분열 효 모 섬으로 불안정 프로테아좀 돌연변이 선택할 임의의 Mutagenesis 유전자 타겟팅

요약

이 문서에는 분열 효 모에 대상 유전자의 무작위 mutagenesis에 대 한 자세한 방법을 설명합니다. 예를 들어, 우리가 대상 rpt4 +, 19S 프로테아좀 섬으로 불안정 돌연변이 대 한 스크린의 소 단위를 인코딩하는.

초록

대상 유전자의 무작위 mutagenesis 원하는 표현 형을 생성 하는 돌연변이 식별 하기 위해 일반적으로 사용 됩니다. 무작위 mutagenesis 달성 하는 데 사용할 수 있습니다 방법의 오류가 PCR는 돌연변이의 다양 한 풀을 생성 하기 위한 편리 하 고 효율적인 전략 이다 (즉., 돌연변이 도서관). 연구원은 다른 게놈 영역을 영향을 받지 떠나는 동안 유전자의 코딩 지구 같은 미리 정의 된 영역을 변형 하고자 하는 경우 오류가 PCR 방법의 선택입니다. 돌연변이 라이브러리 오류가 PCR에 의해 증폭 되어, 후 적당 한 플라스 미드로 복제 해야 합니다. 오류가 PCR에 의해 생성 된 라이브러리의 크기는 복제 단계의 효율에 의해 제한 됩니다. 그러나, 분열 효 모, Schizosaccharomyces pombe, 복제 단계는 매우 효율적인 원스텝 퓨전 변환에 대 한 구문을 생성 하는 PCR의 사용으로 대체할 수 있습니다. 원하는 고기의 돌연변이 다음 적절 한 기자를 사용 하 여 선택할 수 있습니다. 여기,이 전략 자세하게, 예를 들어, centromeric 섬으로에 삽입 기자 복용 설명 합니다.

서론

앞으로 유전학 연구원 추구 특정 표현 형을 표시 하는 자연적 사건 돌연변이 및 유전 분석을 수행 고전적인 방법입니다. 반전 유전학에서 관심사의 유전자에 돌연변이 소개 하 고 표현 형 검사. 후자의 경우 대상 유전자의 무작위 mutagenesis 이후에 온도 감도 등 원하는 고기에 대 한 선택 또는 효소 활동을 변경 하는 돌연변이의 풀을 생성 하 자주 사용 됩니다. 다양 한 방법은 오류가 PCR¹;를 포함 하 여 임의의 mutagenesis 달성 하는 데 사용할 수 있습니다. UV 방사선 조사². 화학 mutagens, 에틸 methanesulfonate (EMS) 등 질소 산³; - mutD5 ⁴; 표현 등 임시 mutator 긴장의 사용 그리고 DNA⁵를 걸어 갔다입니다.

여기, 우리는 우리 분열 효 모에 대상 유전자 돌연변이 풀을 생성 하는 오류가 PCR을 이용 하는 반전 유전학 전략을 설명 합니다. 로 한의 이름에서이 메서드는 PCR 동안 일부러 오류를 도입 하 여 돌연변이 생성 합니다. 다른 mutagene....

프로토콜

1입니다. 미디어 준비

1. 준비 효 모 추출 보충 교재 (예), 네 아데닌 (예 로우 에이드), Pombe 조미료 매체 (PMG¹²), 그리고 PMG 없이 아데닌 (PMG-Ade) 없이 표 1에 설명 된 대로 구성 요소를 혼합 하 여. 예-에이드 (Ade 낮은)와 PMG-에이드 접시 같은 구성 요소를 모두 하지만 아데닌 후자에서 생략 됩니다.
   1. 다음 소금 (50 x) 주식을 사용: 52.5 g/L MgCl₂·6H₂O, 2 g/L CaCl₂·2H₂O, 50 g/L KCl, 2 g/L 나₂₄ 에 증류수 그래서. 필터는 0.22 μ m 기 공 크기 필터를 사용 하 여 소독 및 4 ° c.에 저장
   2. 다음과 같은 비타민을 사용 하 여 (1, 000 x) 주식: 1 g/L pantothenate, 10 g/L 니코틴산 산, 이노 시 톨 10 g/L, 증류수 비오 틴 10 mg/L. 필터는 0.22 μ m 기 공 크기 필터를 사용 하 여 소독 및 4 ° c.에 저장
   3. 다음 미네랄을 사용 하 여 (10, 000 x) 주식: 붕 5 g/L, 4 g/L MnS....

결과

그림 1 에 설명 된 절차에 따라 인수 Rpt4 돌연변이 식민지의 색상을 평가 하 여 분석할 수 있습니다. 식민지의 색상은 그림 2에 셀 수 감소에 관련 된 접시에 발견 했다. 섬으로 지역에 삽입 기자 ade6 + 야생-타입에 침묵 하 고 예 에이드 접시에 빨간 식민지를 보여줍니다. 일단는 섬으로 불안정 하 고 ade6 + 기자 표현, 백색 식민지 clr4Δ 돌연변이로 예 에이드 접시에 관찰할 수 있습니다. 스크린된 Rpt4 돌연변이 같이 있습니다. rpt4-1 돌연변이 가장 심각한 섬으로 불안을 보여줍니다.

토론

오류가 PCR 통해 임의의 mutagenesis 주어진된 지역에서 돌연변이의 다양 한 풀을 생성 하기 위한 강력한 도구입니다. 이 기술은 특정 상황에서 단백질의 기능을 평가 하는 연구에 대 한 특히 유용 합니다. 예, 우리는 여기는 19S 프로테아좀 소 단위, Rpt4, 섬으로 유지 보수에서의 기능을 평가 하기 위해 오류가 PCR을 사용. 변화 하 여 지역 오류가 PCR에 의해 표적으로 하 고 심사 조건 조정, 우리 관심 및 원하는 표현 형에 대 한 스크린의 게놈 영역에서 셀을 변경할 수 있었다. 최근, 스핀 들 극 신체 구성 요소²⁵에서 돌연변이 은닉 하는 분열 효 모 세포를 분리 하는 유사한 방법 사용 되었다.

무작위 mutagenesis의 주요 장점은 모두 비 필수 및 필수 유전자에 적용할 수 있습니다. 필수적인 유전자의 무작위 mutagenesis 세포 생존 능력 지속 될 수 있도록 하는 미묘한 또는 부분적 기능 오류 등 다양 한.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
<강한>1. 미디어
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-10KG
효모 추출물	BD Biosciences	212720
L-Leucine	JUNSEI	87070-0310
Adenine sulfate	ACR	16363-0250
Uracil	시그마-알드리치	U0750
L-히스티딘	시그마-알드리치	H8125
KH2PO4	시그마-알드리치	1.05108.0050
NaCl	JUNSEI	19015-0350
MgSO4• 7H2O	시그마-알드리치	63140
CaCl2	시그마-알드리치	12095
프탈레이트 칼륨	시그마-알드리치	P6758-500G
이노시톨	시그마-알드리치	I7508-50G
비오틴	시그마-알드리치	B4501-100MG
붕산	시그마-알드리치	B6768-1KG
MnSO4	시그마-알드리치	M7634-500G
ZnSO4• 7H2O	JUNSEI	83060-031
FeCl2• 4H2O	KANTO	CB8943686
나트륨 몰리브덴산염 이수화물	YAKURI	31621
KI	JUNSEI	80090-0301
CuSO4• 5H2O	YAKURI	09605
D-myo-inositol	MP biomedicals	102052
판토텐산	YAKURI	26003
니코틴산	시그마-알드리치	N4126-500G
(NH4)2SO4	시그마-알드리치	A4418-100G
아가로스	바이오베이직	D0012
G418, 게네틱인	LPS	G41805
2. 효소 반응
PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase	Aglient	600380	현장 지시 돌연변이 유발
GeneMorphII 무작위 돌연변이 유발 키트	Aglient	200500	오류 발생 PCR
Phusion High-Fidelity DNA 중합효소	Thermo Fisher	F-530L	융합 PCR
Ex Taq  DNA 중합효소	Takara	RR001b	일반 PCR
BamH1	New England BioLabs	R0136S
Xho1	New England BioLabs	R0146S
Dpn1	New England BioLabs	R0176S
3. 장비
Velveteen 사각형, 검은색	VWR	89033-116
복제품용 복제품 도금 도구	VWR	25395-380	복제품
MicroPulser Electroporator	Biorad	1652100	핵분열 효모 형질전환용
Electroporation 큐벳, 0.2cm 간격	Biorad	1652086	핵분열 효모 형질전환용
Thermal Cycler	Bioer	BYQ6078	융합 PCR 램프 반응용