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방법 논문

Desthiobiotin Streptavidin 선호도 중재 Mesothelioma 세포에서 RNA 상호 작용 단백질의 정화

7.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57516

⸱

2018년 4월 25일

 , 
1Laboratory of Molecular Oncology, Division of Thoracic Surgery, University Hospital Zurich

이 논문에서

요약

Desthiobiotin 라벨 아데닌 부자 요소 (는) 주제를 포함 하는 합성 25-뉴클레오티드 RNA oligo의 cytosolic는 바인딩 단백질의 특정 바인딩 수 있습니다.

초록

생체 외에서 RNA-풀 다운 특정 RNA 구조와 주제를 인식 하는 RNA 의무적인 단백질을 식별 하기 위한 프로토콜의 첫 번째 단계에서 아직도 크게 사용 된다. 이 RNA-풀 다운 프로토콜에서 상업적으로 합성된 RNA 프로브 biotin, desthiobiotin는 역에 streptavidin 바인딩하고 따라서 더에서 단백질의 차입을 허용 한다 RNA 가닥의 3' 말단에서의 수정 된 형태로 표시 됩니다 생리 조건입니다. RNA-desthiobiotin는 streptavidin 자석 구슬, 풀 다운 단백질 특히 관심의 RNA와 상호 작용 하는 데 사용 되는에의 상호 작용을 통해 움직일 수 있습니다. Mesothelioma 셀의 cytosolic 분수에서 비 변성 및 활성 단백질은 단백질의 원본으로 사용 됩니다. 여기 설명 하는 방법은 알려진된 RNA 의무적인 단백질 25-뉴클레오티드 (nt) 긴 RNA 프로브를 포함 하는 관심사의 순서 사이 상호 작용을 검출 하기 위하여 적용할 수 있습니다. 안정 또는 불안정 기자 벡터 분석 결과 사용 하 여 달성 하는 RNA 분자에 존재 하는 성분의 기능 특성을 완료 하는 데 유용 합니다.

서론

유전자 발현과 유전자 제품의 최종 수준 mRNA 안정성과 mRNA 번역 속도1에 영향을 미치는 하 여 단단히 통제 수 있다. 이러한 post-transcriptional 규제 메커니즘은 타겟된 mRNA와 비 코딩 RNA 또는 RNA 바인딩 단백질 (RBPs)의 상호 작용을 통해 발휘 됩니다. 그것은 일반적으로 특정 cis을 포함 하는 (3' UTR-게놈2의 비 코딩 부분에 속하는) mRNA의 3' 번역된 영역- 트랜스에 의해 인정 되는 규제 요소 (CRE)-미르 등 RBPs 요인 행동 3. 최고의 공부 cis-3' UTR, 내의 요소는 차례에, 그리고 특정 AU-바인딩 단백질 (AUBP)에 의해 인식 되는 아데닌 부자 요소 (는) 모티브 유도 하거나 mRNA 저하/deadenylation (감퇴는 중재) 또는 mRNA의 안정화4.

크기는 3' UTR calretinin의 mRNA (CALB2)은 573 bp 긴 AREsite2, bioinformatic 도구5에의해 예측 상 상속 AUUUA pentamer 포함. Putative는 모티프의 존재와 일치, pmirGLO 벡터 기자 분석 결과 CALB2 mRNA6내에서이 요소의 안정화 역할을 설명 했다. 마지막으로,는 생체 외에서 RNA-풀 다운 사용 되었다 calretinin 안정화 AUBP를 식별 하는 모티브를 통해 mRNA.

모든 비 코딩 RNAs는 단백질7상호 작용에서 생체 외에서 RNA-풀 다운 이므로 좋은 방법과 선택의 첫 번째 분석 결과 RNA-인터 식별 분자 메커니즘을 해독에 도움. 이 RNA-풀 다운 방법에서는 상업적으로 합성된 RNA 프로브, RNA 가닥의 3' 말단에 biotin (desthiobiotin)의 수정 양식을 표시 했다 사용 되었다. RNA-desthiobiotin는 streptavidin 자석 구슬, 풀 다운 단백질 특히 관심의 바운드 RNA 상호 작용 하는 데 사용 되는에의 상호 작용을 통해 움직일 수 있습니다. Mesothelioma 셀의 cytosolic 분수에서 비 변성 및 활성 단백질은 단백질의 원본으로 사용 됩니다. 이러한 RNA 바인딩 단백질은 eluted 자석 구슬, 12 %SDS 페이지 젤 통해 실행 하 고, 막, 전송 하 고 다른 항 체와 조사에서.

표준 streptavidin biotin 선호도 정화 절차, 가혹한 변성 조건8바운드 단백질 elute 강한 돌이킬 수 없는 biotin streptavidin 본드를 방해 하는 데 필요한 어떤의 분리 발생할 수 있습니다. 단백질 복합물입니다. Biotin, 달리 desthiobiotin 역에 streptavidin 바인딩하고 biotin, 단백질의 부드러운 차입에 대 한 허용 하 고 피하는 자연스럽 게 biotinylated 분자9, 격리의 버퍼 솔루션 경쟁력 있 제안 기법 기본 조건에서 네이티브 단백질 복합물을 분리 하는 데 이상적입니다.

생체 외에서 바인딩 조건과 엄중, 소금 농도, 감소 시키는 대리인 및 세제 비율에 의해 결정 됩니다,이 진정한 vivo에서 상호 작용을 식별 하기 위해 그 세포질 문맥에 가까이 있어야 한다. 여기에 구현 된 바인딩 조건 있다 이전 증명 AU-바인딩 단백질10으로 허의 식별을 위해 적절 한. 이 이렇게 어렵고 도전적인 적절 한 바인딩 조건의 최적화 될 수 있으므로 시간을 절약할 수 있다. 또한,이 방법은 어떤 RNA-풀 다운 실험 시작 프로토콜로 사용 될 수 고 소금 및 세제의 농도 변경 하 고, 글리세롤 백분율을 변경 하 고 다른 소금 추가 여 점차적으로 최적화할 수 있습니다. 또한, 우리는 심지어 짧은 25-뉴클레오티드 RNA-조사는 pentamer 은닉는 모티브 사용할 수 특정 AUBP와의 상호 작용을 보여 시연.

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프로토콜

1. Cytosolic 핵 단백질 분수의 준비

  1. 플레이트 4 x 106 ACC-MESO-4 셀 RPMI-1640 매체에에서 성장 T150 셀 문화 술병에 보충 10 %FBS, 1 x 페니실린/스 (100 x), 그리고 2 m L-글루타민 (200 m m) m. 셀 80-90% (6 셀 ~5-5.5 x 10)의 합류에 도달, 핵 및 cytosolic 분수의 단백질 추출 진행.
    참고: ACC-MESO-4 셀 라인 RIKEN 유관 센터11에서 얻은 했다.
  2. 중간 발음, 1 x PBS의 15 mL을 추가 하 여 셀을 세척, 기울기 접시 부드럽게 몇 번와 1 x PBS 발음. 0.25%의 3 개 mL를 추가 트립 신-EDTA와 문화 플라스 크 3 분 동안 37 ° C에서 품 어.
    참고: 분리;에 대 한 현미경 셀 보고 아직도 수돗물을 연결 하는 경우는 3의 손바닥에 대 한 플라스 크 시간.
  3. 7 mL RPMI 1640 매체와 10 %FBS, 1 x 페니실린/스 (100 배), 2 mM L-글루타민 (200mm) 보충의 추가, 15 mL 튜브에 세포를 수집 하 고 5 분 동안 200 x g에 아래로 회전.
  4. 중간 발음 그리고 1.5 mL 1 x PBS 가진 펠 릿 셀 resuspend microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세포를 전송. 500 x g와 4 ° C 5 분 삭제는 상쾌한 아래로 회전 합니다.
    참고:이 단계 이후,에서 4 ° C에서 원심 분리 단계를 모두 수행 하 고 얼음에 모든 시 약을 계속.
  5. 1 x PBS의 얼음 처럼 차가운 1.5 mL와 셀 펠 릿 resuspend 및 회전 500 x g에서 셀 3 분에 4 ° C 감소 삭제는 상쾌한.
    참고: CER의 필요한 금액 나, CER II 및 NER 시 약은 10, 0.55, 및 5 양의 예상된 셀 펠 릿 포장 볼륨, 각각; 다음 프로토콜 20 µ L의 볼륨을 가정합니다. 시 CER의 필요한 만큼만 준비 하는 것이 좋습니다 난.
  6. 200 µ L 얼음 세포질 추출 시 약의 추가 (CER 나) 100 x 재고를 물 500 µ L에서의 프로 테아 제 억제제 (EDTA 무료) 1 태블릿을 희석 2 µ L 성분 억제 물, 예를 들어, x 1의 보완. 이 정도의 시 CER 내가 lyse 세포 펠 릿 포장 볼륨의 20 µ L에 충분 하다.
    1. 셀 펠 릿 포장 볼륨을 추정, 1.5 mL 튜브 셀 펠 릿을 포함 하는 튜브를 비교 하 여 10, 20, 50 또는 100 µ L 1 x PBS의 가득 합니다.
  7. 적극적으로 vortexing 15 튜브에 의해 셀 펠 릿 resuspend s 10 분 추가 11 µ L의 튜브, 5에 대 한 적극적으로 소용돌이를 얼음 처럼 차가운 세포질 추출 시 약 II (CER II)에 대 한 얼음에 튜브를 품 어와 s, 그리고 얼음에 1 분을 품 어.
  8. 5 s와 분리기 g x 16, 000에서 튜브에 대 한 적극적으로 소용돌이 4 ° C 5 분에 대 한 얼음에 깨끗 한 미리 냉장된 튜브에는 상쾌한을 전송. 상쾌한 더 세포질 분수는 RNA-풀 다운 실험에 사용.
  9. 1 µ L 성분 억제 물 (100 x)와 적극적으로 15 소용돌이의 보충의 얼음 핵 추출 시 약 (NER) 100 µ L에서 나머지 펠 릿 resuspend s. NER 시 약 protease 억제제와 보충의 필요한 만큼만 준비 하는 것이 좋습니다.
  10. 가끔 vortexing 15와 40 분 동안 얼음에 샘플을 품 어 s (매 10 분).
  11. 깨끗 한 미리 냉장된 튜브를 튜브에서 16000 x g 10 분 전송에 대 한 (이것은 핵 단백질 분수) 상쾌한 원심.
  12. Bicinchoninic (BCA) 메서드를 사용 하 여 단백질 농도 측정 하 여 즉시 진행 ( 재료의 표참조). 각 분수의 단백질 순수성에 대 한 제어, α-tubulin (긍정적인 탐지 cytosolic 분수에만) 및 폴 리 ADP ribose 중 합 효소-PARP (긍정적인 탐지 핵 분수에만)에 대 한 immunoblotting (그림 1)을 수행 합니다. 단백질 시각화, 섹션 4 참조.
  13. 단백질 활동 및 그들의 원시 상태를 유지 하기 위하여 cytosolic 핵 추출 물의 aliquots의 25 µ L를 준비 합니다. 5 s를-80 ° c.에 직접 저장소 액체 질소에 그들을 배치 하 여 스냅-동결이이 aliquots

2. Desthiobiotin와 RNA의 라벨

  1. 상업적으로 합성 하는 RNA 프로브 및 HPLC 정화 있다. 10 µ M에서 nuclease 무료 물으로 resuspend.
    참고: 프로브 시퀀스는 표 1에 나열 됩니다.
  2. RNA의 RNA-풀 다운 반응 당 50 pmol을 사용 합니다. 해 동 하 고 얼음에 목이 30%, RNA oligo의 라벨 3' 말단에 사용 제외 하 고 모든 시 약을 계속.
  3. 5 µ L 10 µ M RNA 프로브, CALB2로 분류 3' UTR (있다)의 전송, CALB2 3' UTR (mtARE), 및 관련 RNA (분노), 0.5 mL 얇은 microcentrifuge로 튜브 5 분 위 튜브 즉시 얼음에 85 ° C에서 PCR 기계에 품 어.
    참고:이 단계는 중요 하다, 그것은 휴식 및 라벨에 대 한 RNA 조사의 접근성을 촉진.
  4. 단 하나 30 µ L 반응에 대 한 다음 10 µ L 믹스 RNA 포함 된 튜브에 추가: nuclease 무료 물 3 µ L, RNA 리가 반응 버퍼, RNase 억제제의 1 µ L x 10의 3 µ L (40 U / µ L), Desthiobiotinylated Cytidine Bisphosphate (1mm)의 1 µ L 그리고 T4 RNA 리가 (20 U / µ L)의 2 µ L.
    참고: 마스터 믹스 A 초과 (3.2)에서 3 샘플, 혼합 준비 nuclease의 9.6 µ L 무료 물, RNA 리가 반응 버퍼, RNase 억제제의 3.2 µ L x 10의 9.6 µ L (40 U / µ L), Desthiobiotinylated Cytidine Bisphosphate (1mm)의 3.2 µ L 및 T4 RNA 리가 (20 U / µ L)의 6.4 µ L.
  5. 신중 하 게 15 µ L의 말뚝 반응에 30% 추가. 또 다른 팁을 사용 하 여 혼합 반응. 품 어 하룻밤 16 ° c.에 반응
  6. 다음 날, 다음 준비: 5 M NaCl (신선/nuclease-무료), 클로 프롬: isoamyl 알콜 24:1 비율 (예를 들어, 반응-96 µ L 클로 프롬 및 isoamyl 알콜의 4 µ L 당), 얼음 100% 에탄올, 그리고 차가운 70% 에탄올.
  7. RNA 라벨 반응 관에 nuclease 무료 물 70 µ L를 추가 합니다. 클로 프롬의 100 µ L를 추가: isoamyl 알콜과 소용돌이 짧게. 스핀-다운 13000 x g에서 3 분 신중 하 게 제거만 위 단계와 새로운 nuclease 무료 1.5 mL 튜브;에 대 한 낮은 단계를 만지지 마십시오.
  8. 5 M NaCl, 글 리 코겐의 1 µ L 및 얼음 100% 에탄올의 300 µ L 10 µ L를 추가 합니다. 2 시간 동안-20 ° C에 튜브를 놓습니다.
    참고:이 단계에서 실험 다음 날에 계속 될 수 있다.
  9. 15 분을 위한 13000 g x 및 4 ° C에서 원심 분리기는 펠 렛을 방해 하지 않고 신중 하 게는 상쾌한을 버리십시오. 얼음 처럼 차가운 70% 에탄올과 원심 분리기 13000 x g에서 다시 및 4 ° C 5 분의 300 µ L를 추가 합니다.
  10. 상쾌한을 완전히 무시 하 고 펠 릿 (15 분)를 건조. 20 µ L nuclease 무료 물에 펠 릿을 resuspend.
    참고: 같은 날에 RNA-풀 다운으로 진행.
  11. 2 분 동안 90 ° C에서 RNA를 품 어 고 얼음에 놓습니다. Streptavidin 자석 구슬의 사전 세척의 다음 단계 동안 얼음에 셔 서 RNA를 놓습니다.
    참고: 장시간 보육 RNA 조사를 손상 될 수 있습니다.

3. RNA-단백질 풀 다운

  1. 미리 세척 streptavidin 자석 구슬 및 desthiobiotin RNA를 가진 외피
    1. 50 pmol RNA 당 streptavidin 자석 구슬의 50 µ L을 사용 합니다. 그러나,이 실험에 따라 최적화 되어야 합니다.
    2. 소용돌이와 streptavidin 자석 구슬 15 s, 그리고 신속 하 게 제거 200 µ L (마스터 믹스, 3 + 1 반응에 대 한 충분 한) 사용 하 여 깨끗 한 1.5 mL 튜브 안전 잠금에 대 한 튜브 컷 피 펫 팁. 구슬 튜브의 측면에서 수집 하 고 기다리는 1 분 제거 물의 resuspension 액체 튜브 마그네틱 스탠드에 놓습니다.
    3. 구슬 세척, 마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거, 0.1 M NaOH, 0.05 M NaCl 솔루션, 그리고 부드럽게 몇 번 위아래로 피펫으로의 400 µ L를 추가 합니다. 마그네틱 스탠드에 다시 튜브를 놓습니다. 1 분 대기 고는 상쾌한을 수집 합니다. 이 단계를 다시 반복 합니다.
    4. 워시 100 m NaCl m의 200 µ L와 구슬. 제거는 상쾌한.
    5. 트리 스 (pH 7.5), pipetting으로 구슬 resuspend, 튜브 자석 스탠드에, 1 분 동안 대기 놓고 제거는 상쾌한 20 m m의 200 µ L를 추가 합니다. 단계를 반복 합니다.
    6. 마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거, RNA 캡처 버퍼, x 1의 200 µ L을 추가 하 고 간단히 vortexing에 의해 streptavidin 자석 구슬 resuspend. Streptavidin 자석 구슬의 50 µ L을 제거 하 고 잘라 피 펫 팁을 사용 하 여 각 레이블이 RNA 튜브에 추가. 롤러에 실 온에서 30 분 동안 튜브를 품 어.
  2. RNA 단백질의 바인딩
    1. 마그네틱 스탠드에 튜브를 배치 하 고 1 분 대기는 상쾌한을 제거 합니다.
    2. 구슬에 20 mM Tris (pH 7.5)의 50 µ L을 추가 하 고 pipetting으로 resuspend. 마그네틱 스탠드에 튜브를 배치, 1 분을 기다려 하 고 상쾌한을 제거 합니다. 이 단계를 반복 합니다.
    3. 구슬에 단백질-RNA 바인딩 버퍼 x 1의 100 µ L을 추가 하 고 pipetting으로 resuspend.
    4. 한편, 다음 믹스를 준비: 10 µ L 단백질-RNA 바인딩 버퍼, 50% 글리세롤의 30 µ L, 세포질 단백질의과 nuclease 무료 50 µ g x 10의 최대 100 µ L를 물.
      참고: 다음과 같이 초과 (3.3)에서 3 샘플에 대 한 마스터 혼합 B를 준비: 단백질-RNA 바인딩 버퍼 x 10의 33 µ L, 50% 글리세롤의 99 µ L, 세포질 단백질과 nuclease 무료 물까지 330 µ L.의 165 µ g 유지의 마스터 B 얼음에 튜브.
    5. 마그네틱 스탠드에 튜브를 배치 하 고 1 분 대기는 상쾌한을 수집 합니다. 마스터 혼합 B 100 µ L을 추가 하 고 부드럽게 위아래로 pipetting으로 resuspend 거품을 만들지 마십시오. 롤러에 4 ° C에서 60 분에 대 한 반응 튜브를 품 어.
  3. 세척 및 차입
    1. 마그네틱 스탠드에 튜브를 배치, (즉, 통해-FT) 상쾌한, 수집 하 고 새 튜브로 전송.
      참고: 나중에 분석을 위한 얼음에이 피트 유지.
    2. 플라스틱 구슬에 워시 버퍼 x 1의 100 µ L, 부드럽게 resuspend, 마그네틱 스탠드에 다시 넣어, 1 분, 대기 고는 상쾌한 삭제. 2 번이이 단계를 반복 합니다.
    3. 자성 구슬에 차입 버퍼의 40 µ L를 추가 하 고 아래로, pipetting으로 섞어 30 분 동안 튜브 셰이 커 (950 rpm)에 37 ° C에서 품 어.
    4. 튜브 마그네틱 스탠드에, 1 분을 기다려 놓고 (eluate-E는) eluted 샘플을 수집 합니다. 얼음에 놓고 다운스트림 분석을 위해 사용 합니다.
      참고:이 단계에서 각 시험된 RNA 프로브 자형 (FT) 및 eluate (E) 샘플을 구성 됩니다.

4. polyacrylamide 전기 및 서양 오 점 분석

주:이 섹션에서 사용 되는 버퍼에 대 한 조리법에 대 한 표 2를 참조 하십시오. 서 부 수행 Laemmli 방법을12에 따르면 오.

  1. Handcast 12 %SDS 페이지 젤 (10-우물, 1.5 m m 간격, 66 µ L). 실행 중인 젤 믹스 준비: 30% 아크릴-bisacrylamide 재고 솔루션, 낮은 트리 스의 2.4 mL의 4 mL, dH2O, TEMED, 10% 염화 persulfate 솔루션 (APS)의 96 µ L의 9.6 µ L의 3.2 mL 버퍼. 겹쳐 쌓이는 젤 믹스 준비: dH2O, 30% 아크릴-bisacrylamide 재고 솔루션, 위 Tris 버퍼의 1.3 mL의 0.5 mL, TEMED, 10%의 20 µ L의 10 µ L의 3.25 mL AP.
  2. 6 x Laemmli 버퍼의 16.6 µ L을 추가 (예, 트리 스/HCl/SDS pH 6.8의 14 mL (위 Tris 버퍼), sds, DTT, 글리세롤, 및 0.012 %bromophenol 블루; 6 mL의 1.86 g 2 g-20 ° C에 저장) 피트 샘플 및 샘플 전자로 6 x Laemmli 버퍼의 6.6 µ L로. 95 ° c.에 5 분에 대 한 샘플을 품 어
  3. (피트 및 전체 20 µ L Elute ~ 40 µ L) 샘플 로드 60 V, 20 V 밤새 계속 30 분 동안 그들을 실행 하 고.
  4. 세미 드라이 electroblotting 시스템을 사용 하 여, 단백질 15 V 80 분에 대 한 PVDF 막에 전송 합니다.
    참고: PVDF 막 단백질 전송 수행 하기 전에 활성화 해야 합니다. 초순에 2 분 부 화 뒤 1 분에 100% 메탄올에서 막 품 어.
  5. 단백질 전송 후 Coomassie 솔루션 3 h, 초순, 각 30 분 세척의 3 단계 다음에 대 한 SDS 페이지 젤을 품 어.
  6. 단백질의 끝에, 건조 단계 4.5에서 1 헤 막 활성화 위해 PVDF 막 하자. 차단 막 1 x TTBS에 5 %BSA 1 시간.
  7. 첫번째 항 체로 막 품 어: 허 또는 mesothelin, 모두 희석 4 h 실내 온도에 또는 하룻밤 4 ° c.에 대 한 1 x TTBS에 5 %BSA 1:1000
  8. 1 x TTBS에 7 분에 대 한 세 번 막 세척 하 고 토끼 반대로 마우스 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)와 품 어-활용 된 이차 항 체 희석 5 %BSA, 1 x TTBS에에서 1:10,000.
  9. 향상 된 화학 및 디지털 영상 장치를 사용 하 여 단백질을 시각화.

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결과

이 실험에서 calretinin 3' UTR 은닉은 모티브의 (CALB2 3' UTR (은) 25-nt) 25-nt 긴 조각 인간 항 R (허) 단백질, 알려진된 mRNA 안정제에 특히 바인딩 되었는지 테스트 하려면 사용 되었습니다. 테스트는 요소, 25 nt RNA의 특이성 조사 CALB2 3' UTR (mtARE)는 모티브의 안정화 효과 폐지 이전 보였다는 모티브는 돌연변이 포함 하 이었다 사용된6. 3 RNA 프로브 28 nt 부정적인 제어 없는 요소를 포함 하는 잘 정의 된 철 반응 (없는 RNA (분노)), 철 응답 cytosolic 단백질13,14바인딩할 알려진 RNA를 나타냅니다. 허 cytosol15mRNA 안정제로는 핵 함수 내에서 지역화 주로 이기 때문에, 핵/cy...

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토론

3' Utr는 비 코딩 게놈3에 속하고 모든 비 코딩 RNAs 단백질7그들의 기능 발휘 하기 위하여 작용할 수 있습니다. 포유류 게놈 복사할 퍼지 수를 발견 하 고 긴 noncoding RNAs16의 상당 부분을 생산,이 긴 noncoding RNAs로 상호 작용 하는 유전자 발현 조절에 작동 입증 증거를 신흥 개장 하는 chromatin 단지17. 이 정보는 RNA-풀 다운 분석 결과 이용 하 여 얻었다. 따라서, 특정 RNA의 인터 해독 하려면 첫 번째 단계 수 풀 다운 RNA 등 생체 외에서 생 화 확 적인 분석 수행 간단 있습니다.

메모의 시퀀스 모티브 뿐만 아니라 RNA의 이차 구조 역할을 중요 한 RNA 기능에 그들은 필수적인 단백질 상호 작용 도메인을 형성 한다. 이차 구조 생리에 ...

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공개 사항

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

감사의 글

이 작품은 스위스 국립 과학 재단 Sinergia 그랜트 CRSII3 147697, 재단에 Angewandte Krebsforschung와 취리히 Krebsliga에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
NE-PER 핵 및 세포질 추출 키트Thermo Fisher Scientific 78833
피어스 프로테아제 억제제 정제, EDTA-freeThermo Fisher ScientificA32965
피어스 BCA 단백질 분석 키트써모 피셔 사이언티픽23225
피어스 자기 RNA-단백질 풀다운 키트 Thermo Fisher Scientific20164마그네틱 비드가 포함되어 있으므로 키트를 4°C에서 보관해야 합니다. C
피어싱 RNA 3' 엔드 데스티오비오티닐화 키트 Thermo Fisher Scientific20163이 키트는 "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit"의 일부이며 -20°C에서 보관해야 합니다. C는 풀다운 키트(4 ° C)를 참조하십시오.
DynaMag-2,  자기 스탠드Thermo Fisher Scientific12321D
Anti - HuR (MOUSE) 단클론 항체Thermo Fisher Scientific-이 항체는 Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit에 포함되어 있습니다. - 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS
Anti - α - tubulin (MOUSE) monoclonal antibodySanta Cruz80351:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS
Anti - PARP (RABBIT) Polyclonal antibodyCell Signaling95421:1000 in 5% BSA 1x TTBS - goat anti-rabbit secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS
Anti - Mesothelin (MOUSE) 단클론 항체 Rockland200-301-A87
2차 염소 항토끼 항체세포 신호7074
2차 토끼 항-마우스 항체Sigma-AldrichA-9044
RPMI - 1640 중간Sigma-AldrichR8758
FBS - 여과된 소 혈청팬 Biotech P40-37500
페니실린 - 스트렙토마이신 (100x)시그마-알드리치 P4333
L-글루타민 용액 (200 mM)Sigma-Aldrich G7513
0.25% 트립신-EDTA (1x)Gibco by Life technologies 25200-056
Mini-PROTEAN 3 CellBio-Rad1653301
Mini Protean 시스템 유리 플레이트 Bio-Rad1653308
1.5mm 통합 스페이서가 있는 Mini-PROTEAN 스페이서 플레이트Bio-Rad1653312
Mini-PROTEAN 빗, 10-well, 1.5 mm, 66 µ LBio-Rad1653365
Mini-PROTEAN Tetra 세포 주조 모듈Bio-Rad1658050
RNaseZap RNase 오염 제거 솔루션Thermo Fisher ScientificAM9780
Rotiphorese gel 30 - 37.5:1Roth3029
20% SDS 의PanReac AppliChemA3942
PVDF 전사막 Perkin ElmerNEF1002순수한 메탄올에서 1분 동안 배양한 후 2분 동안 물로 세척하여 활성화해야 합니다.
Trans-Blot SD 반건조 전사 셀 Bio-Rad1703940
Clarity Western ECL SubstrateBio-Rad1705061
FusionFX  디지털 이미저Vilber-RNA
올리고 합성Mycrosynth AG, 스위스-합성 규모 - 0.04 &마이크로; mol - HPLC 정제된
소 혈청 알부민Sigma-AldrichA7030
염산 (HCl) 6 MPanReac AppliChem182883.1211
초순수 1 M Tris, pH 7.5 Thermo Fisher Scientific15567027
글리세롤 Thermo Fisher Scientific1790450% 멸균 분취량은 -20°C에서 보관해야 합니다. C
피어스 스트렙타비딘 자석 비즈 Thermo Fisher Scientific88817이 마그네틱 비드의 평균 직경은 1 &마이크로입니다. m (0.5 - 1.5 µ 범위; 또한, Dynabeads-M280 Streptavidin은 균질화 크기 2.8 µ의 비드입니다. m은 RNA-pulldown에도 사용되지만 정제 과정에 영향을 미칠 수 있습니다.
TEMEDSigma-AldrichT9281
과황산암모늄 Sigma-AldrichA3678
Coomassie G-250ApplichemA3480
알루미늄황산염-(14-18)-수화물 시그마-알드리치368458
오르토인산 애플리켐A0637
에는 비율로 30% 아크릴아미드 및 비사아크릴아미드 재고 용액;

참고문헌

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