순서로 스태커 회전 목마 객실 1, 96-잘 V 4에서 AP96 P20 피 펫 팁의 한 상자-바닥 접시 객실 2-5에서에서 두 위 접시는 정렬된 라이브러리와 두 낮은 접시 재고 농도 포함 하는 (그림 5, 스태커) 빈. 또한, 객실 6, 및 4 개의 96 잘 V AP96 P20 피 펫 팁의 1 개의 상자를 로드-정렬된 라이브러리와 2 개의 낮은 격판덮개의 재고 농도 포함 하 2 개의 상단 플레이트와 객실 7-9에서에서 하단 플레이트 빈 (그림 5, 스태커).
  4. 설정, 손으로, P3, P7에 300 mL 70 %EtOH 목욕에 300 mL 물 저수지와 갑판 팁 로더 ALP (TL1), 그리고 멀티 채널 팁 세척 ALP (TW1) (그림 4, 갑판 및 그림 5, 갑판).
  5. 운영 소프트웨어를 사용 하 여 스태커 10에서 AP96 P20 피 펫 팁을 제시 하 고 팁 로더 ALP에 이동.
    참고: 액체 처리 로봇의 운영 소프트웨어; 1.5 1.12 모든 통해 완료 테이블의 자료를 참조 하십시오.
  6. 호텔에서 룸 2를 제시 하 고 모든 4 개의 96 잘 V 분리-하단 플레이트는 갑판에 하단 배치 P4, P8에 2 및 P5 P9에 2 위 (그림 4).
  7. AP96 P20 피 펫 팁 팁 로더 96 채널 200 µ L 머리에 ALP와 함께 로드 합니다. 300 mL 물 저수지에서 90 µ L 발음 및 96-잘 V에 분배-P4에 바닥판 희석. P8에 접시에 대 한이 단계를 반복 합니다.
  8. 반복적으로 발음 및 분배 15 µ L 세 번 P5에 화학 라이브러리 접시를 섞는다. 또한, P5에 화학 라이브러리 접시에서 10 µ L 발음 하 고 P4에 희석 접시에 10 µ L을 분배.
  9. 총 세 번 반복적으로 발음 하 고 50 µ L를 분배 하 여 P4에 접시의 솔루션을 믹스. 혼합, 일단 깨끗 한 발음 및 70 µ L의 70%를 분배 하 여 AP96 P20 피 펫 팁 EtOH P7에서 발음 및 물 4의 110% 볼륨을 분배 하 여 멀티 채널 팁 세척 ALP에 세척 그들 시간.
  10. P8, P9에 번호판의 두 번째 쌍에 대 한 1.8-1.9 단계를 반복 합니다. 두 번째 96 잘 V 만들기 시-희석 바닥판, 스택 맨 하단에서 다음 순서로 접시: P9, P5, P8, P4. 다음, 한 빈 정적 ALP;에 스택 장소 P1, P2, P6, P10, P11, P12, 또는 P13.
  11. 1.6 1.10 단계를 반복 하 여 호텔 A의 객실 5 비어. 1.5 룸 6 도달, 새로운 AP96 P20 피 펫 팁 팁 로더 ALP 고 빈 정적 ALP에 사용 된 AP96 P20 피 펫 팁을 배치에 따라 단계를 반복 합니다.
  12. 1.6 1.10 단계를 반복 하 여 호텔의 룸 9 A 비어. 그러나, 호텔 B를 진행 하기 위해서는 접시와 갑판에 팁 해야 합니다 다시 로드 호텔 대답에
  13. 다시 작성, 손으로, 300 mL 물 저수지. 이 단계는 중요 한, 그리고 컴퓨터 프로그램 일시 중지를 치고 '계속', 다음 단계를 수행 하기 전에 사용자는이 메시지를 자세히를 통합할 수 있습니다.
  14. 나머지 호텔, 보장 전체 300 mL 물 저수지 다음 호텔에 진행 하기 전에 각 시간에 대 한 1.5-1.13 단계를 반복 합니다.

2. 판 상영을 미디어-씨앗 혼합물 추가

  1. ½ 重 만들고 Skoog (MS) 미디어 0.1% 조정 5.7에 pH 4.3 g MS 소금, 0.50 g MES, 1.0 g 한 천 1 L 디 H2o.를 추가 하 여 한 천 하지만 pH 프로브를 모니터링 하는 동안 5 M 수산화 칼륨의 추가.
  2. 15 그리고 30 분 사이 1% 표 백제와 SDS에 그들을 떨고 하 여 종자를 소독 하 고 후 원심 분리에 의해 물의 동등한 양으로 4 번 린스. 씨앗은 불 임, 일단 vernilization에 대 한 일 24 시간에서 4 ° C에서 그들을 놓습니다. 애기 생물 자원 센터의 살 균, vernilization, 및 성장22추가 방법을 설명합니다.
  3. 미디어 씨앗 추가 손으로 0.1 g/100 mL의 조밀도에. 이 밀도 96 잘 접시 당 3-10 씨앗의 평균 결과입니다.
  4. 손으로, 96-잘 평면 4 장소-객실 1과 2 (그림 6, 호텔) 호텔 A의 하단 접시. AP96 P250 피 펫 팁 팁 로더 ALP의 상자, 300 mL 저수지 2.1-2.3에 P3, 단계에서 만든 미디어 씨 혼합물으로 가득 그리고 300 mL 저수지 가득 70% EtOH P7에 (그림 4, 갑판 및 그림 6 갑판).
    참고: 2.8 통해 2.5 운영 소프트웨어와 함께 할 수 있습니다.
  5. 객실 1과 2 호텔 A에 제시 하 고 4 개의 격판덮개의 더미를 분리. 빈 정적 알프스 (P4, p5 급, P6, P8, P9, P10, P11, 및 P12)의 각각에 한 접시를 놓습니다. 96 채널 200 µ L 머리에 AP96 P250 피 펫 팁을 로드 합니다.
  6. P3에 300 mL 미디어 씨 저수지에서 90 µ L 발음 하 고 첫 번째 96 잘 평면으로 분배-하단 접시. 이 프로세스를 반복 하 여 모든 8 접시 포함 미디어 씨 혼합물.
  7. 발음 하 고 70% 가득 300 mL 저수지에서 70 µ L를 분배 하 여 AP96 P250 피 펫 팁을 청소 EtOH P7에. 발음 및 분배 물 110% 볼륨 4 번 멀티 채널 팁 세척 ALP에 도움말을 세척 하 고 TL1에서 팁을 언로드 손으로 접시를 수집.

3. 판 검사에 작은 분자를 추가

  1. 부하, 손으로, 룸 1의 호텔에 A, 2 96-잘 V AP96 P250 피 펫 팁의 상자-하단 희석 라이브러리 접시 객실 2, 4, 6, 및 8, 및 두 96 잘 평면 하단 상영 판 객실 3, 5, 7, 9 (그림 4 에 스태커 및 그림 7, 호텔 A). 또한, 5 갤런 저수지에 멀티 채널 팁 세척 ALP에서 호스를 연결 합니다.
    참고: 3.10 통해 3.2 운영 소프트웨어와 함께 할 수 있습니다.
  2. P7;에서 300 mL 70 %EtOH 세척 저수지 포함 하 갑판을 구성 미디어-씨앗 저수지 P3에 갑판에 남아 있을 수 있습니다 (그림 4, 갑판 및 그림 7, 갑판). 또한, 멀티 채널 팁 세척 ALP 통해 물 순환 장치 컨트롤러의 연결을 통해 콘솔 드라이브를 켜십시오. 이 끌 것 이다 자동으로 프로토콜의 끝에.
  3. AP96 P250 피 펫 팁 상자의 호텔 A에서 제시 하 고 팁 로더 ALP로 이동.
  4. 현재 96 잘 V-갑판 및 정적 ALP P4, P8에 하나에 한 장소를 호텔 룸 2 A에서에서 하단 희석 라이브러리 접시. 96-잘 평면 제시-하단 상영 판에서 3 갑판을 호텔 A의 객실 및 하나 정적 ALP P5 및 p 9에.
  5. AP96 P250 피 펫 팁 팁 로더 96 채널 200 µ L 머리에 ALP와 함께 로드 합니다.
  6. 96-잘 V 믹스-발음 및 분배 50 µ L 세 번 P4에 바닥판 희석. 그 다음이 플레이트에서 10 µ L 발음 하 고 96 잘 평면으로 분배-P5에 바닥판 심사.
  7. 발음 및 분배 50 µ L 세 번 P5에 접시에 솔루션을 믹스. 발음 및 70 µ L의 70%를 분배 하 여 에탄올 AP96 P250 피 펫 팁을 청소 EtOH P7와 발음 및 분배의 110% 볼륨으로 멀티 채널 팁 세척 ALP에 팁 물 4 번 다음 세척 저수지에서.
  8. 3.5와 3.6 단계를 반복 하 여 두 번째 96 잘 v-희석 라이브러리 바닥판 (P8) 및 96-잘 평면-바닥판 심사 (P9).
  9. 스택 2 96-잘 V-함께 하단 희석 라이브러리 접시와 함께 두 96 잘 플랫 바닥 심사 접시. 정적 알프스 P1, P2, P6, P10, P11, P12, 또는 P13 번호판 이동.
  10. 반복 단계 3.4-3.9 세 번, 8 번의 총 플레이트 심사에 희석된 화학 제품을 추가. 마지막으로, 시각적 구조를 통해 심사 플레이트의 각 음에 씨앗의 수를 확인 하 고 추가 소독 및 vernalized 씨에 의해 3 씨 그 우물을 보충.

4. 보육 및 판 상영의 시각화

  1. 품 어 96 잘 평면 하단 상영 판 4 일 동안 22 ° C에서 환경 챔버에 16/8 명암 주기 건조 증거 컨테이너에서. 96-잘-바닥이 빠진 상영 판 해 현미경 시각화. 추가 조사에 대 한 모든 탈 고기를 기록 합니다.

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결과

정확 하 고 효율적으로 특성화 해 현미경 농도 검사에서 작은 분자의 추가에 따라 고기 기능은 애기. 에 앞으로 화학 유전학의이 방법의 최종 목표 모든 50000 화합물 상영 되어 했다 때 관찰 하는 고기 다양 한 되었고 여러 가지 클래스 (그림 2)에 깨진 수 있습니다. 그림 3A -F 해 현미경 저 배율에서 관찰 된 고기의 예를 보여 줍니다. 일부 고기 결정적이 결과 (그림 3G, H) 제공. 이러한 화학 더 낮은 복용량에 다른 표현 형을 제공 하지 않은 되도록 낮은 농도에 필적 했다.

불 쌍 한 결과 여러 가지 이유로 발생할 ...

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토론

이 프로토콜은 애기에 앞으로 화학 유전학 스크린 달성에 연구자를 지원 하도록 설계 되었습니다. 우리가 제공 하는 대표적인 결과 50000 화합물 (그림 2 및 그림 3)의 화면에서 가장 큰 앞으로 화학 유전학 스크린 중의 하나는9,,1323날짜에 애기에 수행. 액체 처리 로봇의 사용에는 더 효율적인 희석 라이브러리 및 라이브러리 생성을 차단, 속도 소설 화합물의 효율성을 향상 사용할 수 있습니다. 높은 처리량 자연에서 화면에 용량을 증가 감소 하는 노동 연구원 대신 동행 했다. 이 기술은 작은 씨앗이 나 해 현미경으로 보이는 식물을 수용할 수 있는 96 잘 접시와 함께 사용 하도록 설계 되었습니다. 큰 씨앗에 맞게 큰 우물 접시를 활용 하 여 처리량과 디자인...

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공개 사항

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

감사의 글

우리가 건설 하 고 중요 한 토론을 위한 Jozsef 황새, 미첼 리치몬드, Jarrad Gollihue, 그리고 안드레아 산체스 감사합니다. Phenotypic 사진에 대 한 박사 Sharyn 페리입니다. 이 자료는 협력 계약 번호 1355438에서 국립 과학 재단에서 지 원하는 작업을 기반으로 합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
KeyboardLocal ProviderN/A프로토콜 설계 및 운영에 사용 Biomek FX
MouseLocal ProviderN/A프로토콜 설계 및 운영에 사용 Biomek FX
Computer ScreenLocal ProviderN/A프로토콜 설계 및 운영에 사용 Biomek FX
ComputerLocal ProviderN/A프로토콜 설계 및 운영에 사용 Biomek FX
DIVERSet Diverse Screening LibraryChemBridgeN/AChemical library
Biomek Software BeckmanCoulterN/ABiomek FX Device Controller 실행 및 설계
Beckman Coulter719366워터 펌프/팁 세척 스테이션 작동
Stacker Carousel PendentBeckman Coulter148240Biomek 수동 작동 스태커 캐러셀
Biomek 스태커 캐러셀Beckman Coulter148520모든 것을 수용하는 로터리 유닛 FX Stacker 10의
FX Stacker 10Beckman Coulter148522스크린용 구성 요소를 수용하는 엘리베이터 유닛
FX Stacker 10Beckman Coulter148522스크린용 구성 요소를 수용하는 엘리베이터 유닛
FX Stacker 10Beckman Coulter148522스크린의 구성 요소를 수용하는 엘리베이터 유닛
FX Stacker 10Beckman Coulter148522스크린의 구성 요소를 수용하는 엘리베이터 유닛
Biomek FXBeckman Coulterhttps://www.beckman.com/liquid-handlers원하는 작업을 수행하는 로봇
AccuframeArtisan Technology Group76853-4프레임 암을 사용하여 구성 요소를 적절하게 배치
프레이밍 픽스처Beckman Coulter719415Accuframe
Multichannel Tip Wash ALPBeckman Coulter719662에탄올 수조 후 팁
세척 팁 로더 ALPBeckman Coulter719356암에 팁을 공압식으로 적재
공기 압축기현지 공급자N/A공압 팁 로딩을 위한 공기 제공
MasterFlex 콘솔 드라이브Cole-Parmer77200-65다중 채널 팁 와셔 에어 호스를 통해 물을 순환시키는 데 사용되는 펌프
로컬 공급자N/A공기 압축기에서 팁 로더 물 호스로 공기 제공
로컬 공급자N/A5갤런 예비에서 팁 와셔까지 물 제공
정적 ALP의Beckman Coulter는 Biomek FX와 함께 제공됩니다장비 지원
5 갤런 리저브현지 공급자N/A는 팁 청소 과정에서 더러운 물을 재순환시킵니다.
그리퍼Beckman CoulterBiomek FX가 함께 제공됩니다. 장비를 잡아서 올바른 위치로 이동시킵니다.
96-채널 200 &마이크로; L 헤드Beckman Coulter는 Biomek FX와 함께 제공됩니다스크린 내에서 사용되는 96 개의 팁을 보유합니다
AP96 P200 피펫 팁Beckman Coulter717251스크리닝 라이브러리
96 Well Flat Bottom PlateCostar9018스크린의 시각화를 돕습니다
96 Well V-Bottom PlateCostar3897희석 라이브러리
AlumaSeal 96의 저장을 돕습니다. 씰링 필름MedSciF-96-100화학 라이브러리 및 희석 라이브러리 저장용 씰
플라스틱 지퍼락 샌드위치 백현지 공급업체N/A스크린의 습한 환경을 보장하기 위해 사용
AP96 P20 피펫 팁Beckman Coulter717254희석 라이브러리 생성에 사용
성장 챔버PercivalAR36L3표현형을 위한 씨앗 발아 visulization
주걱현지 공급자N/A액체 파종에 실패한 씨앗이 적절하게 실패한 우물에 추가할 씨앗을 보유
이쑤시개지역 공급자N/A주걱에서 우물로 씨앗 밀어
Murashige 및 Skoog 기초 염 혼합물PhytoTechnology LaboratoriesM524MS 매체 혼합물에 추가
MES 유리산 일수화물Fisher ScientificpH 감소를 위해 MS 매체에 ICN19483580 첨가
한천 분말Alfa Aesar9002-18-0종자 현탁액을 지원하기 위해 매체의 두께 증가
5M KOHSigma-Aldrich484016pH를 적절한 수준으로 증가
1L 매체 보관 병Corning1395-1L스크린에 충분한 매체 수용
폴리프로필렌 원심 분리기 튜브Corning431470vernilization 전에 종자를 살균합니다
pH 프로브Davis InstrumentsYX-58825-26미디어 ALP
(Automated Labware Positioners) 사용자 매뉴얼Beckman CoulterPN 987836Biomek FX의 수반 장비 설정 지원
Biomek 2000 Stacker Carousel 사용자 가이드Beckman Coulter609862-AAStacker Carousel
설정 지원Biomek FX 및 FXP 실험실 자동화 워크스테이션 사용자 매뉴얼Beckman CoulterPN 987834멀티채널 포드를 구성하는 데 사용
Biomek FXP 실험실 자동화 워크스테이션 고객 시작 가이드Beckman CoulterPN B32335ABBiomek FX
Biomek 소프트웨어 사용자 설명서Beckman CoulterPN 987835설정하고 이해하는 데 사용됩니다. 소프트웨어
. 스크린 는 제작에 사용

참고문헌

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