2 차원 반 변성 세제 Agarose 젤 전기 이동 법 확인 또는 아 밀 로이드 같은 녹말 체 섬유의 크기가 하 사용

요약

여기 우리를 사용 하 여 2 차원 반 변성 agarose 젤 전기 이동 법 다른 유형의 크기의 아 밀 로이드 같은 섬유의 존재를 확인 하 고 크기가 젤 동안 녹말 체 섬유의 분리로 인해 가능성을 제외 실행 중인 프로세스입니다.

초록

녹말 체 또는 아 밀 로이드 같은 섬유 많은 인간 질병과 관련 된 되었습니다 그리고 지금 많은 신호 경로 대 한 중요 한 발견 되 고 있습니다. 쉽게 다양 한 실험 조건에서 이러한 섬유의 형성을 감지 하는 능력은 그들의 잠재적인 기능을 이해 하기 위한 필수적입니다. 많은 방법이 섬유 검출에 사용 된 있지만 몇 가지 단점이 없이. 예를 들어 전자 현미경 (EM), 또는 콩고 빨강 또는 Thioflavin T 종종 얼룩이 섬유의 정화를 요구 한다. 다른 한편으로, 반 변성 세제 agarose 젤 전기 이동 법 (SDD-나이) 정화 없이 셀 추출 물에 SDS 저항 아 밀 로이드 같은 섬유의 탐지를 허용 한다. 또한, 섬유의 크기 차이의 비교 수 있습니다. 더 중요 한 것은, 그것은 서쪽 blotting에 의해 섬유 내의 특정 단백질을 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다. 그것은 시간이 덜 소모 되 고 실험실의 넓은 수에 더 쉽게 액세스할 수입니다. SDD-나이 결과 종종 변수 정도의 표시 됩니다. SDS의 전기 이동 법 동안 복잡 한 단백질의 분리에서 결과이 부분의 여부를 문제를 발생 시킵니다. 이러한 이유로, 우리 SDD-연령 인지 확인 하려면 SDD 시대에 본 크기가 진정으로 섬유가 생체 내에서 의 결과 하지 저하 또는 일부 중 단백질의 분리의 결과의 두 번째 차원 고용 전기 이동 법입니다. 이 메서드는 빠른, 질적 확인을 또는 아 밀 로이드 같은 녹말 체 섬유는 SDD-나이 과정에서 부분적으로 해리 하지 않을 수 있습니다.

서론

단백질 misfolding로 인해 녹말 체 섬유의 형성이 오래 알 츠 하이 머 병, 파 킨 슨 병, 헌팅턴 병¹pathologic 상태에 역할을 알려져 있다. 더 최근에, 녹말 체 또는 아 밀 로이드 같은 섬유의 형성 안티 바이러스 타고 난 면역 반응² 와 necroptosis^3,4, 동안 포함 한 인간, 그리고 낮은 유기 체 신호 통로의 일부가 될 표시 되었습니다. 효 모^5,6등. 따라서, 실험실에서 이러한 섬유를 감지 하는 능력은 중요 합니다. 현재, 아 밀 로이드 및 아 밀 로이드 같은 섬유 감지 하 세 가지 주요 방법이 있다: 염료, EM, SDD-나이의 사용.

콩고 빨강 또는 Thioflavin T 같은 염료를 사용 하 여 신속 하 고 쉽게 현미경 검사 법 또는 분광학⁷를 사용 하 여 감지 되는 장점을 제공 합니다. 그러나, 현미경 검사 법, 콩고 빨강의 경우에 의해 탐지 아무 특이성을 대 한 단백질....

프로토콜

1. 샘플 준비

1. 문화 2 x 10⁶ 아 밀 로이드 10 ml의 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 페니실린 스-10cm 조직 문화 접시에 HT-29 결 장 암 세포를 생산. 문화 셀 5% CO₂와 37 ° C 배양 기에서 하룻밤.
   1. 세포가 80 %confluency, 성장 후 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 10 mL로 세포 세척. 트립 신 솔루션의 3 mL를 추가 하 고 3 분 동안 37 ° C에서 품 어.
   2. 셀 접시에서 완전히 끊 후, 문화 매체의 10 mL을 추가 하 고 10 mL 피 펫 셀 15 mL 원뿔 튜브에 전송. 실 온에서 3 분 1000 x g에서 셀 원심 매체를 발음, resuspend 문화 매체의 5 mL에 셀과 셀 카운터를 사용 하 여 셀. 두 10 cm의 각 플레이트 2 x 10⁶ 셀.
   3. 준수 하 고 5% CO₂와 37 ° C 배양 기에서 하룻밤 복구를 셀 수 있습니다. 한 접시 20 ng/mL 종양 괴 사 요인 알파 (TNF-α), 100 nM Smac 모방 및 20 µ M 팬 caspase 억제제 Z-VAD-FMK¹¹와 amyloid....

결과

Necroptosis 유도 후 RIPK1 및 RIPK3 거의 동일한 아 밀 로이드 같은 패턴 (2, 4, 그림 1차선)을 보여주었다. 그러나, MLKL 섬유는 더 이질적인 되었고 RIPK1/RIPK3 섬유 (레인 6, 그림 1) 보다 작은 것 같았다. 그는 RIPK1/RIPK3-독립적인 섬유를 형성 하는 MLKL 또는 MLKL 단순히 SDD 시대 큰 RIPK1/RIPK3/MLKL 섬유에서 분리 가능성을 해결 하기 위해 2D SDD-나이 기법을 개발 하 라는 메시지가 나타납니다.

전기 및 전송 절차의 일반적인 회로도 그림 2에 표시 됩니다. 그림 3

토론

2D SDD-나이의 가장 중요 한 점은 전기 조건 첫 번째 및 두 번째 차원에 대 한 동일 하다는 것. 날카로운 대각선 45 ° (분리 또는 저하 발생 했음을 나타내는) 모두 동안 동일한 방식으로 마이그레이션 하는 섬유에 따라 검색할 수 electrophoreses. 예 전압 또는 실행된 시간을 변경 하는 다른 조건을 사용 하 여 이러한 결과 모호한 것 이다. 또한, 전통적인 1 D에 대 한 경우 처럼 SDD-나이, 샘플을 끓는 피해 야 한다로이 아 밀 로이드와 같은 아 밀 로이드 섬유를 방해 합니다. 모든 전송에 대 한 경우 처럼, 필터 종이, 막, 및 젤의 레이어 사이 거품을 피하기 위해 배려를 취해야 한다. 마지막으로, 전송 단계에서 그것은 중요 한 다리 다와 종이 타월 스택을 직접 연락 하지 않습니다. 이 방지 하기 위해 신뢰할 수 있는 방법은 종이 수건의 가장자리를 커버 플라스틱 랩의 작은 조각을 사용 하는 것입니다.

프로토콜 (60 V 4 h)에 제공 된 실행 조건은 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
젤 전기 이동법 단위	Fisher	HE99XPRO	젤 달리기를 위한 appratus.
아그로스	VWR	97062-250	아가로스 젤용.
종이 타워	Fisher	19-120-2484	용
여과지	VWR	21427-386
PVDF 멤브레인	Bio-Rad	162-0177
전송 차단 분유	Bio-Rad	1706404XTU	웨스턴 블롯
MLKL 항체	Genetex	GTX107538	토끼 안티 MLKL 항체
RIPK1 항체	BD Biosciences	610459	마우스 anti-RIPK1 항체 RIPK3
Xiaodong Wang		RIPK3 항체	토끼 anti-RIPK3. 참조 11.
안티 래빗 HRP	시그마	A6154	2 차 항체
ECL	피셔	WBKLS0500	웨스턴 화학 발광 HRP 기판
X 선 필름	피셔	F-BX810	웨스턴 블롯 결과
DMEM	시그마	D6429	세포 배양
태아 소 혈청	시그마	F4135	배양
세포 배양을 위한 페니실린-스트렙토마이신,	시그마	P4333
트립신 용액	세포 배양을 위한	시그마	T4049
조직 배양을 위한 PBS	배양을 위한	시그마	D8662
우리 실험실		재조합 TNF	. 참조 성구 11.
Xiaodong Wang		smac-mimetic	로 necroptosis를 유도합니다. 참조 성구 11.
ZVAD-FMK	ApexBio	A1902	부사 유발용. 참조 성구 11.
세포 계수기	Bio-Rad	1450102	모델 TC20; 세포
피어싱 &트레이드 계수용;	세포 용해물의 단백질 농도를 측정하기 위한	Thermo Scientific	23225
접시에서 세포를 제거하기 위한	Cell lifter	Fisher	07-200-364
용해 완충액(1 L)			20 mL 1 M Tris pH 7.4 10 mL glycerol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (프로테아제 및 인산염 억제제 원하는대)
10X TAE (1 L)			48.4 g 트리스 염기 11.42 mL 빙하 아세트산 20 mL 0.5M EDTA pH 8 ddH 2< / sub>0 to 1 L
4X SDD-AGE 로딩 버퍼 (50 mL)			5 mL 10X TAE 10 mL 글리세롤 < br / > 4 mL 20 % SDS 0.5 mL 10 % 브로 모페놀 블루 < / > 31 mL ddH2O
TBS 전송 버퍼(1 L)			20 mL 1 M Tris pH 7.4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O
PBST 세척 버퍼(1 L)			100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20
10X PBS (10 L)			800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4· 2H2O 24 g KH2PO4 10 L에 ddH2O 추가

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