여기 우리 인간의 비 강 상피 세포의 3 차원 회전 타원 체 문화를 생성 하는 방법을 설명 합니다. Spheroids는 다음 드라이브 낭 성 섬유 증 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 (CFTR) 자극-종속 이온 및 액체 분 비, CFTR 함수에 대 한 프록시로 회전 타원 체 luminal 크기의 변화를 측정.
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방법 논문
개별된 낭 성 섬유 증 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 연구에 대 한 인간의 비 강 상피 세포 Spheroids의 생성
이 논문에서
요약
초록
낭 성 섬유 증 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 (CFTR) 변조기 약물의 도입 치료 낭 성 섬유 증 (CF)에 혁명 하고있다, 그러나 현재 사용 되 고 있는 유전자 이동 치료 모델은 몇 가지 제한이 있습니다. 첫 번째, 희귀 또는 understudied 돌연변이 그룹 확실 한 임상 시험에서 제외 됩니다. 또한, 추가 변조기 마약 시장에 진입, 그것은 변조기 선택 개별 주제에 대 한 최적화 하기가 될 것입니다. CFTR 기능 및 변조, 개별 환자 파생 전 임상 모델 시스템의 사용으로 이러한 문제를 모두 해결 합니다. 인간의 비 강 상피 세포 (HNEs)는 이러한 모델에 대 한 호흡기 조직의 쉽게 접근할 수 있는 소스입니다. 여기는 CFTR 기능과 기본 HNEs를 사용 하 여 변조의 3 차원 회전 타원 체 모델의 생성에 설명 합니다. HNEs 과목 조건부 재활 조건에서 확장 및 회전 타원 체 문화에 시드, 최소 침 습 방식 으로부터 격리 됩니다. 뿌리기의 2 주 안에 회전 타원 체 문화 HNE spheroids와 3', 5'-주기적인 아데노신 monophosphate (캠프) 자극 될 수 있는 생성-생성 촉진제 CFTR 기능을 활성화. 회전 타원 체 붓기는 CFTR 활동의 프록시 다음 정량 된다. HNE spheroids 질병 사망률 및 사망을 반영 하는 상피에 관련 된 접근, 맞춤 모델을 생성 하 비 강 세포의 침 습, 아직 호흡기 근원에 대문자로 표기 합니다. 공기 액체 인터페이스 HNE 문화에 비해, spheroids는 상대적으로 빨리 성숙, 전체 오염 속도 감소 시키는 있습니다. 그것의 현재 모양에서 모델이 조직 취득 상대적으로 완화에 의해 상쇄 됩니다 비록 낮은 처리량에 의해 제한 됩니다. Spheroids HNE 안정적으로 계량 CFTR 활동 개별 수준에서 특성을 사용할 수 있습니다. Vivo에서 마약 응답을이 정량화를 넥타이 하는 지속적인 연구 HNE spheroids CFTR 변조에 환자의 응답의 진정한 전 임상 예언자 인지 결정 됩니다.
서론
낭 성 섬유 증 (CF) 이상 7 만명 세계적으로1에 영향을 미치는 치명적인, 상 염색체 열성 질병 이다. 이 수명 단축의 유전 질환 돌연변이 낭 성 섬유 증 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 단백질 (CFTR)2에 의해 발생 합니다. CFTR의 멤버인 아데노신 3 인산 염 바인딩 카세트 가족과 기능으로 위장, 땀 샘을 포함 하 여 여러 편광된 epithelia의 꼭대기 막 걸쳐 염화 중 탄산염의 움직임을 허용 하는 이온 채널 그리고 호흡 나무, 다른 사람의 사이에서,34. 따라서, 역 기능적인 CFTR multisystem 상피 부전, 호흡기 질환1에서 형태소 분석 대부분 사망률과 리드. CF 폐, CFTR 구동 기도 표면 액체 (ASL) 규정과 점액 릴리스 리드의 굵은 점액, 기도 방해, 만성 감염, 및 진보적인 기도 개장 손실 및 폐 기능1,5.
질병의 원인으로 CFTR 부전의 식별에 불구 하 고 CF에 ....
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프로토콜
HNE 샘플 신시내티 아동 병원 의료 센터 CF 연구 센터를 통해 채용 하는 과목에서 조달 했다. 여기에 설명 된 모든 메서드는 신시내티 아동 병원 의료 센터의 기관 검토 위원회 (IRB)에 의해 승인 되었습니다. 서 면된 동의 테스트 전에 모든 과목에서 얻은 했다.
1. 확장 미디어와 항생제 미디어 준비
- 표 1에 나열 된 미디어 구성 요소를 수집 합니다. 냉동된 재료 실 온에서 해 동 하 고 "확장 미디어" 아래 표 1 에 표시 된 대로 필요한 재고 솔루션을 확인 합니다.
참고: 콜레라 독 소는 독성, 섭취 하는 경우는 피부, 눈, 호흡기 자극을 처리할 때 주의 사용 합니다. 확인 하 고 모든 솔루션 및 캐비닛 biosafety에 깨끗 한 조건 하에서 미디어를 결합 하 여. - 50 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 제거 하 고 다른 재료의 추가 대 한 보상을 한 컨테이너에서 기본 매체 (Dulbecco 수정이 글 매체/F12) 50 mL를 삭제. 압력가 1 L 유리 병에 손으로 모든 기본 미디어를 붓는 다.
- 미디어를 포함 하는 압력가 마로 소독 유리 병에 표 1 의 "확장 미디어" 섹션....
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결과
HNEs 문화 접시를 연결 하 고 시드;의 72 h 내의 셀의 작은 섬 형성 한다 1 주일에 좋은 고 가난한 섬 형성의 예는 각각 그림 1A 및 1B에 표시 됩니다. 이 섬 15-30 일의 과정을 통해 요리를 확장 해야 합니다. 작은 또는 차선 샘플 더 오래 걸릴 수 있습니다 및 종종 유용한 spheroids를 생성 하지 것입니다. 전염 성 요원으로 오염 깊은 노란색/흐린 미디어, 문화 접시를 연결할 셀의 실패 및 곰 팡 이/세균의 직접 시각화로 입증 됩니다. 모든 오염 된 문화 교차 오염을 피하기 위해 즉시 폐기 해야한다.
지하실 막 매트릭스에 문화의 첫 번째 3-4 일 이내 작은 낭 성 구조 행렬에서 양식 하기 시작 한다. 이 얇은 벽과 luminal 표면 보여주는 그대로 sp.......
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토론
이 프로토콜 환자 파생 코 셀 회전 타원 체 문화 CFTR 함수의 개별, 구체적인 모델을 생산할 수의 생성을 설명 합니다. 밀접 하 게 어려움을 피하기 위해 참석 해야 하는 과정에서 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 먼저 환자의 코에서 좋은 샘플 인수가입니다. 좋은 샘플 있어야 > 50000 세포, 점액/파편, 제한 하 고 (비록 성공 또한 쉽게 달성로 얼음에 배송) 4 h 이내 처리에 대 한 준비. 연습 연구 직원을 퀴 렛 또는 브러시 샘플 획득은 필요는 그들의 편안 함을 극대화 하기 위해 하나 또는 두 개의 공급자의 손에 초기 샘플 수집을 초점에 의해 촉진 된다. 둘째, 좋은 청소/살 균 기술 모든 조직 문화 단계에 필수적 이다. 모든 HNE 문화에 대 한 우리의 경험, 실패의 기본 모드는 기본 예제와 다른 성장 문화 인큐베이터에서 복잡 하 게 수 세균 이나 곰 팡이 오염. 문화 만성 감염 (예를 들어, CF) 과목의 증가이 위험, 따라서 성공 깨끗 하 고 별도 문화를 유지 하는 기능에 경첩. 우리의 연습 유지.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 작품은 낭 성 섬유 증 재단 치료제에 의해 지원 되었다, CLANCY14XX0, 번호를 부여 하 고 낭 성 섬유 증 재단을 통해 CLANCY15R0 번호를 부여. 저자는 크리스티나 레이 환자 모집 및 규제 감독 그녀의 지원에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 저자 또한 HNE 문화 능력의 세대에 지원 낭 성 섬유 증 재단에서 지 원하는 HNE 작업 그룹을 감사 하 고 싶다: 프레스 톤 Bratcher, 캘빈 면, 마르티나 Gentzsch, 엘리자베스 Joseloff, 마이클 Myerburg, 데이브 니콜스, 스콧 Randell, 스티브 로우, G. 마티 솔로몬, 그리고 캐서린 Tuggle
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL Eppendorf Tube | USA Scientific | 4036-3204 | |
| 150 mL 필터 플라스크 | Midsci | TP99150 | 여과 매체 |
| 15 mL 원뿔형 튜브 | Midsci | ||
| 1 L 필터 플라스크 | Midsci | TP99950 | 미디어 필터링 |
| 35mm 유리 바닥 접시 | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | 선택적 |
| 3-Isobutyl-1-Methylxanthine (IBMX) | Fisher Scientific | AC228420010 | 1mL의 DMSO에 22.0mg의 100mM 원액을 준비합니다 |
| 50 mL 원뿔형 튜브 | Midsci | ||
| Accutase | Innovative Cell Technologies, Inc. | AT-104 | 세포 분리 용액 |
| 아데닌 | 시그마-알드리치 | A2786-25G | 표 1 참조 |
| 암포테리신 B | 시그마-알드리치 | A9528-100MG | 표 1 참조 |
| 소 뇌 추출물 (9mg/mL) | Lonza | CC-4098 | 표 2 참조 |
| Ceftazidime 수화물 | Sigma-Aldrich | C3809-1G | 표 1 참조 |
| 셀 스크래퍼 20 cm | 미시과학 | ||
| CFTR Inh172 | Tocris Bioscience | 3430 | 1mL에 4.0mg의 10mM 원액을 준비하십시오 |
| Sigma-Aldrich | C8052-.5MG | 표 1 참조 | |
| CYB-1 | Medical Packaging Corporation | CYB-1 | 세포학 브러시 |
| 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) | Sigma-Aldrich | D5879-500ML | |
| Dulbecco의 변형된 독수리 매체 (DMEM)/F12 Hepes | 라이프 테크놀로지 | 11330-057 | 기본 매체; 표 1 및 2 참조 |
| 표피 성장 인자 (재조합 인간 단백질, 동물 유래 없음) | Thermo Fisher Scientific | PHG6045 표 1 참조 | |
| Epinephrine | Sigma-Aldrich | E4250-1G | 표 2 |
| 참조 Ethanol | Fisher Scientific | 2701 | |
| 에탄올 아민 | 시그마-알드리치 | E0135-500ML | 16.6 mM 용액; 표 2 참조 |
| 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) | TCI America | E0084 | |
| 소태아 혈청 (고성능 FBS) | 인비트로겐 | 10082147 | 표 1 참조 |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886-50 | 의 1mL에 4.1mg의 10mM 원액을 준비합니다 |
| . | 356231 | Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) 기저막 매트릭스, 페놀 레드-프리, LDEV-프리, 10 mL. | |
| Hemacyometer | Hausser Scientific | 1483 | |
| 인간 콜라겐 솔루션, 유형 I (VitroCol; 3 mg/mL) | Advanced BioMatrix | 5007-A | 콜라겐 솔루션 |
| HyClone (aka FetalClone II) | GE 헬스케어 | SH30066.03HI | 표 2 참조 |
| Hydrocortisone | StemCell Technologies | 07904 | 표 1 및 2 참조 |
| 인슐린, 인간 재조합, 아연 용액 | Life Technologies | 12585014 | 4 mg/mL 용액; 표 2 참조 |
| : IVF 4-Well Dish, Non-treated | NUNC (via Fisher Scientific) | 12566350 | 스페로이드용 4-웰 플레이트; 24-웰 플레이트와 유사한 웰 크기 |
| MEF-CF1-IRR | Globalstem | GSC-6001G | 방사선 처리된 쥐 배아 섬유아세포 |
| Metamorph 7.7 | 분자 장치 | 분석 소프트웨어; 견적 https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software | |
| Olympus IX51 도립 현미경 | Olympus Corporation | 단종했습니다 | . 교체: Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/ 견적 |
| Pen Strep | Life Technologies | 15140122 | 표 2 참조 |
| Phsophoryletheanolamine | Sigma-Aldrich | P0503-5G | 표 2 참조 |
| 레티노산 | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | 표 2 참조 |
| Rhinoprobe Arlington Scientific, Inc. | 96-0905 | 비강 큐렛 | |
| 슬라이드북 5.5 | 3i, Intelligent Imaging Innovations | 단종 | 이미징 소프트웨어. 교체: 슬라이드 북 6, 견적 https://www.intelligent-imaging.com/slidebook |
| Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | |
| Sterile Water | Sigma-Aldrich | W3500-6X500ML | |
| 조직 배양 접시 100 | Techno Plastic Products | 93100 | 팽창 용 조직 배양 접시 |
| Sigma-Aldrich | T4014-100MG | 표 1 참조 | |
| 트랜스페린 (인간 트랜스페린 0.5 mL) | Lonza | CC-4205 | 표 2 참조 |
| 트리요오도트리오닌 | 시그마-알드리치 | T6397-1G | 3,3&프라임;,5-트리요도-L-티로닌 나트륨 염 [T3]; 표 2 참조 |
| 돼지 췌장에서 추출한 트립신 | Sigma-Aldrich, | T4799-10G | |
| Ultroser-G | , Crescent Chemical(Fisher Scientific 경유) | NC0393024 | 20mL 리포필화 분말; 표 2 참조 |
| Streptomyces orientalis | Sigma-Aldrich | V2002-5G | 표 1 |
| VX770 | Selleck Chemicals | S1144 | |
| VX809 | Selleck Chemicals | S1565 | 4.5mg의 10mM 염원 용액 준비 DMSO Y-27632 Dihydrochloride 1mL에 4.5mg의 10mM 염원 용액을 구입하거나 준비 |
| . ROCK 억제제 | 엔조 라이프사이언스 | ALX-270-333-M025 | 표 1 참조 |
참고문헌
- Rowe, S. M., Miller, S., Sorscher, E. J. Cystic fibrosis. N Engl J Med. 352 (19), 1992-2001 (2005).
- Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).
- Anderson, M. P., et al.
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재인쇄 및 허가
