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방법 논문

성인 귀 피부에 대 한 전체 실장 Confocal 현미경 검사 법: 신경-혈관 분기 Morphogenesis 및 면역 세포 분포를 연구 하는 모델 시스템

13.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57406

⸱

2018년 3월 29일

 ,  , 
1Laboratory of Stem Cell and Neuro-Vascular Biology, Genetics and Developmental Biology Center, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Earle A. Chiles Research Institute, Robert W. Franz Cancer Center, Providence Portland Medical Center

이 논문에서

요약

여기, 분기 morphogenesis 면역 세포 분포 뿐만 아니라 주변 신경 및 혈관의 패턴을 시각화 수 있습니다 전체 성인 마우스 귀 피부에 높은 해상도 전체 마운트 이미징 방법을 설명 합니다.

초록

여기, 우리는 전체 산 성인 귀 피부 세포 수준에서 면역 세포 분포 뿐 아니라 포괄적인 3 차원 신경-혈관 분기 morphogenesis 패턴화, 공부 하 기술 이미징의 프로토콜 제시. 성인 조직에 주변 신경 및 혈관 해 부 구조 분석 기능 신경-혈관 배선 및 상처 치유 등의 병 적인 상태에 신경-혈관 변성의 이해에 몇 가지 통찰력을 제공합니다. 매우 유익한 모델 시스템으로 우리 해 부에 쉽게 접근할 수 있는 성인 귀 피부에 우리의 연구를 집중 했다. 전체 피부, 말 초 신경 (감각 축 삭, 공감 축 삭, Schwann 세포), 혈관 (내 피 세포와 혈관 평활 근 세포에서에서 세포 구성 성분의 정확한 묘사를 제공 하는 우리의 간단 하 고 재현 가능한 프로토콜 ), 그리고 선 동적인 세포. 우리는이 프로토콜 주변 신경 및 혈관에 있는 형태학 적 이상 뿐만 아니라 다른 병 적인 조건 하에서 성인 귀 피부에 염증을 조사 하는 방법을 포장 됩니다 믿습니다.

서론

피부는 3 개의 층으로 이루어져: 표 피, 진 피 및 hypodermis. 그것은 줄기 세포 유지 보수, 차별화, 및 개발으로 재생, tumorigenesis, 및 성인에서 염증 morphogenesis 공부를 모델 시스템으로 사용 되었습니다. 피부 나가도록 풍부한 이며 innervated 주변 신경 및 혈관 시스템의 개발은 잘 조정 되도록 합니다.

우리는 이전 여러 라벨 그대로 주변 신경 및 혈관 그들의 세포질 구성 요소1,2,3, 를 포함 하 여 공부를 함께 전체-마운트 배아 피부 이미징 기술을 증명 하고있다 4: 감각 축 삭, 공감 축 삭, Schwann 신경 세포, 내 피 세포, pericytes, 및 혈관에 혈관 부드러운 근육 세포 (VSMCs). 신생, 동안 기본 모 세관 네트워크 집중적인 혈관 개장 겪 습와 계층적 혈관 분기 네트워크로 개발. 개발 진 피 하거나 hypodermis 동맥 말 초 감각 신경 및 혈관 분기 다음 동맥에 인접 한 양식. 계층적 혈관 네트워크는 철저 하 게 VSMCs 덮여, 후 교감 신경 따라 확장 하 고 큰 직경 혈관1,,56을 자극. 개발 신경 및 혈관 시스템 사이 가까운 협회에 중요성에도 불구 하 고 주요 질문 성인에서 다양 한 병 적인 상황에서 신경-혈관 네트워크에 어떻게 해결 되었습니다. 3-차원 고해상도 영상 해부학 인식할 수 분기 morphogenesis 및 패터 닝 pathogenesis 감사 필요가 있다.

성인 마우스 피부에서 신경 및 혈관 morphogenesis 조직 섹션 얼룩에 의해 일반적으로 분석 된다. 다른 연구 주변 신경 및 혈관, 모 낭, 피지 선 땀 샘, 및 arrector pili 근육7,,89시각화 하 피부 전체 마운트 이미지를 사용 했습니다. 그러나, 성인 피부 두께 전체 깊이에 피부를 분석 하기 어려운 하 게 했다.

현재 연구에서 우리는 이러한 과제를 극복 하기 위해 성인 귀 피부의 새로운 고해상도 전체 마운트 이미징 개발. 귀 피부는 쉽게 액세스할 수 해 부 및 피부 이후 전체 마운트 이미징에 대 한 그것의 전체 깊이 통해. 따라서, 포괄적인 부 량 측정, 피부에 주변 신경 및 혈관 시스템의 3 차원 구조를 비교에 적용 될 수 있는 간단 하 고 매우 재현 방법입니다. 우리는 큰 직경 혈관 주변 감각 및 교감 신경의 맞춤 성인 피부에서 유지 됩니다 설명 했다. 이 프로토콜의 목표는 분기 morphogenesis, 및 주변 신경 및 혈관, 뿐만 아니라 염증 등 다양 한 조건에서 성인 마우스 모델에서 세포 수준에서 면역 세포 분포의 패턴을 시각화 하 고 재생입니다.

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프로토콜

이 섹션에서 모든 실험 국가 심 혼, 폐 및 혈액 연구소 (NHLBI) 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인에서 수행 했다.

1. 성인 마우스 귀 피부 컬렉션

  1. 닫힌된 챔버에 이산화탄소 (CO2) 노출 성인 쥐를 안락사 고 자 궁 탈으로는 안락사를 확인 합니다.
    참고: 실험 안락사 방법에 대 한 국립 보건원 (NIH) 지침을 따릅니다.
  2. 베이스에서 귀 부하 고 35 x 10 m m2 2 mL의 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)를 포함 하는 배양 접시에. 짧게가 위로 머리카락을 잘라.
  3. 후부 피부와 개입 연골에서 신중 하 게 멀리 앞쪽 피부 껍질.
    참고: 연골 앞쪽 피부를 연결합니다.
  4. 뒷부분을 전송 하 고 잘 24에 별도로 앞쪽 피부 플레이트 차가운 신선한 4 %paraformaldehyde (PFA) 잘 당 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 포함 1 mL. 4%에서 후부와 앞쪽 피부를 평평 하 게 PFA.
  5. 1 시간에 4 ° C에서 연골 후부와 앞쪽 피부를 해결할.
  6. 부드러운 실 온에서 믹서에 혼합 된 PBS의 1 mL에 3 시간 5 분 대 한 사후와 앞쪽 피부를 씻어.
  7. 35 x 10 m m2 페 트리 접시의 아래쪽 연골 후부와 앞쪽 피부를 전송 합니다. 접혀 있는 지방 및 결합 조직에는 기본 지역 차단. 고급 곡선된 겸 자 사용 하 여 앞쪽 피부에서 연골을 벗기다.
  8. 조심 스럽게 후부 피부 좋은 곡선된 핀셋을 사용 하 여 내부에서 결합 조직, 지방 조직, 머리카락을 제거. PBS와 젖은 피부 유지.

2. 전체 마운트 Immunohistochemical 마우스 귀 피부 얼룩

참고: 다음 섹션에서 모든 실험 NIH 실험실 안전 지침에 따라 수행 했다.

  1. 블로킹 버퍼를 준비 합니다. 필터 10% 열 비활성화 염소 혈 청 (HIGS) 희석 PBS에 0.2% 트라이 톤 X-100 (TX-100) 블로킹 버퍼, 또는 10% 당나귀 혈 청 (DS)에 희석 PBS 0.2%와 0.45 μ m 필터 단위를 사용 하 여 TX 100 차단 버퍼.
  2. 뒷부분을 전송 하 고 앞쪽 피부는 24 잘 포함 1 mL 10 %HIGS 차단 버퍼 또는 잘 당 10 %DS 블로킹 버퍼의 접시. 부드러운 실 온에서 믹서에 혼합으로 30 분 동안 피부를 품 어.
  3. 블로킹 버퍼에 1 차 항 체 (테이블의 재료)를 diluting 하 여 1 차적인 항 체 솔루션을 준비 (중 10 %HIGS 또는 10 %DS).
    참고: 전체 mout immunohistochemical 분석 성인 귀 피부 팬 신경 마커 신경 관련 클래스 III β-tubulin에 항 체 (Tuj1, 토끼 polyclonal IgG 또는 마우스 monocloncal IgG2a, 2 µ g/mL의 최종 농도에서 1: 500 희석) 팬-내 피 세포 마커 혈소판 내 피 성장 세포 접착 분자 1 (PECAM-1, 단일 클로 널 햄스터 IgG, 1:300 희석 3.3 µ g/mL의 최종 농도에), myelin 칼 집 마커 myelin 기본적인 단백질 (MBP, polyclonal IgG, 1: 200 희석에 토끼는 5 µ g/mL의 최종 농도) 및 염증 성 골수성 세포 마커 CD11b (단일 클로 널 IgG2b, 1시 50분을 쥐 20 µ g/mL의 최종 농도에 희석) 그림 1 과 그림 2에 표시 했다. 피부 혈관 평활 근 세포 마커 α 부드러운 근육 걸 (αSMA) 이차 항 체 (2.6) 함께 대 한 Cy3 활용 된 항 체와 알을 품는. 우리 자신에 의해 테스트 1 차 항 체는 테이블의 자료에 나와 있었다. 다른 종에서 파생 된 여러 기본 항 체 동시에 혼합 수 있습니다.
  4. 후부 및 앞쪽 피부 기본 항 체 솔루션의 150 µ L을 포함 하는 새로운 잘 전송. 부드러운 하룻밤 4 ° C에서 믹서에 혼합 된 피부를 품 어.
  5. 다음 날, 24 잘 플레이트에 새로운 우물을 후부와 앞쪽 피부를 전송 하거나 1 차 항 체를 포함 하는 블로킹 버퍼 발음. PBS 0.2% TX 100 세척 버퍼 또는 2% 0.2% TX 100 세척 버퍼 PBS에 희석 DS에에서 HIGS 희석 중 2%의 1 mL를 추가 합니다. 3 변화 세척 버퍼 부드러운 실 온에서 믹서에 혼합과 마다 15 분의 피부를 씻어.
  6. 이차 항 체 솔루션 (재료의 테이블)을 준비 합니다. 블로킹 버퍼에서 이차 항 체 희석 (중 10 %HIGS 또는 10 %DS)와 필터 차단 버퍼 0.22 μ m polyvinylidene difluoride (PVDF) 막 주사기 필터를 통해 2 차 항 체를 포함 하는 1 mL 주사기에 연결.
    참고: 알 렉 사 488 또는 633 활용 된 염소-토끼 IgG (H + L) 또는 Tuj1, 알 렉 사 647 활용 된 염소 항 햄스터 IgG (H + L) PECAM-1, 알 렉 사 488 활용 된 염소-토끼 IgG (H + L), MBP에 IgG2a 마우스 및 알 렉 사 594 활용 된 쥐 IgG (H + L) CD11b 사용 했다 8 µ g/mL의 최종 농도에서 1: 250 희석으로 피부는 Cy3 활용 된 αSMA 항 체 (2-3 µ g/mL의 최종 농도에서 1: 500 희석) 조합에서이 2 차 항 체와 함께 알을 품는.
  7. 블로킹 버퍼에서 이차 항 체의 집계 된 입자를 제거 하는 10 분 13000 x g에서 솔루션 원심
    참고: 다른 형광 활용된 2 차 항 체 종에서 파생 된 동시에 혼합 수 있습니다.
  8. 잘 포함 하는 2 차 항 체 솔루션의 150 µ L를 후부와 앞쪽 피부를 전송 합니다. 랩 24 잘 접시 알루미늄 호 일을 빛을 피하기 위해 1 시간 실 온에서 믹서에 부드럽게 혼합과 피부를 품 어에.
  9. 24 잘 플레이트에 새로운 우물을 후부와 앞쪽 피부를 전송 하거나 피펫으로 여 이차 항 체 솔루션을 완벽 하 게 발음 합니다. 2 %HIGS 세척 버퍼 또는 2 %DS 세척 버퍼의 1 mL를 추가 합니다.
  10. 24 잘 접시 알루미늄 호 일에 포장 하 고 실 온에서 믹서에 부드러운 혼합으로 15 분 마다 세척 버퍼의 3 변화 씻어.

3. 슬라이드에서 귀 피부 장착

  1. 35 x 10 m m2 페 트리 접시의 하단에는 피부를 놓습니다. 조심 스럽게 제거 머리카락, 지방 조직, 결합 조직, 먼지, 그리고 섬유의 광범위 한 사진 표백을 최소화 하기 위해 낮은 조명 stereomicroscope 아래 고급 곡선된 겸 자 사용 하 여 피부 안쪽에서. PBS와 젖은 피부 유지.
  2. 집게를 사용 하 여 접착제 현미경 슬라이드를 피부를 전송 합니다. 내부는 후부와 앞쪽 피부 장소 슬라이드에 직면. 집게를 사용 하 여 피부를 평평 하 게.
  3. Photobleaching를 방지 하 고 보존 형광 신호를 액체 방지 페이드 장착 매체에 피부를 탑재 합니다. 없음 기포 또는 피부 주위에 다는 것을 확인 하십시오.
  4. 신중 하 게 피부 샘플에 coverslip로 커버 하 고 장착 미디어 회사를 얻을 수 있도록 실내 온도에서 어두운 하룻밤에 탑재 된 피부 샘플 슬라이드를 저장 합니다. 매니큐어와 슬라이드에 coverslip 봉인 하 고 장기 저장을 위한 4 ° C에서 저장 합니다.

4. confocal 현미경 검사 법

  1. Fluorophores에 대 한 적절 한 레이저를 설정 합니다. 3 레이저 소스 (아르곤 488 nm, DPSS 561 nm와 HeNe 633 nm)와 confocal 현미경은이 실험에 사용 됩니다.
  2. 동시에 방지 하 고 모든 중복을 줄이기 위해 트리플 스테인드 샘플 흥분 순차적 검사 도구를 사용 합니다.
    참고: 이미지 순차 스캔 모드를 사용 하 여 순차적으로 이동 합니다.
  3. 10 X 목표 아래 이미지입니다. 타일 검사 도구를 사용 하 여 전체 귀 피부를 잡으려고. Z-스택 설정 하 고 z-위치 귀 피부의 전체 두께 다루고 있는지 확인 하십시오.

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결과

성인 마우스 후부 귀 피부 (그림 1A)와 귀 앞쪽 피부 (그림 1B) 했다 αSMA (레드), Tuj1 (녹색), 항 체와 함께 immunostained 및 PECAM-1 (파란색). 후부 피부 immunostained 신경-면역 배포 CD11b (적색) 및 MBP (녹색), Tuj1 (파란색)와 (그림 2A)에 항 체를 사용 하 여 공부를 했다. CD11b의+ 염증 세포, 대 식 세포를 포함 하 여 단일 세포 해상도 (그림 2B)에서 발견 되었다.

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토론

이 프로토콜 성인 귀 피부 신경-혈관 구조와 면역 세포 분포의 분석에 대 한 전체-마운트 immunonohistochemical 영상을 설명합니다. 우리는이 방법은 장점이 수많은 실험 연구자 분기 morphogenesis 주변 신경 및 혈관의 패턴화와 면역 세포와 머리를 포함 하 여 피부 구성의 3 차원 분포 연구에 대 한 생각 모 공입니다. 화상의 결과 추가 정량 분석에 대 한 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 측정할 수 있습니다.

귀 피부의 적절 한 준비는이 프로토콜의 성공을 위해 중요. 첫째, 귀 피부 해야 될 신중 하 게 해 부 마우스 euthanizing 후 곧. 귀 피부의 후부 부분은 연골에서 벗 겨 한다. 다음, 연골 해야 될 벗 겨 앞쪽 피부에서 얼룩이 지기 전에. 둘째, 결합 조직, 지방 조직, 및 머리카락 제거 되어야 한다 하 고 철저 하 게 부드럽게 장착 하기 전에. 피부 표면에 주변 신경의 존재로 인해 주의 제거 신경의 손상을 방지 하려면 필요 합니다. 셋째,...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

우리 실험실 관리 K. 길 감사, 기술 지원, 제이 호킨스와 직원의 국립 보건원 (NIH) 건물 50 동물 마우스 관심과 R. 리드와 지원에 대 한 시설과 관리 지원에 대 한 F. Baldrey. 공유 감사 미 링크를 사와 M. Udey에 또한 그들의 귀 피부 해 부 프로토콜, 편집 도움말 및 줄기 세포 연구실의 구성원에 대 한 명. 화상 및 기술 도움말 및 사려깊은 토론에 대 한 신경-혈관 생물학. 토니 야 마자 키 과학 진흥 (JSP) NIH-KAITOKU에 대 한 일본 사회에 의해 지원 되었다. 이 작품은 국가 심 혼, 폐, 혈액 연구소 (HL005702-11 사원)의 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10 x 인산염 완충 식염수KD MedicalRGE-3210PBS, Ca2+/Mg2+
Hank' 제외 s 균형 잡힌 소금 용액Gibco14025-092HBSS, Ca2+/Mg2+
16% 파라포름알데히드전자 현미경 과학15710PFA, 고정제, PBS에 희석
Triton X-100SigmaX100세제
Normal 염소 세럼Gibco16210064차단/세척 버퍼
구성 요소 Normal 당나귀 혈청Jackson Immuno research017-000-121차단/세척 버퍼의 구성
요소 곡선형 미세 핀셋DumontRS-5047
곡선형 핀셋Integra Miltex VantageV918-782, V918-784
필터 유닛 0.45 mmThermo Scientific157-0045여과용
1 mL 주사기Coviden8881501400용 여과
주사기 필터 유닛 0.22 mmMillex-GVSLGVR04NL여과용
ProLong GoldThermo ScientificP36934페이드 방지 마운팅 매체
매니큐어전자 현미경 과학72180밀봉용
해부 현미경LeicaMZ95
컨포칼 현미경LeicaTCS SP5
Photoshop CC 2017Adobe그래픽 편집기 소프트웨어
Illustrator CC 2017Adobe그래픽 편집기 소프트웨어
Image JNIH이미지 처리 소프트웨어
Anti-PECAM-1 (CD31) 항체MilliporeMAB1398ZHamster IgG, 혈관 내피 세포 마커, 1:300
Anti-PECAM-1 (CD31) 항체BD Pharmingen553369Rat IgG2a kappa, 혈관 내피 세포 마커, 1:300
Anti-αSMA 항체 conjugated with cy-3SigmaC6198Mouse IgG2a, 혈관 평활근 세포 마커, 1:500
Anti-EphB1 항체Santa Cruzsc-9319염소 다클론, 정맥 내피 세포 마커, 1:100
Anti-neuron-specific Class III β-tubulin (Tuj1)AbcamAB18207Tuj1, 토끼 다클론 IgG, 범축삭 마커, 1:500
Anti-Tuj1 항체CovanceMMS-435P마우스 IgG2a, 범 축삭 마커, 1:500
Anti-MBP 항체AbcamAB40390Rabbit polyclonal IgG, 수초화 마커, 1:200
항티로신 하이드록실라제 항체ChemiconAB152토끼 다클론성, 교감신경 마커, 1:500
항-페리페린 항체ChemiconAB1530Rabbit polyclonal, peripheral neuron marker, 1:1000
Anti-CD11b antibodyBio-RadMCA74GRat IgG2b, inflammatory cell marker (macrophage), 1:50
Anti-CD45 antibodyThermo Fisher Scientific14-0451-85Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietic cell marker, 1:500
Anti-CD3 antibodyBio-RadMCA1477TRat IgG1, 면역 세포 마커, 1:100
Anti-CD45R (B220) 항체Thermo Fisher Scientific14-0452Rat IgG2a kappa, 염증 세포 마커, 1:200
Anti-GFP 항체Thermo Fisher ScientificA11122Rabbit polyclonal, 1:300
Anti-GFP 항체AbcamAb13970Chicken polyclonal, 1:500
Anti-β-gal 항체Cappel55976토끼 다클론성, 1:5000
Anti-RFP 항체AbcamAb62341토끼 다클론성, 1:300
염소 항토끼 IgG(H+L) Alexa 488Thermo Fisher ScientificA11034토끼 다클론 2차 항체, 1:250
염소 항햄스터 IgG(H+L) Alexa 647Jackson Immuno research127-605-160햄스터 다클론 2차 항체, 1:250
염소 항 쥐 IgG (H + L) Alexa 594Jackson Immuno 연구112-585-167쥐 polyclonal 2 차 항체, 1:250
염소 항 마우스 IgG2a Alexa 633Thermo Fisher ScientificA21136마우스 IgG2a 2 차 항체, 1:250

참고문헌

  1. Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
  2. Mukouyama, Y. S., James, J., Nam, J., Uchida, Y. Whole-mount confocal microscopy for vascular branching morphogenesis. Methods Mol Biol. 843, 69-78 (2012).
  3. Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo. J Vis Exp. , (2011).
  4. Yamazaki, T., et al. Tissue Myeloid Progenitors Differentiate into Pericytes through TGF-beta Signaling in Developing Skin Vasculature. Cell Rep. 18, 2991-3004 (2017).
  5. Mukouyama, Y. S. Vessel-dependent recruitment of sympathetic axons: looking for innervation in all the right places. J Clin Invest. 124, 2855-2857 (2014).
  6. Li, W., et al. Peripheral nerve-derived CXCL12 and VEGF-A regulate the patterning of arterial vessel branching in developing limb skin. Dev Cell. 24, 359-371 (2013).
  7. Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. J Vis Exp. , e51749(2014).
  8. Salz, L., Driskell, R. R. Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin. J Vis Exp. , (2017).
  9. Liakath-Ali, K., et al. Novel skin phenotypes revealed by a genome-wide mouse reverse genetic screen. Nat Commun. 5, 3540(2014).
  10. Gunawan, M., et al. The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin. Nat Immunol. 16, 505-516 (2015).
  11. Avci, P., et al. Animal models of skin disease for drug discovery. Expert Opin Drug Dis. 8, 331-355 (2013).
  12. Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. Animal models of atopic dermatitis. J Invest Dermatol. 129, 31-40 (2009).
  13. Wagner, E. F., Schonthaler, H. B., Guinea-Viniegra, J., Tschachler, E. Psoriasis: what we have learned from mouse models. Nat Rev Rheumatol. 6, 704-714 (2010).
  14. Nunan, R., Harding, K. G., Martin, P. Clinical challenges of chronic wounds: searching for an optimal animal model to recapitulate their complexity. Dis Model Mech. 7, 1205-1213 (2014).
  15. O'Brien, P. D., Sakowski, S. A., Feldman, E. L. Mouse models of diabetic neuropathy. ILAR J. 54, 259-272 (2014).
  16. Yamazaki, T., et al. Whole-Mount Adult Ear Skin Imaging Reveals Defective Neuro-Vascular Branching Morphogenesis in Obese and Type 2 Diabetic Mouse Models. Sci Rep. 8, (2018).

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