조립 및 프로토 타입 거품 바이러스 Intasomes의 정화

요약

재조합 retroviral integrase와 바이러스 성 DNA 끝을 흉내 낸 DNA 올리고는 intasome로 알려진 복잡 한 효소 활성을 형성할 수 있다. Intasomes 생화학, 구조, 및 키네틱 연구에 대 한 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 조립 및 프로토 타입 거품 바이러스 intasomes를 정화 하는 방법을 자세히 설명 합니다.

초록

A 기능 및 레트로 바이러스 라이프 사이클의 필요한 단계를 정의 하는 것은 주인 게놈으로 바이러스 성 게놈의 통합. 모든 레트로 바이러스는 호스트 DNA 가닥 전송으로 알려진 바이러스의 공유 결합 catalyzes integrase (IN) 효소를 인코딩합니다. 통합은 모델링 된 시험관에 재조합 retroviral in 되며 DNA 올리고 바이러스 성 게놈의 끝을 흉내 낸 수 있습니다. 더 밀접 하 게 통합 반응에서 발생 하 비보에, 통합을 정리 하기 위해 단지 감소 된 소금 농도 버퍼에서 투 석 하 여 재조합 및 합성 올리고에서 조립 된다. intasome 라는 통합 복잡 한, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 순화 될 수 있습니다. 프로토 타입 거품 바이러스 (PFV)의 경우는 intasome에 tetramer 및 2 개의 DNA 올리고 이며 단위체에 무료 올리고 DNA 머에서 쉽게 분리 된다. PFV intasomes의 통합 효율성 다양 한 역학을 보다 잘 이해 하려면 실험 조건 및 retroviral 통합의 역학 분석 될 수 있습니다.

서론

호스트 게놈으로 바이러스 성 게놈의 통합 모든 레트로 바이러스¹의 라이프 사이클에는 필수 단계입니다. 바이러스 성 효소 integrase (IN) catalyzes 호스트 DNA에 바이러스 성 DNA 게놈의 각 끝의 공유 결합. 세포 감염 동안에 통합을 중재 하는 사전 통합 복잡 한의 일부가입니다. 재조합에 더블 좌초 DNA 올리고 흉내 낸 바이러스 성 DNA 끝에 complexed는 대상 DNA 생체 외에서²에 통합을 수행할 수 있습니다. 일반적인 통합 분석 결과 생체 외에서 supercoiled 플라스 미드 DNA 대상으로 사용합니다. 플라스 미드를 모두 바이러스 성 DNA 올리고 (vDNA)의 통합 선형 제품 귀착되 고 공동된 통합 (그림 2A) 이라고 불린다. 통합 분석 결과 생체 외에서 covalently 편안한 원에서 결과 대상 플라스 미드에 참가 한 vDNA와 제품을 얻을 또한 수 있습니다. 이 반 사이트 통합 제품 분석 결과 체 외의 인 것 처럼 보인다.

재조합에 및 vDNA 통합에서 생체 외에서수행할 수 있습니....

프로토콜

1. 어 닐 링 vDNA의

1. 결합 1 X 10 버퍼 (10 X 10 재고: 100 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 M NaCl, 10 mM EDTA), 10 µ M (5' 3' ATTGTCATGGAATTTTGTATATTGAGTGGCGCCCGAACAG, 100 µ M 재고), 올리고 1과 10 µ M 1.5 mL의 최종 볼륨에 올리고 2 (5' 3' CTGTTCGGGCGCCACTCAATATACAAAATTCCATGACA, 100 µ M 재고) . Aliquot 25 µ L 60 0.2 mL 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 튜브로.
   참고: 응용 프로그램에 따라 올리고 fluorophores 또는 5'-끝에 올리고 2의 또는 태그 기본 13 5'-끝 올리고 1에서 내부 아미노 T으로 수정할 수 있습니다. 수정 된 올리고 어 닐 링 전에 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 정화 한다. 우리는 intasome 어셈블리 효율을 10 배 감소 5'-끝 Cy3 또는 Cy5 fluorophore의 라벨 올리고 2 나타났습니다. 내부 fluorophore 라벨 어셈블리 효율을 감소 하지 않습니다.
2. 다음 시간과 온도 thermocycler를 사용 하 여 anneal: 1에서 99 주기 94.0 ˚C 3 분에 주기 (94.0 ˚C 1 분, 93.6 ˚C ....

결과

PFV intasomes 재조합 및 vDNA에서 조립 된다. 조립 후 intasomes 초 (그림 1)에 의해 정화 된다. 각 분수의 통합 활동을 supercoiled DNA 대상과 agarose 젤 전기 이동 법 (그림 2)와 분석 이다. 이 젤은 감지 EtBr (fluorophore, fluorophore 표시 vDNA 사용 하는 경우)로 설정 하는 형광 스캐너와 몇 군데. 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여, 밴드 픽셀 볼륨 통합 효율성 (그림 3)를 계산 하기 위해 사용할 수 있습니다. 높은 통합 효율성과 분수는 나중에 사용에 대 한 고정 스냅. 냉동된 분수 통합 활동 (그림 4), 조립된 intasomes의 장기 저장에 대 한 수 있도록 유지 합니다.......

토론

Retroviral 기능 통합을 수행 하 고 바이러스 성 수명 주기를 계속 하는 바이러스 성 게놈 DNA와 복잡 한 multimeric를 형성 한다. Intasome 당 단위체에의 수는 tetramers, octamers, 또는 가능 하 게 더 높은 순서 multimers^11,12,,1314수 있습니다. PFV intasomes는 모방 하는 바이러스 성 게놈 DNA 이중 가닥 DNA 올리고도 재조합 tetramer 종료³. 이러한 intasomes 구조와 동적 연구^3,5,13

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DNA 올리고머		IDT N/A	맞춤형 DNA 올리고
트리스 울트라 퓨어	고지라 정밀 화학 UTS1003
NaCl	P212121	RP-S23020
울트라퓨어 EDTA	Invitrogen/Gibco	15575
Amicon Ultra 0.5 mL 원심 필터	Sigma-Aldrich	Z677094-24EA	3 kDa MWCO
DTT	P212121	SV-DTT
BIS-TRIS 프로판,>=99.0% (적정)	Sigma-Aldrich	B6755-500G
ZnCl2	Sigma-Aldrich	208086
MgSO4	Amresco	0662
Glycerol	Thermo Fisher Scientific	G37-20
겔-로딩 팁, 1 - 200 μ L	Corning	CLS4853-400EA
면도날; 단일 날; 100/pk.; 100개 팩	Fisher Scientific	12-640
멸균 일회용 필터 유닛 PES 멤브레인 > 250mL	Thermo Fisher Scientific	568-0020
투석 튜빙 클립	Spectrum Labs	132734
6-8 kDa 10 mm 투석 튜빙	Spectrum Medical	132645
Superose 6 10/300 GL	GE Healthcare Life Sciences	17517201
고음질 표준 아가로스	AGTC Bioproducts	AG500D1
에티듐 브로마이드	Thermo Fisher Scientific	BP1302
오렌지 G	Fisher Scientific	0-267
Hyladder 10kb, 500	Denville Scientific	CB4225-4

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