방법 논문

항 원 특정 항 체 응답 다음 Clostridium 남과 어울리지 않 는 감염의 혈 청 학적인 결정에 대 한 단백질 Microarray 분석 결과

DOI:

10.3791/57399

⸱

2018년 6월 15일

 ,  , 
1Breast Surgery Group, Division of Medical Sciences and Graduate Entry Medicine, School of Medicine, Queen's Medical Centre, University of Nottingham, 2Medical Microbiology and Immunology Department, Faculty of Medicine, Mansoura University, 3Nottingham Digestive Diseases Centre and NIHR Nottingham Digestive Diseases Biomedical Research Centre, School of Medicine, Queen's Medical Centre, University of Nottingham

이 논문에서

요약

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이 문서 Clostridium 남과 어울리지 않는 항 원에 인간 세라 정화 7-플렉스 패널의 체액 면역 반응 높은 프로 파일링에 대 한 간단한 단백질 microarray 메서드를 설명 합니다. Polyclonal 정 맥 면역 글로불린의 준비에 특정 항 체 반응의 결정에 대 한 프로토콜을 확장할 수 있습니다.

초록

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우리Clostridium 남과 어울리지 않는 항 체 수준의 polyclonal 정 맥 면역 글로불린 (IVIg)의 별도 준비와 인간의 세라에서의 안티-결정에 대 한 소설 높은 처리량 단백질 microarray 분석 결과 대 한 자세한 개요를 제공합니다. 프로토콜 샘플 준비, 배열, 시험 절차, 및 데이터 분석의 인쇄에 관련 된 방법론 단계를 설명합니다. 또한,이 프로토콜 플라즈마를 포함 한 다양 한 임상 샘플을 통합 하 고 문화 supernatants 셀을 더 개발 될 수 있습니다. 우리는 단백질 microarray를 사용 하 여 isotype (IgG, IgA, IgM), 서브 클래스 (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2)의 조합을 결정 하는 방법을 보여 및 스트레인-특정 항 체를 매우 전체 C. 남과 어울리지 않 는 정화 독 소 A와 B (toxinotype 0, 스트레인 VPI 10463, ribotype 087), C. 남과 어울리지 않는 독 소 B만 표현 스트레인 (CCUG 20309)에서 독 소 B, 이진 독 소, pCDTb, ribotype 특정 전체 표면 층 단백질 B 조각의 선구자 형태 (SLPs; 001, 002, 027), 단백질 (파상풍을 제어 사망 toxoid 그리고 Candida albicans)입니다. 실험 기간 동안 microarrays 세라 C. 감염과 (CDI), 낭 성 섬유 증 (CF) 설사, 건강 한 컨트롤 (HC), 없이 개인으로 개인 및 개인 사전 및 포스트 IVIg 치료와 함께 조사 됩니다는 CDI, 결합 된 면역 결핍 장애 및 만성 염증 demyelinating polyradiculopathy의 치료. 우리 환자 단체, IVIg, 그리고 전에 세라의 상업적인 준비와 다음 IVIg 관리 사이 독 소 중립화 신진대사 및 멀티 isotype 특정 항 체 수준에 큰 차이가 발생합니다. 또한, 있다 microarray 및 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 사이의 중요 한 상관 관계 항 독 소 IgG 수준에 대 한 혈 청 샘플에서. 이러한 결과 microarray 예방 접종 또는 감염 된 인간 C.difficile 항 원에 항 체 응답을 프로 파일링 하기 위해 유망한 도구가 될 수 것이 좋습니다. 항 원 패널과 생산 비용에 있는 감소의 더 수정, 우리는 microarray 기술을 최적화 하 고 환자 별로 C. 감염과 대 한 가장 임상적으로 유용한 immunotherapies를 선택 도움이 될 수 있습니다 예상.

서론

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이 프로토콜 개발 및 검출을 위한 소설과 맞춤형 단백질 microarray 분석 결과의 검증 및 세균성 긴장 및 C. 남과 어울리지 않는 항 원에 항 체 isotype-특정 응답의 반 정량화에 설명합니다. 우리는 성공적으로 우리의 C. 남과 어울리지 않는 사용-특정 항 체 환자 세라1,2, IVIg3, 준비에에서 콘텐츠 구성 bioanalysis 유망한 새로운 툴으로 서 분석 결과 특정 microarray 및 CDI4가난한 결과 연관 항 체 특이성의 식별. 시연 어떻게 biobanked 혈 청 샘플 및 IVIg의 상업적인 준비 microarray 슬라이드에 분석 될 수 있다 C. 남과 어울리지 않는 병원 체 특정 항 체 반응을이 분석 결과의 높은-품질 프로 파일링를 재현할 수 있도록 합니다.

많은 건강 한 아이 들 및 성인 있고 C. 남과 어울리지 않는 독 소 A에 감지 혈 청 IgG와 IgA 항 체 B5,

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프로토콜

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1. 준비 Microarray 플레이트

  1. (이 환자 세라를 실행 하기 전에 미리 정의 된) 최적 농도에서 인쇄 버퍼 [PBS-트윈-트 레 할 로스 (50mm)] C. 남과 어울리지 않는 항 원 희석: 독 소는 (200 µ g/mL) 및 독 소 B (100 µ g/mL), pCDTb (200 µ g/mL), 및 순화 된 네이티브 전체 SLPs ribotypes 001, 002, 027 (200 µ g/mL)에서 파생 된.
    참고: 독 소 B 독 소 B 표현 스트레인 CCUG 20309 (90 µ g/mL)에서 얻은 것입니다.
    1. 긍정적인 컨트롤, C. albicans, 및 100 µ g/mL에서 인쇄 버퍼와 파상풍 사망 toxoid lysates 희석. 마지막으로, 일치 시험된 항 체 isotype 직렬, 10 희석 한 교정 커브를 생성 인쇄 버퍼에 걸쳐 50 µ g/mL에서 시작 순화 인간 면역 글로불린 희석.
  2. 384 잘 격판덮개로 인쇄 버퍼에 희석의 10 µ L를 전송 합니다.
  3. 커버 플레이트 플레이트 물개 및 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기와.

2. 인쇄 연락처 로봇 배열

  1. 열 휴....

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결과

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그림 1 설명된 프로토콜의 주요 단계를 설명 하는 순서도를 보여 줍니다. 그림 2 는 상당한 사이 계약 microarray ELISA IgG와 IgA 항 독 소 A와 B 환자 테스트 세라 수준을 보여주는 Spearman 상관 관계 테스트. 그림 3 설사 없이 CF 환자, 설사, CDI 환자와 HC에서 독 소 A, B, 독 소 및 이진 독 (pCDTb)에 대 한 특정 항 체 응답 차동 IgG와 IgA 항 체-클래스를 보여준다. 그림 4 는 C. 남과 어울리지 않는 항 독 소 중화 항 체 응답 환자 세라. 그림 5 ( C. 남과 어울리지 않는 독 소 및 Slp)에 대하여 면역 반.......

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토론

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이 프로토콜에서 우리는 microarray C. 남과 어울리지 않 는 단백질 항 원 환자 세라 (그림 3 과 6)와 IVIg (그림 5)의 상업적인 준비에 체액 성 면역 응답을 정의 하기 위한 적합 한 플랫폼입니다 것으로 나타났습니다. 우리는 또한 microarray 기술은 기존의 ELISA (그림 2)에 비교 될 때 잘 수행 하 고 내부 및 남북 assay variabilities 정밀 ( 의 허용 한계 내로 우수한 재현성을 보여줍니다 증명 하고있다 표 1).

중요 한 단계:
어떤 성공적인 항 원 microarray 플랫폼을 구축할 때 중요 한 단계 수를 다음 합니다. 처음에, 그것은 매우 품질 실험을 실행 하는 것이 중요입니다. .......

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감사의 글

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이 연구는 헤르메스 친목 올라요 Negm 타 냐 모나 고 노팅엄 소화 질환 센터와 NIHR 노팅엄 소화 질병 생물 의학 연구 센터에서 별도 자금을 통해 지원 했다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
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칸디다 알비칸스 용해물NIBSCPR-BA117-S양성 대조군
파상풍 톡소이드 Athens Research and Technology04/150양성 대조군
면역글로불린 G(IgG), 정상 인간 혈장  아테네 연구 및  기술   16-16-090707정제된 네이티브 인간 면역글로불린 G IgG, 인간 혈장. 
면역글로불린 G1 (IgG1), 정상 인간 혈장  아테네 연구 및  기술   16-16-090707-1정제된 네이티브 인간 면역글로불린 G1 IgG1, 인간 플라즈마. 
면역글로불린 G2 (IgG2), 정상 인간 혈장  아테네 연구 및  기술   16-16-090707-2정제된 네이티브 인간 면역글로불린 G2 IgG2, 인간 플라즈마. 
면역글로불린 G3 (IgG3), 정상 인간 혈장  아테네 연구 및  기술   16-16-090707-3정제된 네이티브 인간 면역글로불린 G3 IgG3, 인간 플라즈마. 
면역글로불린 G4 (IgG4), 정상 인간 혈장  아테네 연구 및  기술   16-16-090707-4정제된 네이티브 인간 면역글로불린 G4 IgG4, 인간 플라즈마. 
면역글로불린 A(IgA), 인간 혈장  아테네 연구 및  기술   16-16-090701정제 토종 인간 면역글로불린 A(IgA), 인간 혈장.
면역글로불린 A1 (IgA1), 인간 골수종 혈장  아테네 연구 및  기술   16-16-090701-1M정제 토종 인간 면역글로불린 A1(IgA1), 인간 플라즈마.
면역글로불린 A2 (IgA2), 인간 골수종 혈장  아테네 연구 및  기술   16-16-090701-2M정제 토종 인간 면역글로불린 A2(IgA2), 인간 혈장.
면역글로불린 M(IgM), 인간 혈장  아테네 연구 및  기술   16-16-090713정제 토종 인간 면역글로불린 M(IgM), 인간 혈장.
Biotinylated Goat Anti-Human IgG 항체, 감마사슬 특이적Vector LabsBA-3080염소 항-인간 IgG(γ-chain specific)-비오틴 항체는 인간 IgG와 특이적으로 반응하지만 다른 면역글로불린과는 특이적으로 반응하지 않습니다.
마우스 안티 휴먼 IgG1 힌지 - BIOTSouthern Biotec9052-08 염소 항인간 IgG1 비오틴 항체는 인간 IgG1과 특이적으로 반응하지만 다른 면역글로불린과는 반응하지 않습니다.
마우스 안티-휴먼 IgG2 Fc-BIOTSouthern Biotec9060-08   염소 항인간 IgG2-비오틴 항체는 인간 IgG 2와 특이적으로 반응하지만 다른 면역글로불린과는 반응하지 않습니다.
마우스 안티-휴먼 IgG3 힌지-BIOTSouthern Biotec9210-08     염소 항인간 IgG3-비오틴 항체는 인간 IgG3와 특이적으로 반응하지만 다른 면역글로불린과는 반응하지 않습니다.
마우스 안티-휴먼 IgG4 pFc'-BIOTSouthern Biotec9190-08   염소 항인간 IgG-비오틴 항체는 인간 IgG와 특이적으로 반응하지만 다른 면역글로불린과는 반응하지 않습니다.
염소에서 만든 안티 휴먼 IgA, 알파 체인 특이적 - BiotinylatedVector LabsBA-3030염소 항 인간 IgG - 비오틴 항체는 인간 IgG와 특이적으로 반응하지만 다른 면역 글로불린과는 반응하지 않습니다.
마우스 항-인간 IgA1-BIOTSouthern Biotec9130-08염소 항-인간 IgG-비오틴 항체는 인간 IgG와 특이적으로 반응하지만 다른 면역글로불린과는 반응하지 않습니다.
마우스 안티-휴먼 IgA2-BIOTSouthern Biotec9140-08   염소 항인간 IgG 비오틴 항체는 인간 IgG와 특이적으로 반응하지만 다른 면역글로불린과는 반응하지 않습니다.
마우스 안티-휴먼 IgM-BIOTSouthern Biotec9020-08 염소 항인간 IgG-비오틴 항체는 인간 IgG와 특이적으로 반응하지만 다른 면역글로불린과는 반응하지 않습니다.
0.2 mm 주사기 필터Thermo scientific723-2520필터 5 % BSA.
소 혈청 알부민 (BSA)Sigma Aldrich, UKA7284슬라이드 차단에 5% BSA를 사용하십시오.
항체 희석제Dako, UKS3022혈청과 2차 항체를 희석합니다.
Streptavidin Cy5eBioscienceSA1011면역 반응 검출
정제 된 전체 C. 디피실 독소 A 및 B (독소 유형 0, 균주 VPI 10463, 리보 타입 087)독소 그룹, 공중 보건 영국NA
정제 된 전체 C. 디피실 독소 B (CCUG 20309 독소 B 만 발현 균주)독소 그룹, 공중 보건 영국NA
이진 독소 B 단편의 전구체 형태, pCDTb목욕 대학 NA완전 합성 재조합 유전자 구조체에서 E. Coli에서 생산됩니다. 027 리보타입(http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70)에서 공개된 서열을 기반으로 한 아미노산 서열정제
천연 전체 리보타입 특이적(001, 002, 027) 표층 단백질Dublin City University 
Vigam (IVIg 준비 1)Nottingham University Hospitals NHS TrustN/A
Privigen (IVIg 준비 2)Nottingham University Hospitals NHS TrustN/A
Intratect (IVIg 준비 3)Nottingham University Hospitals NHS TrustN/A
: 된 NA

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Negm, O. H., et al. Profiling humoral immune responses to Clostridium difficile.-specific antigens by protein microarray analysis. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (9), 1033-1039 (2015).
  2. Monaghan, T. M., et al.

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Clostridium difficile Antibody DetectionAntigen specific Antibody ResponseSerum Sample AnalysisArray Printing ProcedureFluorescence Intensity MeasurementELISA Correlation AnalysisIsotype Subclass DeterminationToxin A Toxin B DetectionPatient specific Immunotherapy Optimization

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