여기, 선물이 원유 마우스 조직에서 효소 특이성을 결정 하는 프로토콜 MALDI TOF 분석을 사용 하 여 추출.
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방법 논문
마우스 조직에서 효소 특이성 결정 TOF MALDI 질량 분석에 의해 추출: PH 특이성 변경를 조작
이 논문에서
요약
초록
프로 테아 제 단백질 활성화/비활성화 및 음식 소화를 포함 하 여 여러 생물 학적 기능을가지고. 효소 특이성을 식별 하는 것이 효소 기능을 공개에 대 한 중요 합니다. 이 연구에서 제안 된 메서드는 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화를 사용 하 여 독특한 기판의 분자량을 측정 하 여 효소 특이성을 결정 합니다 시간의 비행 (TOF MALDI) 질량 분석. 기판 포함 iminobiotin, 쪼개진된 사이트 구성 아미노산, 그리고는 스페이서 이루어져 있다 폴 리 에틸렌 글리콜. 쪼개진된 기판 독특한 분자량 쪼개진된 아미노산을 사용 하 여 생성 됩니다. 이 방법의 장점 중 하나입니다 그것은 원유 샘플을 사용 하 여 한 냄비에 실행 될 수 있습니다 그리고 그것은 또한 여러 샘플을 평가 적합. 이 문서에서는, 우리는 마우스 폐 조직, 조직 추출, 소화 기판의에 배치 샘플, 다른 pH 조건 하에서 소화 기판의 정화 등에서 추출 하는 샘플으로 최적화 하는 간단한 실험 방법 설명 및 TOF MALDI 질량 분석을 사용 하 여 기판의 분자량의 측정. 요약 하자면,이 기술은 여러 샘플 처리에 대 한 쉽게 확장 될 수 있습니다 하는 TOF MALDI 질량 분석을 사용 하 여 조직 추출에서 파생 하는 원유 샘플에서 효소 특이성의 식별에 대 한 수 있습니다.
서론
프로 테아 제, 단백질 절단형에 의해 생리 적 프로세스 조절 그리고 특정 시간과 장소에서 효소 활동의 개시는 규제1. 그러므로 식 및 로컬 규제, 조직의 활동을 식별 하 고 프로 테아 제를 감지 하는 새로운 방법을 개발 하는 것이 중요 하다. 에 제안 된 방법은이 연구 프로 테아 제를 감지 하는 동시에 효소 특이성을 식별 하는 것을 목표로.
효소 특이성을 탐지 하기 위한 몇 가지 방법이 있습니다. Azocasein 메서드는 프로 테아 제2 의 검출에 사용을 위해 유명 하다 그러나 추가 정보를 얻을 하는 능력에 제한 된다. Zymography 프로 테아 제3의 분자량을 결정 하는 데 사용할 수 있는 또 다른 종합 효소 검출 방식 이지만 기질 특이성을 검사 하는 데 사용할 수 없습니다. 효소 특이성 spectrometric 분석, 기판 p-nitroanilide4, 등을 사용 하 여 및 fluorometric 분석 실험, coumarin 기판5 또는 형광 공명 에너지 전송 (무서 워) 분석 실험6
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프로토콜
동물 실험 프로토콜 일본 제약 대학 윤리 위원회에 의해 승인 되었고 관심과 일본 제약 대학의 실험 동물의 사용에 대 한 지침에 따라 수행. 프로토콜 조직 추출 물의 ICR 생쥐에서 파생 된에 대 한 조정 되었습니다. ICR 생쥐 일본 SLC 회사 (일본 시즈오카)에서 구입 했다
1. Iminobiotin 표시 된 기판의 준비
기판 겪 습 9-fluorenylmethyloxycarbonyl 그룹 (Fmoc)를 사용 하 여 고체 상 합성-11아래 설명 된 대로 아미노산을 보호. 표 2 를 사용 하 여 원하는 아미노산 및 합성의 단계에 따라 사용 Fmoc 화합물 결정.
- N, N-dimethylformamide (DMF) 합성 열에서의 10 mL와 Fmoc-NH-샐 수 지의 0.2 g 맛있게
- DMF에 30 %piperidine 5 mL를 추가 합니다. Fmoc 그룹을 쪼개 10 분 솔루션 바위.
- 체크 trinitrobenzenesulfonic 산 (TNBS) Fmoc 분열 테스트12: 1%의 추가 10 µ L DMF에....
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결과
모델 프로 테아 제에 의해 효소 특이성의 식별에 대 한 방법의 평가
이 시스템의 효율성은 TPCK-트립 신 및 V8 효소의 기질 특이성 가져온 사용 하 여 평가 되었습니다. TPCK-트립 신 및 V8 효소 아미노산 시퀀스 리 신과 아르기닌 잔류물의 C-터미널 및 aspartic 산 및 글루탐산 잔류물의 카 쪽에서 각각 쪼개 위하여 견적 되었다. 표 1 및 특정 프로 테아 제에 의해 죽 습 조각 소화 기판의 이론적 분자 무게를 보여 줍니다. TPCK-트립 신을 사용 하 여 기판 소화 쪼개진된 조각, 두 번째는 839.81 다 796.76 다 (그림 2A)에서 검출 될 수 생산. 이 파편의 분자 무게는 리 신과 아르기닌의 C-터미널에서 각각 죽 습 파편의 이론적 분자 무게에 맞춰 밀접 하 .......
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토론
이 프로토콜 TOF MALDI 질량 분석을 사용 하 여 조직 추출에서 파생 하는 원유 샘플에서 효소 특이성을 식별 하 고 쉽게 여러 샘플 처리에 대 한 조정 될 수 있습니다. 특히, 우리는 기질 특이성에 변화를 일으킬 pH를 조작.
avidin 비타민 b 복합체 복잡 한 (ABC) 메서드, 생화학의 바인딩 특이성 때문에 널리 이용 되는, 우리의 프로토콜에 이용 되었다. ABC의 강한 선호도, 인해 avidin 비타민 b 복합체에의 바인딩 거의 되돌릴 수 하지 않습니다. ABCs에 대 한 친 화력 정화 따라서 매우 효율적입니다. 이러한 이유로, 우리 보고 biotin 표시 된 기판에 대 한 회복 율 낮을 것으로 예상 된다. 이 연구에서 우리만 사용 낮은 pH 수준 차입; 그러나, deglycosylated avidin-수 지13 또는 단위체 avidin-수 지14 도 사용할 수 있습니다 bioti.......
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공개 사항
저자는 충돌의 관심을 선언합니다.
감사의 글
이 작품은 일본 제약 대학 (2016)과 문 부 과학성 KAKENHI 보조금 번호 JP17854179에서 일본 제약 대학 연구 보조금에 의해 부분에서 지원 되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Fmoc-NH-SAL 수지(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl) aminomethyl]phenoxy resin) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00102 | |
| N,N-디메틸포름아미드(DMF) | 와타나베 화학(주) | A00185 | |
| 피페리딘 | 와타나베 화학 주식회사 | A00176 | |
| 트리니트로벤젠술폰산(TNBS) | WAKO Chemical | 209-1483 | |
| O-(6-클로로-1H-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HCTU) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00067 | |
| 1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt)Watanabe Chemical Co., Ltd. (1-하이드록시-1H-벤조트리아졸,일수화물) | 와타나베 케미컬 | A00014 | |
| 디이소프로필에틸아민(DIPEA) | 와타나베 화학(주) | A00030 | |
| 트리이소프로필실란(TIS) | 와타나베 화학(주) | A00170 | |
| 에탄디티올(EDT) | 와타나베 화학(주) | A00057 | |
| 트리 플루오로 아세트산 (TFA) | 밀리 포어 | S6612278 403 | |
| 아세토 니트릴 | Kokusan 화학 | 2153025 | |
| C18 카트리지 칼럼 | Waters | WAT051910 | |
| 폴리 (옥시 에틸렌) 옥틸 페닐 에테르 | WAKO 화학 | 168-11805 | 트리톤 X-100 |
| 혼합 균질화 기 | Kinematica | PT3100 | Polytron 균질화기 |
| Coomassie 브릴리언트 블루(CBB)-G250 | 나카라이 케미컬 | 094-09 | |
| 글리세롤 | 나카라이 케미컬 | 170-18 | |
| N-토실-L-페닐알라닌 클로로메틸케톤(TPCK)-트립신 | 시그마-알드리치 | T1426 | |
| 디메틸설폭사이드(DMSO) | 와코케미컬 | 043-07216 | |
| 스트렙타비딘 세파로스 | GE 헬스케어 | 17-511-01 | |
| ZipTipC18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | C2020 | |
| MALDI-TOF 질량 분석기 | Bruker Daltonics, 독일 | autoflex | |
| 2-iminobiotin | Sigma-Aldrich | I4632 | |
| Fmoc-아미노산 | Watanabe Chemical Co., Ltd. |
참고문헌
- Neurath, H., Walsh, K. A. Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review). Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).
- Surinov, B. P., Manoilov, S. E. Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein. Vop....
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