여기, 우리는 공간 계량 폐 결핵 육아 내 마약 배포판에 레이저 캡처 서 LC/MS 분석과 함께 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 접근은 광범위 한 적응성 높은 공간 세부 사항에서 조직 내의 약물 농도 측정 하는 있다.
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방법 논문
레이저에 의해 폐 결핵 병 변에서 약의 공간 정량화 캡처 서 액체 착 색 인쇄기 질량 분석 (LCM-LC/MS)
이 논문에서
요약
초록
결핵은 여전히 병 적 상태와 사망률 전세계의 주요 원인. 기존 약물 regimens 개선 및 새로운 치료제의 개발 시급히 필요 됩니다. 도달 하 고 저조한 나가도록 괴 지역 (caseum) 폐 육아의 박테리아 살 균 약 복용된 결핵 약의 능력은 성공적인 치료 적 개입에 대 한 중요 합니다. 효과적인 치료 regimens 따라서 유리한 caseum 침투 특성을 가진 약물을 포함 해야 합니다. 생물 조직에 마약 수준 측정을 위한 현재 LC/MS 방법 제한 된 해상도 기능, 그 안에 발견 같은 작은 조직 구획 내에서 절대 약물 농도 정확 하 게 결정 하 고 어려운 괴 사 성 육아입니다. 여기 우리는 LC/MS 정량화와 병 적 별개 조직 영역의 레이저 캡처 기정 (LCM)를 결합 하는 프로토콜을 제시. 이 기술은 육아 caseum, 세포 병 변 및 uninvolved 폐 조직 내 약물의 절대 정량화 하며, 따라서, 정확 하 게 살 균 농도 달성 되 고 있는지 여부를 결정 합니다. 결핵 연구, 뿐만 아니라 기술 병 조직에 약물의 공간 해결 정량화에 대 한 많은 잠재적인 응용 프로그램을 하고있다.
서론
공간을 해결 하 고 마약 수준 계량 능력 결핵 약물 농도1살 균에서 폐 병 변 내의 박테리아 모집단에 도달 여부를 결정 하기 위한 중요 한 요구 사항입니다. 특별 한 중요성의 일반적으로 이십시오의 가장 높은 수를 포함 하 고 마약 vascularization의 부재 때문에 액세스할 수 있습니다 (caseum 라고) 하는 병 변의 괴 핵심으로 약물 침투를 결정 이다.
삭제 폐 병 변의 균질 화를 포함 하는 병 변 침투를 평가 하기 위해 전통적인 방법 뒤에 용 매 추출 및 액체 착 색 인쇄기 질량 분석 (LC/MS) 분석, 매우 민감하고의 마약에 대 한 선택적 관심입니다. 그러나,이 메서드는 원래 무 균된 조직의 크기를 제한 하는 불 쌍 한 공간 정보를 제공 합니다. 질량 분석 기반 이미징 등 방법을 매트릭스 보조 레이저 탈 착 이온화 (MALDI)2,3, desorption 분무 이온화 (DESI)4 또는 표면 추출 액체 강화 된5, 6 높은 공간 해....
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프로토콜
모든 동물 연구 관리 및 승인 기관 동물 관리에서 국립 보건원의 실험 동물의 사용 및 사용 위원회의 NIAID (NIH), 베 데스 다, 메릴랜드에 대 한 가이드에 따라 수행 했다
1. 동물 실험 및 조직 컬렉션
이 섹션은 프로토콜의 동물 절차 및 Biosafety 수준 3 (BSL3) 조건 하에서 샘플 컬렉션을 설명합니다. 토끼에서 프로토콜 되었습니다 결핵균 에 어로 졸 감염 절차 및 약물 관리의 상세한 프로토콜 기술 이전11,12.
- 뉴질랜드 백색 토끼 (남녀 4-5 개월에) M. 결핵 HN878 감염 앞11에서 설명한 코 전용에 어로 졸 시스템을 사용 하 여.
- 기본 루트를 통해 선택한 마약 (여기에 제시 된 예에서 Ethambutol)를 관리 하 고 2, 6, 및 24 시간 관리 다음에 동물을 안락사. 첫째, 5 mg/kg에서 35 mg/kg 및 Xylazine에서 케 타 민의 근육 주사로 토끼를 anesthetize. 10 분 기다립니다 고 적절 한 anesthetizatio....
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결과
LCM-LC/MS 접근에 대 한 개요는 그림 1에 표시 됩니다. 감마-방사선에 의해 조직 살 균, 후 (조직 단면 이후)에서 모든 후속 단계 BSL3 조건 이상으로 일어난다. 그림 2 조직 격리 LCM 전후 생 섹션 병 변이 보여준다. 결핵 병 변 괴과 세포 분야를 쉽게 식별 하 고 광학 이미지 (인접 조직 조직학 얼룩이 섹션을 참조 하십시오 요구) 없이 혼자의 검사에 의해 분리 될 수 있습니다. 해 부 과정 생성 주변 조직에 최소한의 소란와 함께 깨끗 한 컷 하 고 해 부 3 백만 µ m2 (3 m m2) 병 변에서 각 지역의 총에서 약 1 시간 걸립니다.
추출 효율과 LCM-LC/MS 방법의 안정성은 Ethambut.......
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토론
공간 해결 정량화 폐 결핵 병 변 내 약물의 약물 노출에 다른 병 변 구획 내에서 거주 하는 세균성 인구에 살 균 농도 도달 여부를 확인 하기 위해 필요 합니다. 여기에 설명 된 LCM-LC/MS 메서드는 총에서만 1-3 조직 단면도 사용 하 여 박테리아-부유한 caseum를 포함 하 여 모든 병 변 구획 내에서 안티-결핵 약물의 절대 정량화를 수 있습니다. 전통적인 조직 균질 및 LC/MS 방법 조직에 마약 정량화 종종 특정 병 변 구획을 해결 하려면 공간 특이성 부족 이며, 경우에 상당한 잠재력을 교차 오염 휴대 하 고 수동 추출 과정에서 괴 사 성 병 변 지역입니다.
LCM-LC/MS 접근 이미징 기술과 질량 분석을 기반으로 몇 가지 주요 장점이 있습니다. 이 중 기본 방법의 완전히 양적 기능과 해결 컬럼에 분리를 통해 내 생 종 방해 억제 약물 인 LC/MS 분석의 추가 감도 있습니다. 그러나, MALDI-MSI 자세한 마약 유통에 관한 공간 정보를 제공 합니다. MALD.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
우리 폴 오 브라이언, 감사 미 나 Marizel와 동물 실험에 대 한 이자벨 프리먼, Jacquie 곤잘레스 NIH/NIAID에서 다니엘 이너 원고에 대 한 레이저 캡처 기정 Jansy Sarathy 이전 토끼 조직의 감마 방사선에 대 한 생각과 조언입니다. 이 작품은 법안에서 자금에 의해 지원 되었다 고 멜 린다 게이츠 재단 (OPP1174780)와 공유 하는 NIH 계측 1S10OD018072를 부여 합니다. 우리 감사 Eliseo A. Eugenin Leica LMD 6500 현미경에 대 한 액세스를 제공 하 고 전문 지식 및 조언을 공유. 구입, 그리고 지속적인 지원, LMD 6500는 국립 정신 건강 연구소 그랜트, MH096625, 신경 성 질환의 국가 학회 및 치기, NS105584, PHRI (E.A.E)에 자금와 GSK 기여 (E.A.E)에 의해 투자 되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 뉴질랜드 흰 토끼 | Covance | N / A | |
| HN878 Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
| Ketathesia (Ketamine) 100 mg / mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
| Anased (Xylazine) 100 mg / mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
| Euthasol (펜토 바르비탈 나트륨 및 페니토인 나트륨) 용액 | Virbac | 710101 | |
| Acetonitrile (LC-MS grade) | Fisher | A955-212 | |
| Methanol (LC-MS grade) | Fisher | A456-212 | |
| Formic Acid (LC-MS grade) | Fisher | A117-50 | |
| Water (LC-MS grade) | Fisher | W6212 | |
| 0.2 mL flat-cap PCR tubes | Corning | 07-200-392 | |
| 스틸 프레임, PET-멤브레인 | Leica | 11505151 | |
| 프리미엄 서리 현미경 슬라이드 | Fisher | 12-544-2 | |
| 96 딥 웰 플레이트 2.0ML PP RB | Fisher | NC0363259 | |
| Zorbax SB-C8 컬럼 (4.6 by 50 mm; 입자 크기, 3.5 μ m) | 애질런트 | 820631-001D | |
| "지퍼" 밀봉 샘플 백 | Fisher | 01-816-1B | |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| Equipment | |||
| CM1850 cryostat | Leica | Discontinued | Leica CM1860은 현재 모델 |
| 레이저 미세해부 시스템 6500 | Leica | 단종 | Leica LMD 6은 현재 모델인 |
| Agilent 1260 Infinity II, HPLC | , Agilent | ||
| API 4000, QTRAP 질량 분석기 | , Sciex |
참고문헌
- Dartois, V. The path of anti-tuberculosis drugs: From blood to lesions to mycobacterial cells. Nat Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).
- Prideaux, B., et al. The association between sterilizing activity and drug distribution into tu....
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재인쇄 및 허가
