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방법 논문

조립 및 프로토 타입 거품 바이러스 Intasomes의 정화

5.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57453

⸱

2018년 3월 19일

 ,  , 
1Department of Cancer Biology and Genetics, The Ohio State University College of Medicine

이 논문에서

요약

재조합 retroviral integrase와 바이러스 성 DNA 끝을 흉내 낸 DNA 올리고는 intasome로 알려진 복잡 한 효소 활성을 형성할 수 있다. Intasomes 생화학, 구조, 및 키네틱 연구에 대 한 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 조립 및 프로토 타입 거품 바이러스 intasomes를 정화 하는 방법을 자세히 설명 합니다.

초록

A 기능 및 레트로 바이러스 라이프 사이클의 필요한 단계를 정의 하는 것은 주인 게놈으로 바이러스 성 게놈의 통합. 모든 레트로 바이러스는 호스트 DNA 가닥 전송으로 알려진 바이러스의 공유 결합 catalyzes integrase (IN) 효소를 인코딩합니다. 통합은 모델링 된 시험관에 재조합 retroviral in 되며 DNA 올리고 바이러스 성 게놈의 끝을 흉내 낸 수 있습니다. 더 밀접 하 게 통합 반응에서 발생 하 비보에, 통합을 정리 하기 위해 단지 감소 된 소금 농도 버퍼에서 투 석 하 여 재조합 및 합성 올리고에서 조립 된다. intasome 라는 통합 복잡 한, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 순화 될 수 있습니다. 프로토 타입 거품 바이러스 (PFV)의 경우는 intasome에 tetramer 및 2 개의 DNA 올리고 이며 단위체에 무료 올리고 DNA 머에서 쉽게 분리 된다. PFV intasomes의 통합 효율성 다양 한 역학을 보다 잘 이해 하려면 실험 조건 및 retroviral 통합의 역학 분석 될 수 있습니다.

서론

호스트 게놈으로 바이러스 성 게놈의 통합 모든 레트로 바이러스1의 라이프 사이클에는 필수 단계입니다. 바이러스 성 효소 integrase (IN) catalyzes 호스트 DNA에 바이러스 성 DNA 게놈의 각 끝의 공유 결합. 세포 감염 동안에 통합을 중재 하는 사전 통합 복잡 한의 일부가입니다. 재조합에 더블 좌초 DNA 올리고 흉내 낸 바이러스 성 DNA 끝에 complexed는 대상 DNA 생체 외에서2에 통합을 수행할 수 있습니다. 일반적인 통합 분석 결과 생체 외에서 supercoiled 플라스 미드 DNA 대상으로 사용합니다. 플라스 미드를 모두 바이러스 성 DNA 올리고 (vDNA)의 통합 선형 제품 귀착되 고 공동된 통합 (그림 2A) 이라고 불린다. 통합 분석 결과 생체 외에서 covalently 편안한 원에서 결과 대상 플라스 미드에 참가 한 vDNA와 제품을 얻을 또한 수 있습니다. 이 반 사이트 통합 제품 분석 결과 체 외의 인 것 처럼 보인다.

재조합에 및 vDNA 통합에서 생체 외에서수행할 수 있습니다 하지만 그들은 역학의 연구 또는 통합 복합물의 구조에 대 한 이상적인 약 단위체에 관련 시각화 모호한 것 때. 순화 통합 복합물, 또는 "intasomes," 동적 단일 분자 분석 또는 구조 연구에 필요한 있습니다. PFV에 및 vDNAs 수 있습니다 조립 될 투 석 하 여 상대적으로 높은 소금 농도 버퍼에서 낮은 염 농도3,4. 투 석, 한 침전 동안 양식. 이 침전 물은 투 석에서 제거 되 고 소금 농도 증가. 더 높은 소금 농도 촉진 포함 PFV intasomes solubilizes. intasomes 다음 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 정화 된다. 재조합 프로토 타입 거품 바이러스 (PFV)에 225 µ M5농도에서 솔루션에 단위체로 존재 하기 위하여 보였다. 초 분류 (44.4 kDa) 단위체 PFV와 무료 vDNA (24.0 kDa)에서 효과적으로 tetramer PFV에 및 2 개의 vDNAs를 포함 하는 PFV intasomes (225.5 kDa)를 구분 합니다. PFV intasomes 냉동 수 있습니다 그리고-80 ˚C에 저장의 적어도 6 개월에 대 한 통합 활동을 유지 합니다.

재조합 PFV intasomes 아미노산 대체 또는 잘림 돌연변이 또는 fluorophores 또는 biotin4,6으로 표시 하는 vDNAs에 포함 하도록 수정할 수 있습니다. 순화 PFV intasomes는 쉽게 DNA에서 생체 외에서supercoiled 플라스 미드 대상으로 통합을 수행합니다. Intasomes과 대량 생 화 확 적인 통합 분석 돌연변이, 억제제, 또는 다른 화학 첨가제에의 효과 테스트할 수 있습니다. Biotinylated intasomes는 핵 산 또는 단백질 선호도 조사를 사용할 수 있습니다. PFV intasomes는 두 vDNA 끝 또는 목표에 intasome 검색을 시각화 하기 위해 총 내부 반사 형광의 가입 사이 시간을 측정 하려면 자기 핀셋에 의해 단일 분자 현미경 분석에 대 한 허용 주위 온도에 기능적 DNA6. 또한, PFV intasomes 구조적으로 먼저 retroviral 통합3분야에 크게 영향을 미치는 특징 이었다.

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프로토콜

1. 어 닐 링 vDNA의

  1. 결합 1 X 10 버퍼 (10 X 10 재고: 100 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 M NaCl, 10 mM EDTA), 10 µ M (5' 3' ATTGTCATGGAATTTTGTATATTGAGTGGCGCCCGAACAG, 100 µ M 재고), 올리고 1과 10 µ M 1.5 mL의 최종 볼륨에 올리고 2 (5' 3' CTGTTCGGGCGCCACTCAATATACAAAATTCCATGACA, 100 µ M 재고) . Aliquot 25 µ L 60 0.2 mL 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 튜브로.
    참고: 응용 프로그램에 따라 올리고 fluorophores 또는 5'-끝에 올리고 2의 또는 태그 기본 13 5'-끝 올리고 1에서 내부 아미노 T으로 수정할 수 있습니다. 수정 된 올리고 어 닐 링 전에 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 정화 한다. 우리는 intasome 어셈블리 효율을 10 배 감소 5'-끝 Cy3 또는 Cy5 fluorophore의 라벨 올리고 2 나타났습니다. 내부 fluorophore 라벨 어셈블리 효율을 감소 하지 않습니다.
  2. 다음 시간과 온도 thermocycler를 사용 하 여 anneal: 1에서 99 주기 94.0 ˚C 3 분에 주기 (94.0 ˚C 1 분, 93.6 ˚C 1 분) 주기 당 0.8 ˚C 두 온도 감소 (마지막 주기는 14.8 ˚C 1 분, 14.4 ˚C 1 분) 4.0 ˚C에 저장 하 고.
  3. 모든 60 튜브에서 어 닐 링 반응 결합. 2 0.5 mL 3 kDa 분자량 컷오프 (MWCO) ultracentrifugal 필터 농도 단위 500 µ L을 로드 합니다. 실 온 (RT)에서 10 분 동안 14000 x g에서 microcentrifuge 원심 분리에 의해 단련 된 vDNA을 집중 한다.
    참고: retentate 볼륨 각 농도 단위 µ L ~ 50 이어야 한다.
  4. 삭제를 통해 흐름. 각 필터 단위를 나머지 단련된 vDNA의 250 µ L를 추가 합니다. 스핀을 반복 하 고 삭제를 통해 흐름. 450 µ L 테로 세 번 세척 하 여 테 버퍼 (10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA)에 exchange를 버퍼링 합니다.
  5. 필터 장치 및 실시간에 2 분 동안 1000 x g에서 스핀 반전 각 필터 단위에 대 한 최종 retentate 볼륨 ~ 50 µ L. retentates과 1.5 mL 스크류 캡 튜브에 결합 해야 합니다.
  6. vDNA의 260 nm 자외선 (UV) 흡 광도 측정 합니다. 마지막 어 금 니 DNA 농도 계산 하기 위해이 값을 사용 합니다. 이 vDNA의 소멸 계수 (ε260) 622,803 c m-1 M-1 이며 그 분자량은-20 ˚C에 23,972 검사 저장소.

2. Intasome 어셈블리

  1. 가능 하면 변수 온도와 작은 방에 intasome 어셈블리를 수행 합니다. 약 18-22 ˚C를 온도 조정 합니다.
    참고: 우리의 경험 4 ˚C에서 intasome 어셈블리 비효율적입니다.
  2. 저 어 접시에 볶음 바 2 리터 비 커에 투 석 버퍼 (20 mM 두번째-트리 스 프로 판, pH 7.5, 200 m NaCl, 2 m m dithiothreitol (DTT), 25 µ M ZnCl2m)의 1 리터를 준비 합니다. 적어도 6 h에 대 한 18-22 ˚C 방에 버퍼 equilibrate
  3. intasomes를, 50 mM 두번째-트리 스 프로 판, pH 7.5, 500 mM NaCl, 120 µ M PFV에, 및 150 µ L의 전체 볼륨에 50 µ M vDNA 결합.
    참고: PFV에 오염 nuclease 활동7,8의 무료 되어야 합니다. PFV에서 농도 경우 너무 희석 120 µ M에서 150 µ L 볼륨에 맞게 다음 200 µ L 최종 볼륨을 증가 하는 것이 가능 하다. 이 단계는 중요 한 요소는 vDNA (2.4:1) 하에서의 어 금 니 비율을 유지 하 고 충분 한 복잡 한 착 색 인쇄기는 동안 시각화 있습니다.
  4. 10 m m 6-8 kDa MWCO 투 석 튜브와 두 배 증류수 (ddH2O), 또는 높은 순도 물을 사용할 수 있는 클립의 ~ 10 cm 긴 조각을 청소. 튜브의 한쪽 끝을 클립.
    참고: 투 석 배관 주의 실험실 공간에서 어떤 가능한 오염 든 지 방지 하기 위해 처리 되어야 합니다.
  5. 투 석 배관 린스 버퍼 (50mm 두번째-트리 스 프로 판, pH 7.5, 500 mM NaCl)의 15 mL를 확인 합니다. 1-2 mL 린스 버퍼와 3 번 투 석 튜브의 내부를 헹 굴. 피 펫과 얇은 젤 팁 로드 가능한 린스 버퍼의 제거.
  6. 필요한 경우 사용 하 여 깨끗 한 면도날 또는 메스 얇은 젤 로드 팁 튜브의 끝에 도달할 수 있도록 투 석 튜브를 잘라.
  7. 피 펫 및 얇은 젤 팁 로드 투 석 튜브에 2.3 단계에서 intasome 어셈블리를 전송. 투 석 배관, 튜브 내에서 도입 하는 공기의 양을 최소화의 오픈 엔드 클립. 투 석 버퍼 튜브를 놓습니다.
  8. Dialyze 부드러운 교 반 튜브 회전 하지만 소용돌이와 하룻밤 (16-20 h). 투 석 배관 침수 및 모바일 인지 확인 합니다. 약 1 시간 후 튜브 안에 보이는 침전을 관찰 합니다.
    참고: Cy3와 Cy5 붙일 표시 vDNA 침전 더 분명 하다. 이것은 끝 표시와 내부적으로 레이블이 형광 vDNA 마찬가지입니다.

3. Intasome 가용 화

  1. 2 준비 넓은 깨끗 한 표면에 새로운 메스 또는 면도칼 블레이드와 2-4 m m 200 µ L 팁의 끝에서 제거 하 여 피 펫 팁을 낳았다.
    참고: 도움말 3.3-3.5 단계에서 사용 됩니다.
  2. 투 석 버퍼에서 투 석 튜브를 제거 합니다. 클립 근처 튜빙의 끝에 남아 있을 수 있습니다 투 버퍼 intasome 샘플의 희석을 방지 하기 위해 작은 피 펫 팁는 micropipette을 사용 하 여 모든 초과 투 버퍼를 제거 하. 투 석 튜브의 한쪽 끝에서 클립을 제거 합니다.
  3. 사용 넓은 얼음에 1.5 mL 튜브에 투 석 배관 내부 침전 물의 포함 하 여 샘플을 전송 하려면 3.1 단계에서 피 펫 팁을 낳았다. 참고 복구 된 자료;의 총 볼륨 총 볼륨은 일반적으로 ~ 140 µ L.
  4. 침전 된 샘플은 200 m m NaCl; 320 mM NaCl의 최종 농도에 소금 재고 5 M NaCl 솔루션의 적절 한 볼륨을 추가 하 여 증가. 예를 들어 150 µ L의 샘플을 추가 3.9 µ L 5 M NaCl과 1.1 µ L ddH2O 155 µ L. 전송 얼음 양동이와 마지막 볼륨에 대 한 샘플 4 ˚C 찬 방으로.
  5. 사용 넓은 단계 resuspend를 pipetting으로 침전을 solubilize 3.1에서에서 피 펫 팁을 낳았다. 적어도 1 h. 침전의 대부분 솔루션에가 서 관찰에 대 한 모든 20 분을 반복 합니다.
    참고: resuspend 침전에 Pipetting 수 중지 때 명백한 침전 시간 점 사이 더 이상 눈에 띄게 감소. VDNA는 레이블이 또는 내부적으로 분류 때 침전 육안 검사에 따라 ~ 90%로 감소 된다. Cy5 끝 vDNA를 표시, 경우 침전 감소만 ~ 20%; vDNA 라는 fluorophore 엔드와 침전의 대부분 solubilize 하지 것 이다. 효과적으로 solubilized 침전의 양 변수 이며, 실험적으로 결정 되어야 합니다.

4. Intasome 정화

  1. 버퍼 (20 mM 두번째-트리 스 프로 판, pH 7.5, 320 mM NaCl, 10% 글리세롤)를 실행 하는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)의 250 mL를 준비 합니다. 살 균 필터 버퍼 0.2 µ m와 단위 필터와 4 ˚C에 저장 합니다.
    참고: 모든 정화 단계 4 ˚C 차가운 방에 수행 됩니다.
  2. 복사해올된 agarose 초 열 equilibrate (직경 = 10 밀리미터; 길이 = 300 mm; 볼륨 침대 24 mL =; 샘플 량 = 25-500 µ L, 최대 압력 = 1.5 MPa; 제외 제한 = 4 x 107 다; 분자 무게 분리 5, 5000 kDa 사이의 참조 테이블 매트 erials) 0.4 mL/min의 유량에서 초 실행 버퍼.
    참고:이 정화 그들이 효과적으로 Superose 12 10/300 GL 또는 Superose 6 증가 등 44 kDa에서 300 kDa 분리 수 있다면 다른 크기 제외 열에 적응 시킬 수 있습니다. Superose 12 10/300 GL는 낮은 해상도, 봉우리의 더 많은 중복을 선도. 반대로, Superose 6 증가 높은 해상도 하 고 더 나은 분리를 제공 합니다.
  3. 펠 렛의 모든 나머지 침전을 4 ˚C에서 10 분 동안 14000 x g에서 microfuge에서 intasome 샘플 원심 조심 스럽게 제거는 상쾌한. 200 µ L 주입 루프 (~ 200 μ를 저장할 수 있는 튜브) 상쾌한을 로드 합니다. SEC 열에 샘플을 적용 됩니다.
    참고: 작은 로드 볼륨 수 초에 의해 더 큰 해상도
  4. 25 mL 초 실행 버퍼 및 수집 270 µ L. 95 분수와 함께 elute 관찰 SEC 크로마 세 A280/A260 봉우리 (그림 1)를 표시 합니다.
    참고: 첫 번째 집계 (~9.0-11.5 mL 차입), PFV tetramer intasome 피크 (~12.0-14.75 mL 차입) 및 무료 vDNA 피크 (~15.0-18.0 mL)와 모노 머 PFV에 이어야 한다.

5. 통합 가닥 전송 분석 결과, 분수 선택 및 저장

  1. 각 intasome 피크 분수 및 50의 2 µ L 결합 ng 3 kb supercoiled 플라스 미드 DNA (재고 농도 50 ng / µ L) 15 µ L의 최종 반응 볼륨에서 반응 버퍼 (10 mM tris 두번째 프로 판, pH 7.5, 110 m NaCl, 5mm MgSO4, 4 µ M ZnCl2, 10 m DTT m m)에. 5 분 동안 37 ˚C에서 품 어.
  2. 아니 추가 PFV intasome와 부정적인 컨트롤을 포함 합니다. (20 mg/mL 재고 솔루션) 0.75 µ L 성분 K와 반응 및 0.75 µ L SDS 중지 (10% 주식 솔루션). 1 헤 게 샘플 나중 분석-20 ˚C에서 필요에 따라 55 ˚C에서 품 어.
    참고:이 분석 결과 통합 활동의 질적 평가. 각 분수의 intasome 어 금 니 농도이 분석 결과 이전 결정 되지 않습니다. 분수 통합 가닥 전송 분석 결과에 포함 되어 저장 될 수 있다 통합까지 (를 포함 하 여 하룻밤 저장) 얼음에 활동은 확인 되 고 선택한 분수는 aliquoted. 여기 우리는 pMP2, pUC19 파생9를 사용합니다. 우리는 또한 성공적으로 5.4 kb 플라스 미드 pcDNA 3.1을 사용 했습니다. 으로 확인 될 수 있는 모든 플라스 미드 원형, 선형, 편안 하 고 supercoiled 형태의 통합을 위한 대상으로 사용할 수 있습니다.
  3. 1의 X 태 버퍼 (40 m m 트리 아세테이트, 1 mM EDTA) 0.1 μ g/mL ethidium 평범한 사람 (EtBr, 10 mg/mL 재고 솔루션)10에서 볼륨 (w/v) agarose 젤 당 120 mL 1% 무게를 준비 합니다. Agarose 솔루션을 용 해 하 고 15 cm x 10 cm 젤 캐스팅 쟁반에 부 어. 5 밀리미터 넓은, 0.75 m m 두께 웰 스도 15 잘 빗을 삽입 합니다.
    참고: 좁은 우물 1.5 m m 두꺼운 우물에 비해 더 나은 밴드 해상도 얻을.
  4. 허용 주위 온도에서 응고 하 젤. 0.1 μ g/mL EtBr로 1 X 태에서 젤 담가.
  5. 5.2 단계에서 각 통합 반응 3 µ L 50% 글리세롤을 추가 합니다. 전체 반응 볼륨 젤을 로드 합니다. 마커의 10 kb DNA 크기 (150 ng / µ L 재고 농도); 샘플의 양쪽에 차선 1 µ L 로드 즉, DNA 크기 마커 샘플 레인 측면 해야 합니다.
  6. 외부 레인에서 6 µ L 오렌지 G 염료 (0.25% 오렌지 G, 30% 글리세롤)을 로드 합니다. 정 전압, 1 시간, 또는 오렌지 G 염료 전면 젤의 끝에 도달할 때까지 주위 온도에 10 V/cm (100 V)에서 젤을 실행 합니다.
  7. 바로 형광 스캐너 (532 nm 여기, 610 nm 방출 필터) EtBr을 감지로 설정 agarose 젤 이미지. Fluorophore vDNAs 라는 사용 된 경우 또한 해당 fluorophore 설정으로 이미지.
    참고: 예를 들어 감지 Cy5 DNA, 633 nm 여기 및 670 nm 방출 필터를 사용 하 여 이미지 표시. 공동된 통합 제품 (CI, 선형 DNA) ~ 3 kb 크기 true로 실행 한다, unreacted supercoiled 플라스 미드 (SC) 빠른 (~ 2 kb), 실행 해야 하 고 반 사이트 통합 제품 (HSI, 편안한 원형 DNA) 느린 (~3.5 kb)를 실행 해야 합니다. Unreacted vDNA ~ 40 크기 true로 실행 해야 혈압.
  8. 이미징 소프트웨어7각 레인에서 밴드를 계량. CI, HSI, 또는 SC; 각 레인에 DNA의 분수를 계산 vDNA이이 계산에 포함 되지 않습니다.
    참고: 통합 효율성, 또는 선형 제품으로 변환 하는 SC의 분수 3 밴드 (HSI + CI + SC)의 총 픽셀 볼륨에 의해 공동된 통합 제품 (CI)의 픽셀 볼륨을 나누어 계산 했다. Intasomes 라는 fluorophore 있다면, HSI와 CI 제품 형광으로 quantitated 또한 수 있습니다.
  9. 가장 공동 통합 활동 분수를 선택 합니다.
    참고: 우리의 경험에서 공동으로 행 한 피크 통합 활동 tetrameric PFV intasomes로 식별 단백질 피크와 일치 합니다. 이 분수의 각각의 A280 을 측정 하 고 최종 intasome 농도 계산. Ε280 의 야생 PFV에 여기에 설명 된 두 개의 vDNAs tetramer에 대 한 908,339 c m-1M-1 이며 분자 무게는 225.5 kDa. 농도 SEC 크로마 피크로 가닥 전송 분석 결과에 같은 패턴을 따라야 한다.
  10. 5 µ L aliquots 각 분수를 배포 하 고 스냅 액체 질소에서 동결. Aliquots-80 ˚C에 저장 합니다. 저장을 위해 선택 하는 분수는 일반적으로 200-600 nM 사이.

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결과

PFV intasomes 재조합 및 vDNA에서 조립 된다. 조립 후 intasomes 초 (그림 1)에 의해 정화 된다. 각 분수의 통합 활동을 supercoiled DNA 대상과 agarose 젤 전기 이동 법 (그림 2)와 분석 이다. 이 젤은 감지 EtBr (fluorophore, fluorophore 표시 vDNA 사용 하는 경우)로 설정 하는 형광 스캐너와 몇 군데. 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여, 밴드 픽셀 볼륨 통합 효율성 (그림 3)를 계산 하기 위해 사용할 수 있습니다. 높은 통합 효율성과 분수는 나중에 사용에 대 한 고정 스냅. 냉동된 분수 통합 활동 (그림 4), 조립된 intasomes의 장기 저장에 대 한 수 있도록 유지 합니다...

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토론

Retroviral 기능 통합을 수행 하 고 바이러스 성 수명 주기를 계속 하는 바이러스 성 게놈 DNA와 복잡 한 multimeric를 형성 한다. Intasome 당 단위체에의 수는 tetramers, octamers, 또는 가능 하 게 더 높은 순서 multimers11,12,,1314수 있습니다. PFV intasomes는 모방 하는 바이러스 성 게놈 DNA 이중 가닥 DNA 올리고도 재조합 tetramer 종료3. 이러한 intasomes 구조와 동적 연구3,5,13

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 작품은 NIH AI099854 및 AI126742 키에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DNA 올리고머IDT N/A맞춤형 DNA 올리고
트리스 울트라 퓨어고지라 정밀 화학 UTS1003
NaClP212121RP-S23020
울트라퓨어 EDTAInvitrogen/Gibco15575
Amicon Ultra 0.5 mL 원심 필터Sigma-AldrichZ677094-24EA3 kDa MWCO
DTTP212121SV-DTT
BIS-TRIS 프로판,>=99.0% (적정)Sigma-AldrichB6755-500G
ZnCl2Sigma-Aldrich208086
MgSO4Amresco0662
GlycerolThermo Fisher ScientificG37-20
겔-로딩 팁, 1 - 200 μ LCorningCLS4853-400EA
면도날; 단일 날; 100/pk.; 100개 팩Fisher Scientific12-640
멸균 일회용 필터 유닛 PES 멤브레인 > 250mLThermo Fisher Scientific568-0020
투석 튜빙 클립Spectrum Labs132734
6-8 kDa 10 mm 투석 튜빙Spectrum Medical132645
Superose 6 10/300 GLGE Healthcare Life Sciences17517201
고음질 표준 아가로스AGTC BioproductsAG500D1
에티듐 브로마이드Thermo Fisher ScientificBP1302
오렌지 GFisher Scientific0-267
Hyladder 10kb, 500Denville ScientificCB4225-4
레인

참고문헌

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