간단 하 고 효과적인 관리 및 신장 주입을 사용 하 여 작은 물고기의 순환 시스템에 미의 시각화

요약

이 문서에서는 빠르고, 최소 침 습으로 주사를 형광 미의 작은 물고기의 circulatory system 및 물고기의 혈액에 미의 비보에 시각화의 원칙을 보여 줍니다.

초록

맥 관 구조 시각화, 약물 및 백신 납품, 작은 광학 센서 및 유전자 변형 세포의 이식에 대 한 살아있는 유기 체에 마이크로 크기 입자의 체계적 관리를 적용할 수 있습니다. 그러나, 생물 및 동물 실험실에서 주로 사용 되는 작은 동물에 정 맥 microinjections 매우 어려운 고 숙련 된 직원을 필요. 여기, 물고기 신장에 주입 하 여 성인 zebrafish (Danio rerio)의 순환 시스템에 미의 도입에 대 한 강력 하 고 효율적인 방법을 설명합니다. 시각화는 맥 관 구조에 소개 된 미, 하 우리는 물고기 아가미에 간단한 intravital 이미징 기술을 제안 합니다. 주입 된 microencapsulated 형광을 사용 하 여 달성 되었다 vivo에서 zebrafish 혈액 pH의 모니터링 조사, SNARF-1, 설명 기술의 가능한 응용 프로그램 중 하나를 보여 줍니다. 이 문서는 pH에 민감한 염료의 캡슐화에 대 한 자세한 설명을 제공 하 고 빠른 주사의 원리와 형광 신호의 비보에 기록에 대 한 취득된 microcapsules의 시각화를 보여 줍니다. 주입의 제안된 방법 낮은 사망률에 의해 특징입니다 (0-20%)와 높은 효율 (70-90% 성공), 그리고 그것을 일반적으로 사용 가능한 장비를 사용 하 여 쉽습니다. 관 상용 열대어와 메 다카 같은 다른 작은 물고기 종에 모든 설명 된 절차를 수행할 수 있습니다.

서론

동물 유기 체에 마이크로 크기 입자의 관리 약물 및 백신 납품¹, 맥 관 구조 시각화², 유전자 변형 세포 이식³및 작은 광학 센서 이식 등의 분야에서 중요 한 작업입니다. ^{4 , 그러나 5}., 작은 실험실 동물의 혈관 시스템으로 미 입자에 대 한 주입 절차는 어려운, 특히 섬세 한 수생 생물에 대 한. Zebrafish 같은 인기 있는 연구 표본에 대 한 조언 비디오 프로토콜을 사용 하 여 명백 하 게이 프로시저를.

Intracardiac 및 모 세관 microinjections zebrafish 혈액으로 microobjects의 납품을 위한 훈련 된 인력과 독특한 미세 시설 필요. 이전, 역 궤도 수동 주입³ 전체 셀의 관리에 대 한 간단 하 고 효과적인 방법으로 제안 했다. 그러나, 우리의 경험에 눈 모 세관 네트워크의 작은 지역 때문에 걸리는이 기술에서 원하는 결과 달성 하기 위해 많은 연습.

여기, 우리 기술 순환 시스템으로 강력 하 고 효율적인 microparticle 이식 하는 방법 성인 zebrafish의 신장 조직에 직접 수동 주입는 모세 혈관과 신장 혈관이 풍부 하다. 이 기술은 세포 이식 zebrafish 신장⁶에 대 한 비디오 프로토콜에 기반 하지만 외상 및 시간이 걸리는 microsurgical 단계 탈락 했다. 제안된 된 방법 낮은 사망률에 의해 특징입니다 (0-20%)와 높은 효율 (70-90% 성공), 그리고 그것을 일반적으로 사용 가능한 장비를 사용 하 여 쉽습니다.

제안 된 프로토콜의 중요 한 부분이 이다는 이식된 미 (해당 되는 경우에 그들은 형광 또는 colorized) 아가미 모세 혈관에 주입 품질, 수의 거친 상대 평가의 확인에 대 한 수의 시각화 주입 된 입자, 그리고 순환 혈액에서 직접 생리 측정 스펙트럼 신호 감지. Vivo에서 zebrafish 혈액 pH microencapsulated 형광 프로브, SNARF-1, 원래에 제안 된 Borvinskaya를 사용 하 여의 측정을 위한 프로토콜 설명 설명된 기술의 가능한 응용 프로그램의 예를 들어, 외. 2017⁵.

프로토콜

모든 실험 절차는 동물 실험에 대 한 EU 지침 2010/63/EU에 따라 실시 했다 하 고는 동물 주제 연구 위원회 연구소의 생물학의 이르쿠츠크 주립 대학에 의해 승인 되었습니다.

1입니다. Microcapsules의 제조

참고: Microcapsules 형광 염료를 들고 반대로 충전된 polyelectrolytes^7,8의 레이어, 레이어 어셈블리를 사용 하 여 준비가 되어 있습니다. 모든 절차는 실 온에서 수행 했다.

1. 형광 염료를 포함 하는 다공성 CaCO₃ microcores 합성, 혼합 SNARF-1-dextran 솔루션 (FITC BSA 등 대부분 폴리머 바인딩된 형광 염료를 사용할 수 있습니다.)의 2 개 mL ~ 2 mg/mL의 농도에서 0.6 mL CaCl_{2의 1 mol/L 솔루션} 와 나₂CO₃ 빠른 교 아래.
   참고: photobleaching;에 형광 염료의 다른 감도에 관심을 지불 (SNARF-1) 같은 빛에 민감한 형광 프로브를 사용 하는 경우는 미의 저장 하 고 조작 해야 합니다 수행할 수 가능한 작은 빛으로.
2. 동요의 5-10 s, 후 전송 현 탁 액 2 mL microcentrifuge 튜브와 15에 대 한 원심 분리기 CaCO₃ microcores 펠 렛에 10000-12000 g에서 s.
3. 삭제는 상쾌한, 이온된 수, ~ 2 mL와 코어를 세척 하 고 떨고 하 여 펠 릿을 resuspend.
4. 세 번 총에에서 원심 분리 세척 절차를 반복 합니다. 마지막 원심 분리 후에 상쾌한을 삭제 합니다.
5. 그들의 집계를 줄이기 위해 초음파 목욕에서 1 분 microcores를 품 어.
   주의: 헤드폰으로 귀를 보호 하기 위해 잊지 마세요.
6. 서식 파일에서 첫 번째 폴리머 레이어를 입금, 1 mol/L NaCl에에서 poly(allylamine hydrochloride) (PAH)의 4 mg/mL 해결책의 ~ 2 mL에 코어를 resuspend.
   1. 일정 한 동요와 ~ 5 분에 대 한 솔루션에는 microcores를 유지.
   2. 15 후 원심 분리의 s 삭제 언바운드 PAH와 상쾌한. 3 번 이상 여러 원심 분리 및 세척 단계를 통해 이온을 제거 된 물으로 덮여 microcores 세척. 마지막 원심 분리 후에 상쾌한을 삭제 합니다.
   3. 그들의 집계를 줄이기 위해 초음파 목욕에서 1 분 microcores를 품 어.
      참고: 폴 리 (나트륨 4-styrenesulfonate)에서 시작 하는 경우 적용 된 형광 성 염료는 양이온, (PSS) 1 mol/L NaCl에에서 (단계 1.7 참조).
7. 서식 파일에 두 번째 폴리머 레이어를 입금 PSS (또한 1 mol/L NaCl을 포함 하는)의 4 mg/mL 해결책의 ~ 2 mL와 1.6 단계를 반복 합니다.
8. 1.6 및 1.7 6 번 입금 12 폴리머 레이어를 단계를 반복 합니다.
   참고: 권장 되지 않습니다 (~ 12 h 이상) 긴 휴식 ~ 3-5까지 절차에 레이어 입금 되었습니다 때문에 보험 없이 CaCO₃ microcores recrystallize 하는 경향이 있습니다. Note PSS 범위는 microcores의 더 높은 집계 원인과 긴 일시 중지는 (PLL-g-PEG) outmost 레이어는 PAH 또는 폴 리-L-리 신 폴 리 에틸렌 글리콜으로 투입 하는 경우에 좋습니다.
9. 2 mg/ml PLL-g-말뚝 (microtube 당 ~ 1 mL) 적어도 2 시간에 대 한 커버 microcores를 품 어.
   1. Microcores 연속 원심 분리 및 물의 resuspension 단계를 통해 물으로 씻는 다. 마지막 원심 분리 후에 상쾌한을 삭제 합니다.
10. 빈 microcapsules를 하려면 대상된 microcores를 사용 0.1 mol/L ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 솔루션 (NaOH로 pH 7.1 조정)의 2 개 mL를 추가 하 여 CaCO₃ 서식 파일을 분해.
    1. 외피의 ~ 5 분, 후 원심 45 s 및 삭제에 대 한 microcapsules EDTA와 상쾌한.
    2. 1.10 1.10.1 단계를 두 번 반복 합니다.
11. 0.9 %NaCl 여러 원심 분리를 통해 세 번 45 내 단계 microcapsules 세척 세척 단계 뒤에 s. 원심 분리의 마지막 단계, 후에 상쾌한을 삭제 합니다.
    참고: 주입에 대 한 최종 microcapsule 솔루션 유지 되어야 한다 살 균 (예를 들어 추가 하 여 암 피 실린, 0.1 mg/mL), 그리고 미디어 생체 조사 (isotonic 미디어 중립 ph) 대상이 되어야 합니다.
12. 형광 현미경 hemocytometer에 준비 된 microcapsules의 농도 견적 한다. microcapsules의 그림의 일련, 한 백 microcapsules ImageJ⁹ 또는 해당 소프트웨어를 사용 하 여에 대 한의 직경을 측정 하 고 히스토그램을 사용 하 여 크기 분포를 조사.
13. 저장소는 획득된 캡슐화 프로브 어둠 속에서.
    참고: 살 균 0.9%에서 여러 빨 래 후 NaCl, microcapsules는 4 ° c.에 몇 달 동안 저장 될 수 있다 저장 동안에 microcapsules의 완전 한 건조 하는 것은 권장 하지 않습니다.

2. 준비의 광학 설치 및 Microencapsulated SNARF-1의 교정

참고: microencapsulated SNARF-1 거친 pH 측정 형광 현미경⁷의 두 채널의 이미지를 사용 하 여 만들 수 있습니다 하지만 섬유 분석기에 연결 된 한 개 채널 형광 현미경이이 프로토콜에 적용 했다.

1. 필요한 일련의 형광 필터 적용 된 형광 염료의 특성에 따라 형광 현미경에 놓고 형광 램프를 켭니다.
   1. 접 안경에 레버를 당겨.
      주의: 초과 빛 분석기 매트릭스를 손상 수 있습니다. 따라서, 레버는 "아이피" 모드는 분석기를 사용 하지 않을 있는지 확인 합니다.
   2. 분석기와는 다른 쪽 끝을는 겨냥 틀을 광섬유의 한쪽 끝을 연결 합니다. 어댑터를 사용 하 여 카메라 튜브의 초점 또는 형광 현미경의 다른 사용 가능한 포트에는 겨냥 틀을 배치 합니다.
   3. 분석기를 켭니다. 분 광 계 제어 프로그램을 실행 하 고는 분석기 측정을 위한 준비.
2. Microcapsule 배치의 교정에 대 한 microcapsule 정지 (이온된 수 µ L 당 10 ~ 000 microcapsules)의 ~ 5 µ L 현미경 슬라이드에 놓고 건조 (35 ° C에서 온도)에서 예를 들어 어두운 장소에 드롭.
   1. Microencapsulated SNARF-1의 스펙트럼 특성을 보정 하려면 다른 pH 값 범위 ~ 6-9에에서 버퍼의 시리즈를 사용 합니다. ~ 10 µ L SNARF-1-dextran와 말린된 microcapsules에 버퍼를 삭제 하 고는 coverslip로 그것을 커버.
   2. 현미경 단계에 유리 슬라이드를 놓습니다. Microcapsules를 × 40 목표를 사용 하 여 찾습니다.
   3. 카메라 포트를 현미경 레버를 설정. 그들의 형광 분석기를 등록 합니다. 레버는 접 안 렌즈를 다시 설정 합니다.
      참고: 배경 수준 보다 훨씬 스펙트럼 신호는 다는 것을 확인 하 고 보기의 필드에 microcapsules는 거품에서 (로 전환 하 여 낮은 확대 필요한 경우) 확인 합니다. 동일한 microcapsules의 장시간된 조명을 하지 마십시오. SNARF-1은 photobleaching에 민감합니다.
   4. 10-15 회 다른 microcapsules에 대 한 단계 2.2.3을 반복 합니다.
3. 모든 등록 된 스펙트럼에 대 한 형광 피크 비율 (예: R 또는 Scilab 사용)을 계산 하 고 회귀선 (각 버퍼)에 대 한 평균 비율 및 다음 수식을 사용 하 여 중간 pH 사이 결정:
   
   참고: SNARF-1 스펙트럼 protonated 및 deprotonated 염료의 방출에 해당 하는 두 개의 봉우리 있으며 봉우리 사이의 비율 매체의 pH에 반응입니다. 이 연구에서 605, 660 nm의 형광 강도 사이 비율 사용 됩니다. 이 파장은 사용 하는 필터 설정에 따라 선택 됩니다. a 와 b 는 계수 비 선형 회귀 (예: R를 사용 하 여)에 의해 결정 됩니다. 0.15 및 1.1 값은, 각각,의 최소 및 최대 값 나₆₀₅/I₆₆₀ 는 교정 중 관찰.
4. 약 5 성인 동물에서 물고기 혈액의 약 10 µ L를 수집 합니다. 장소 1 µ L/mL와 페 트리 접시에 마 취에 대 한 정 향 오일의 서 스 펜 션 물 생선과 동물의 측면에는 지 느 러 미의 pinches을 응답 하지 않습니다 때까지 기다렸다가 (보통 2 ~ 3 분). 유리 슬라이드에 물고기를 전송 합니다. 물고기 꼬리는 바소와에서 잘라내어 꼬리 정 맥에서 물고기 혈액의 약 2 µ L를 수집.
   참고: 혈액 응고 방지 하기 위해, 헤 파 린 (5000 U/mL)와 절 개를 치료 하 고 heparinized 유리 모 세관 및 microcentrifuge 튜브를 사용 하 여 혈액을 수집.
   1. microelectrode의 끝에 피 펫과 혈액의 약 10 µ L 똑 하 고 pH 미터를 사용 하 여 pH를 결정 합니다.
   2. 말린된 microcapsules와 함께 슬라이드에 혈액을 삭제 하 고 등록 교정 버퍼 (2.2-2.3 단계)에 대 한 설명으로 형광 강도의 비율.
5. 곡선 (대 한 자세한 내용은 참조 Borvinskaya 외. 2017⁵) 물고기 혈액 측정 일치 하도록 교정 곡선의 선형 계수를 조정 합니다.

3입니다. 주입에 대 한 준비

1. 날카로운 바소와 플라스틱을 제거 하 여 인슐린 펜 (또는 주사기)의 끝에서 강철 바늘을 놓습니다.
   참고: 모든 얇은 바늘 (Ø0.33 m m 또는 더 적은) 또는 유리 모 세관 (일반적으로 Ø1 m m) microinjection^10,11준비 될 수 있다.
2. 유리 microcapillary; 중간 바늘 삽입 신속 하 고 부드럽게 솔더 가스 토치를 사용 하 여.
3. 유리 microcapillary는 microinjector에 연결 하 고 세 번 살 균 물으로 플러시. 액체는 바늘에 흐르는 확인 하십시오.
4. 증류수로 시스템을 채우십시오.
   참고: 시스템에 있는 아무 거품 다는 것을 확인 하십시오.

4입니다. 주입

1. Microcapsules의 준비 된 현 탁 액 resuspend (살 균 0.9 %NaCl에서, 또는 어떤 다른 매체 든 지에 사용 microliter 당 0.5 6 백만 microcapsules의 농도 주사) 1 분 동안 초음파 목욕을 사용 하 여.
   참고: 다음 주입 동안 침전 하는 microcapsules 경향이 있기 때문에 동요는 microcapsules와 유리병 기계적으로 (로 터를 사용 하 여) 또는 수동으로 수 분 마다 그들을 resuspend 하 고 그들의 집계를 방지.
2. 장소 마 (정 향 오일 물에 0.1 mL/L)와 페 트리 접시에 물고기 2 ~ 3 분 대기 물고기의 측면에는 지 느 러 미의 빛 핀치에 응답 하지 않습니다 때까지.
3. 숟가락을 사용 하 여, 마 취에서 생선을 전송 하 고 부드럽게 머리 (사람을 위해 오른 손잡이) 왼쪽으로 또는 오른쪽 (왼손잡이 사람)에 대 한 가로 위치에 젖은 스폰지에 두십시오.
4. 주사의 바로 전에 1-2 m m 유리 모 세관으로 공기의 microinjector와 연결 된 빨 아. 그런 다음, 분산 된 microcapsules의 약 2 µ L와 함께 로드 됩니다.
   참고: 주입, 전에 microcapsule 솔루션 물고기 지켜진다 온도를 조정할 수 합니다.
5. 부드럽게 비 지배적인 손 가진 스폰지에 물고기의 시체를 안정화 합니다.
   1. 물고기의 측면 라인을 찾아. 정신적으로 복 부 구멍의 끝에는 operculum에서 확장 하는 세그먼트를 선택 합니다. 이 세그먼트의 중간을 찾아. 더 낮은 복 부 방향으로 1 m m 바늘을 넣어.
   2. 된다고 운동, 생선 비늘, 고 펑크 부드럽게 이동 합니다. 테이블 표면에 45 °의 각도에서 본문에 바늘을 삽입 합니다.
   3. 그것은 신중 하 게 그것에 대하여 휴식 때까지 척추 쪽으로 바늘을 밀어.
   4. 신장에 microcapsules의 현 탁 액의 약 1 µ L를 놓고 천천히 바늘을 철회.
      참고: 적절 한 바늘 사이트를 찾을 수 쉽게, 유용 그림 2A 와 2B와같이 아래 빛을 사용 하 여 물고기를 transilluminating 하 여 트렁크 신장을 찾는 연습을 합니다.
6. 씻어 주사 사이트에서 유출된 된 microcapsules를 제거 하는 물 스트림 꼬리에 머리에서 물고기.

5. Vivo에서 시각화

1. 해 부가 위를 사용 하 여 물고기 머리에서 아가미 덮개를 제거 하 고 물고기 아가미를 발가 벗기다. 린스 물으로 아가미.
2. 숟가락을 사용 하 여, 현미경 슬라이드에 물고기를 전송 하 고 형광 현미경의 스테이지에 배치.
   참고: 연속 절차 동안 물고기의 아가미를 건조 하지 않는 다는 것을 확인 하십시오. 이 방지 하려면 정기적으로 축 축 하 게 그들 파스퇴르 피 펫 (1-2 분 마다 약)를 사용 하 여 물으로.
3. 방을 어둡게 하 고 형광 microcapsules 데 아가미 검사 낮은 배율 (x 10의 목표)를 사용 하 여.
   참고: 물고기 순환 시스템에 몇 가지 형광 입자의 도입에 대 한 절차를 사용 하는 경우이 좋습니다 주사 하기 전에 예기치 않은 형광 입자에 대 한 몇 가지 개인의 아가미를 검사. 야생-타입 zebrafish의 아가미 autofluorescence, 필요가 없습니다 하지만 경우에 따라 (같은 음식 조각 또는 단 세포 symbionts) 산발적 형광 입자 아가미에 수 있습니다. 경우 필요한, 이러한 입자 인식 될 수 있다 그들의 특정 모양에 따라 (예를 들어 음식 조각을 구형 microcapsules 달리 불규칙 한 모양) 또는 형광 스펙트럼 (즉, 색상).
   1. 더 높은 크기 (× 40 목표), 렌즈를 전환 하 고 한 microcapsule 또는 microcapsules의 그룹 보기의 필드의 중앙에 위치 합니다.
   2. 연결된 분석기와 포트에 레버를 설정. 스펙트럼 신호를 기록 합니다.
   3. 레버는 접 안 렌즈를 다시 설정 합니다.
   4. 여러 번 다른 microcapsules에 대 한 측정을 반복 합니다.
4. 복구에 대 한 적절 한 환기와 수족관에 물고기를 전송 합니다.
   참고: 최소의 연습으로, 그것은 주입 및 물고기 마다 2-3 분의 대략적인 속도로 기록 하는 신호를 수행할 수 있습니다. 측정 반복된 낮은, 무해 한 복용량 마 취의 또는 고정의 또 다른 방법은 사용 하 여 하나의 개별 여러 번 반복할 수 있습니다. 장기 관찰에 대 한 지속적인 마 취¹²시스템을 사용 합니다.

결과

얻은 결과 제시 프로토콜의 세 가지 주요 범주 중 하나에서 온: 형광 염료 (그림 1)에 추가 시각화와 microcapsules의 신장 주입의 캡슐화에 의해 형광 미의 형성 모세 혈관 (그림 2 및 3) 아가미와, 마지막으로, vivo에서 스펙트럼의 녹음 SNARF 1 형광 모니터링 하 혈액 pH 수준 (그림 4).

반대로의 계층으로 염료를 포함 하는 템플릿 CaCO₃ 코어의 코팅을 사용 하 여 레이어, 레이어 접근 청구 (PAH와 PSS) 고분자 및 생체 고분자 (PLL-g-PEG)의 가장 바깥쪽 레이어는 간...

토론

Zebrafish 신장으로 미의 주입을 보여 우리 반 투과성 microcapsules 지시자 염료와 로드를 사용 합니다. 따라서, 프로토콜 반대로 충전된 polyelectrolytes^{7,8,,1516,17의 레이어, 레이어 어셈블리를 사용 하 여 microcapsules의 제조에 대 한 지침을 포함 ,18} (그림 1A). 이 기술의 장점은 사용 가능한 실험실 장비로 수행 하기 쉽습니다. 조건 및 화합물 사용에 따라 조작된 microcapsules 0.5에서 나노미터 두께 전해질 셸¹⁵

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
SNARF-1-dextran, 70000MW	Thermo Fisher Scientific	D3304	형광 프로브. 다른 적절한 폴리머 결합 형광 염료를 마이크로캡슐 필러로 사용할 수 있습니다:
알부민-플루오레세인 이소티오시아네이트 접합체(FITC-BSA)SIGMA		A9771	형광 프로브
, 로다민 B 이소티오시아네이트-덱스트란(RITC-덱스트란)	SIGMA	R9379	형광 프로브
염화칼슘	SIGMA	C1016	CaCO3 템플릿 형성
탄산나트륨	SIGMA	S7795	CaCO3 템플릿 형성
폴리(알릴아민 염산염), MW 50000 (PAH)	SIGMA	283215	양이온 고분자
폴리(4-스티렌설포네이트나트륨), MW 70000 (PSS)	SIGMA	243051	음이온 고분자
폴리-L-라이신[20 kDa], 폴리에틸렌 글리콜[5 kDa]과 접목, g = 3.0 - 4.5 (PLL-g-PEG)	SuSoS	PLL(20)- g[3.5]-PEG(5)	마이크로캡슐의 생체 적합성을 높이기 위한 최종 폴리머
염화나트륨	SIGMA	S8776	적용된 폴리머를 용해시키기 위해
정수 시스템	Millipore	SIMSV0000	탈이온수 제조
CaCO3 템플릿 형성
에펜도르프  연구  플러스 피펫, 1000 µ L	Eppendorf		투여 솔루션
Eppendorf  연구  플러스 피펫, 10 µ L	Eppendorf		분주 솔루션
피펫 팁, 부피 범위 200 - 1000 &마이크로; L	F.L. Medical	28093	투여 솔루션
피펫 팁, 부피 범위 0.1-10  &뮤; L	Eppendorf	Z640069	분주 솔루션
Mini-centrifuge Microspin 12, High-speed	BioSan		마이크로캡슐 원심분리 세척 절차용
Microcentrifuge tube, 2 mL	Eppendorf	Z666513	Microcapsule synthesis and storage
Shaker Intelli-mixer RM-1L	ELMY Ltd.		마이크로캡슐 응집을 줄이기 위해
초음파 세척기			마이크로캡슐 응집을 줄이기 위해
헤드폰			초음파로부터 귀를 보호하기 위해
에틸렌디아민테트라아세트산	SIGMA	EDS	CaCO3 템플릿을 용해하려면
인산나트륨	SIGMA	S9638	pH 완충액의 제조
인산이나트륨	SIGMA	S9390	pH 완충액의 제조
산화나트륨	SIGMA	S8045	EDTA 용액 및 완충액의 pH를 조정하기 위해
온도 조절기 챔버			유리 슬라이드에서 마이크로캡슐을 건조시키기 위해
적혈구 분석기 혈구 계수 챔버			준비된 마이크로캡슐의 크기 분포 및 농도를 조사하기 위해
형광 현미경 Mikmed 2	LOMO		물고기 혈액
내 마이크로캡슐의 생체 내 시각화SNARF-1용 형광 필터 세트(현미경 모델에 따라 선택해야 함, 예시 제공)Chroma		79010	형광 프로브를 사용한 마이크로캡슐 시각화
Fiber spectrometer QE Pro	Ocean Optics		현미경 하에서 마이크로캡슐 보정
광섬유 QP400-2-VIS NIR, 400 μ m, 2m	Ocean Optics		분광계를 현미경 포트와 연결하기 위해
콜리메이터 F280SMA-A	Thorlabs		분광계를 현미경 포트와 연결하기 위해
유리 현미경 슬라이드	Fisherbrand	12-550-A3	현미경 하에서 마이크로캡슐 보정
Coverslips, 22 x 22 mm	Pearl	MS-SLIDCV	하에서
마이크로캡슐 보정유리 미세 모세관 Intra MARK, 10 µ L	Blaubrand	BR708709	물고기 혈액
정향 오일	SIGMA	C8392	물고기 마
란셋 No 11	Apexmed international BV	P00588	물고기 꼬리를 자르고 인슐린 자기주사기의 끝에서 강철 바늘을 풀기 위해
헤파린, 5000 U/mL	Calbiochem	L6510-BC	물고기 혈액 채취 중 물고기 혈액과 접촉하는 모든 표면 처리용
미세 전극이 있는 Seven 2 Go Pro pH	Mettler Toledo		물고기 혈액 pH
인슐린 펜 바늘 Micro-Fine Plus를 측정하려면 0.25 x 5 mm	Becton, Dickinson and Company		주입 절차용. 모든 얇은 바늘 (Ø 0.33mm 이하)이 적합합니다
유리 모세혈관, 1 x 75mm	Hirschmann Laborgerä te GmbH & Co	9201075	주입 절차용
가스 토치			강철 바늘을 유리 모세관에 납땜하기 위해
마이크로인젝터 IM-9B	NARISHIGE		마이크로캡슐 현탁액
페트리 접시, 60mm x 15mm, 폴리스티렌	SIGMA	P5481	마취 하에 물고기를 이용한 조작용
플라스틱 숟가락			마취 중인 물고기를 이용한 조작용
축축한 스폰지			마취 중인 물고기를 이용한 조작용
해부 가위	Thermo Scientific	31212	물고기 머리에서 아가미 덮개를 제거하기 위해
파스퇴르 피펫, 3.5 mL	BRAND	Z331767	물고기 아가미를 적시려면