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방법 논문

Clostridium Perfringens 독성 연구를 마 취 특정 병원 체 무료 닭에 합자 장 루프 모델

9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57523

⸱

2018년 10월 11일

 ,  ,  , 
1Department of Clinical Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Université de Montréal, 2University of Bristol

이 논문에서

요약

여기 치킨 소장에서 '장 합자 루프'를 수술로 만들려고 프로토콜 선물이. 이 절차는 여러 Clostridium perfringens 긴장의 독성에서 제자리에 단일 호스트에서의 비교에 대 한 수 있습니다. 이 메서드는 현저 하 게 일반적으로 비슷한 vivo에서 실험에 필요한 닭의 수 감소.

초록

괴 사 성 장 염은 다양 한 비보에 감염 모델을 사용 하 여 닭에 공부 했다. 대부분의 gavage 또는 Clostridium perfringens를 사용 하 여 피드를 통해 관리 predisposing 요소, coccidiosis, 다이어트, 등의 조합을 사용 합니다. 이러한 모델에서 독성 연구에 대 한 여러 C. perfringens 긴장의 비교는 많은 중요 한 결과 얻기 위해 호스트 필요 합니다. 연구의 과정에서 사망률 따라서 연구에서 동물 복지에 관한 윤리적 우려를 제기 하는 실험 모델에 따라 높은 수 있습니다. 적은 동물 공부 병 인, 아직 제공 하 고 통계적으로 중요 하 고 유효한 결과 요구 하는 새로운 감염 모델의 개발 연구에서 동물 사용 감소에 중요 하다. 쥐, 토끼, 송아지 등 다양 한 종에서 clostridial 감염 공부 하 장 합자 루프 모델 사용 되었습니다. 합자 루프 세그먼트를 만드는 수술 절차에 따라 C. perfringens 긴장 박테리아와 장 점 막 사이의 긴밀 한 접촉을 설정 하는 루프에 직접 주입 됩니다. 소장 및 luminal 내용을 샘플 몇 시간 후 절차의 종료에 찍힌다. 여러 세균성 긴장 따라서 실험에서 필수 과목의 수를 줄이고 각 동물에 주사 될 수 있습니다. 또한, 절차는 동물 통증을 줄이기 위해 전신 마 취 아래 수행 됩니다. 닭,이 모델을, 때문에 적은 동물 필요 없음 predisposing 요소, 질병을 유발 하는 데 필요한 통증 진통제에 의해 제어 됩니다 C. perfringens 스트레인 pathogenicity 비교할 구강 관리 보다 더 적절 한 것 . 장 합자 루프 모델은 닭에 제대로 설명 하 고 표준화의 최적의 사용을 위해 필수적 이다. 이 원고는 닭에 수많은 장 합자 루프를 만드는 데 필요한 모든 단계를 제공 하 고 유효한 결과 얻기 위해 중요 한 포인트에 대 한 정보를 제공.

서론

인간과 동물에 영향을 미치는 전염병 연구 동물 모델의 사용 규제 정교를 방지 하거나 질병1치료 전략으로 특정 조건 또한의 병 독성 요인 평가에서 중앙 도구입니다. 동물 모델을 사용 하 여 다양 한 질병 연구의 수많은 장점에도 불구 하 고이 연습에 대하여 윤리적인 관심사는 발생 하는. 연구팀은 중요 하 고 유효한 결과 가져오는 동안 동물 사용을 최소화 해야 합니다. 3 Rs 원칙 (대체, 감소 및 수정)의 개념은 복지 문제 같은 재판에서 해결 했다 보장 하기 위해 정교 했다. 닭 괴 사 성 장 염 연구, 치킨 모델 vivo에서 병 인, 예방, 및이 조건2,3,,45의 치료를 조사 하는 데 사용 됩니다. C. perfringens 들고 NetB 독 소6, 등 특정 독성 요인의 병원 성 긴장 닭7에서 괴 사 성 장 염을 일으킬 관리 됩니다. 교체 원리가 이다, 따라서, 이러한 독성 요인으로 중요 한 다른 동물 종에 되지 않을 수도 있습니다 이러한 경우에 달성 하기 어렵습니다. 대부분 닭에서 괴 사 성 장 염에 대 한 위험 요소, coccidiosis 등의 조합을 사용 하 여 모델과의 C. perfringens2. 의 많은 수를 포함 하는 국물 문화 gavage 뒤 괴 사 성 장 염을 유발 하는 다이어트를 변경 이러한 모델에 많은 닭, 질병을 유발 한다 고 사망률 같은 재판8, 따라서 동물 연구에서 감소와 상세 원칙에 대 한 우려를 제기에 중요할 수 있습니다.

장 합자 루프 모델 원리 감소 및 구체화 장내 병원 균에 의해 유도 된 질병의 연구에 대 한 바람직한 대안입니다. 이 모델에서 '루프' 라는 장 세그먼트 병원 체는 혼자9 주입 될 수 있는 독립적이 고 밀폐 구획을 형성 하는 창 자를 따라 또는 백신 후보자 등 다른 분자와 연자를 배치 하 여 만들어집니다. 10 , 11. 관심의 병원 체 장 세포와 가까운 접촉에 배치 되 고 몇 시간 후 감염 시간, 장 샘플 추가 분석을 위해 재기 될 수 있다. 이 같은 동물에서 여러 치료 및 제어 그룹의 사용을 수 있습니다. 그룹 간의 차별의 힘을 증가 하 고 구강 재판에 비해 필요한 닭의 수를 감소, 반복된 측정 모델 통계 분석을 수행할 수 있습니다. 또한, 수술 절차와 후속 감염 시간 연속 전신 마 취 및 진통, 따라서 동물 고통 최소화에서 수행 됩니다. 폐쇄 루프 ligations 호스트 숫자를 줄이고 동물 연구에서 더 인간적 시스템을 만들기 위한 이상적인 서식 파일입니다.

장 합자 루프 모델 송아지, 토끼 및 쥐2,9, 등 다양 한 종에 잘 설명 되어 있지만 제대로 닭7에 설명 된. 이 수술 모델의 최적의 사용에 대 한 적절 한 기술과 실행 장 무결성에 손상을 피하기 위해 합자 장 루프의 창조를 위해 필수적입니다. 이 원고의 목표 치킨 모델에 여러 장 루프의 생성에서 단계 메서드를 설명 하는 것입니다. 이 기술은 정확한 절차는 프로젝트의 성공을 위해 필수적으로 외과 의사의 기술과 경험에 의해 제한 됩니다.

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프로토콜

라이브 동물 사용과 모든 절차의 학부의 수의학, 대학교 드 몬트리올 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 (CÉUA, '위원회 회의 d' éthique 드 데 동물 ').

1입니다. 수술 전 고려 사항

  1. 10 주 오래 된 수술에 대 한 특정 병원 체 자유롭게 (SPF) 레그 닭을 선택 합니다.
    참고: 자신의 체중 1.0과 1.2 k g 사이 여야 합니다.
  2. 피드를 빈 창 자 절차 이전 12 h를 철회 한다.
  3. 수술 전에 전신 마 취에 의해 확인 하는 프로토콜을 다음에서 닭을 놓습니다. Premedicate 각 치킨 midazolam의 근육 주사 (IM)으로 수술 하기 전에 15 분 1 mg/kg 및 butorphanol 4 mg/kg. 반복, 모든 4 h butorphanol 주사 4 mg/kg IM 또는 호흡 패턴 변화와 주파수 마 취 동안 증가 하는 경우. 전신 마 취에 대 한 모든 절차 동안, 1.5와 intratracheal 튜브 2.5% 농도에서 isoflurane를 관리 합니다.
    참고: 진정 및 진통에 대 한 premedication의 사용으로 그들은 것입니다 크게 마 취의 깊이 향상, 필요한 모든 절차 동안, 마 취약의 수량을 줄일 뿐 아니라 통증 수준을 제어 하는 연구원을 가능 하 게 좋습니다.
  4. 체온, 심장 박동 및 심전도 (ECG), 호흡 속도 리듬, 산소 포화, 만료 된 이산화탄소 (CO2)과 신경학 적 반사를 기록 하 여 마 취를 모니터링 합니다.
    참고: 모든 절차를 통해 이러한 매개 변수를 모니터링 하는 사람이 할당 되어야 합니다.
  5. 수술 절차를 통해 무 균 원칙을 따릅니다. 외과 의사와 보조 외과 의사 드레스 멸 균 가운, 장갑, 마스크와 보호 고글 기관 수술 프로토콜에 따라 확인 합니다. 외과 의사 손톱과 각 손가락 표면에 중점을 두고 팔꿈치까지 액체 gluconate 임신 살 균 브러시와 손을 스크럽 확인 합니다.
  6. 살 균 제와 수술 기구를 소독.

2. 외과 사이트 준비

  1. 첫째, 수동으로 부드러운 견인 복 부에서 깃털 제거 합니다.
  2. 브러시로 액체 gluconate 세제 임신 불 임 수술 사이트 스크럽. 부드럽게 센터에 다시 오는 없이 5 분의 총 접촉 시간에 대 한 밖으로 센터에서 피부를 문질러.
  3. 액체 gluconate 솔루션와 이소프로필 알코올 살 균 gauzes를 사용 하 여 외과 사이트에 3 다른 구절을 수행 합니다.
    참고: 통과 수술 사이트에 소독 되지 않은 지역에서 오염을 피하기 위하여 국경에 외과 사이트의 중간에서 시작 해야 합니다.
  4. 닭고기에 메 마른 외과 용 드 레이프를 놓습니다.

3. 복 부 구멍에서 작은 창 자를 추출

  1. 외과 용 드 레이프가 위로 외과 사이트의 피부 노출에 incise.
  2. 메스 칼 날 #3 ' L' 모양의 낮은 중간 절 개를 수행 하 여 피부를 incise.
    1. 첫 번째 절 개 흉 골에 꼬리 1 cm를 시작 하 고 마지막 1 cm는 cloaca 두개골에서.
    2. 첫 번째 절 개에 수직인 두 번째 절 개를 수행 합니다. 첫 번째 절 개의 꼬리 끝에서 시작 하 고 골반 라인을 따라 복 부의 왼쪽에 5 cm를 계속.
      참고:이 오프닝 플랩 내장의 쉽게 추출 수 있도록 만들어집니다.
  3. 수술이 위, 복 막 및 복 부 구멍을 열고 같은 'L' 모양 패턴으로 복 부 근육을 잘라.
    참고:이 공기 낭을 노출 합니다. 창 자는 이러한 구조 아래 있습니다. 공기 주 머 니 나 gauzes 건조와 절차를 통해 가능한 파열을 피하기 위해 멸 균 식 염 수 0.85% 포화와 습도 해야 합니다.
  4. 삽입 시 시 해 spay 왼쪽된 복 부 벽을 따라 복 부 구멍에 연결 하 고 복 부 공기 낭 주위에 방법을 작동.
  5. 부드럽게 내장 exteriorize와 수술 필드에 이것을 밖으로 확산.
    참고: 내장 자주 절차를 통해 메 마른 염 분 0.9%를 분사 하 여 습도 유지 합니다. 또한, 멸 균 식 염 수와 습도 gauzes 건조를 피하기 위해 창에 배치할 수 있습니다.
  6. 건조 멸 균 거 즈를 사용 하 여 내장을 공장 노출 수동 견인에 의해 작은 창 자 밖으로 조심 스럽게 잡아 당겨.
    참고: Mesenteric 선박 허약한이 고 과도 한 긴장 그들 장 허 혈 성 병 변으로 이어질 수 있습니다 그리고 절차의 결과 크게 손상 파열 될 수 있습니다.

4입니다. 장 루프의 제작

  1. 루프 제 1의 창조입니다.
    1. 장소는 polyglactin multifilament 합성 흡수 소재 주요 mesenteric 혈관의 합자를 피 함으로써 인접 공장에서 간단한 합자.
    2. 장소는 원심 합자 인접 합자에서 2 cm.
      참고: 간단한 합자 multifilament 봉합 사 물자로 만든 연금술 세그먼트를 만드는 창 자를 따라 배치 됩니다. 스키마 (그림 1) 모든 합자의 위치를 설명합니다. 인접 하 고 원심 합자 구분 2 cm 루프에 의하여 이루어져 있다.
  2. Interloop 제 1의 창조입니다.
    1. 장소는 간단한 합자 aborally 루프 no.1의 원심 합자를 0.5 c m.
      참고: 연속 루프, 사이 있다 interloops 1 cm, 즉 세그먼트는 루프 간의 물리적 분리를 만들기. 아마 다른 하나의 루프에서 교차 오염에의 가능한 위험 감소, 간단한 합자 interloop (0.5 cm 2 인접 루프의 원심 및 인접 합자)를 가운데 배치 됩니다. 이 인접 한 루프의 합자를 도달 하는 루프에서 가능한 유출 된 오염 물질의 위험을 줄일 수 있습니다. 이 세그먼트는 필수 되지 않습니다 하지만 교차 오염의 위험을 줄일 것 이다.
  3. 후속 루프와 interloops의 창조입니다.
    1. 4.1 및 4.2 원하는 루프의 수를 단계를 반복 합니다.
      참고:이 실험에서 9 루프와 8 interloops 창조 되었다. 총 길이 26 cm를 도달 했다. 연구에 따라 루프의 수를 조정할 수 있습니다.

5. 루프에 Clostridium perfringens 긴장의 주입

  1. 루프 1 호에 병원 체는 무 균 주사기와 바늘 26 G 주사. 부드럽게 45 ° 각도로 내장의 antimesenteric 쪽에 바늘을 삽입 합니다.
    참고:이 실험에서 0.2 mL의 두뇌 심 혼 주입 (BHI) 1 x 106 CFU (콜로 니 형성 단위) C. perfringens 의 중간 로그 성장 단계에 포함 된 각 루프에 주입 했다. 5 다른 긴장 5 다른 루프에 주입 했다 고 아무 박테리아 (살 균 BHI), 교대로 반복 되는 병원 균 살 균 BHI 루프를 포함 하는 부정적인 제어 루프를 남은 4 주입 했다.
  2. 5.1 모든 루프 삽입 단계를 반복 합니다.
  3. 부드럽게 공기 낭 아래 복 부 구멍의 지 면에서 장로 교체 합니다.

6입니다. 복 부 구멍의 폐쇄

  1. 복 막과 복 부 근육의 봉합입니다.
    1. Polyglactin multifilament 합성 흡수 소재를 사용 하 여 간단한 연속 봉합 패턴으로 복 막 및 복 부 근육 (단계 3.3에서에서 만든) 골반을 따라 봉합.
    2. 복 막과 흉 골에서 복 부 근육은 cloaca 봉합 (단계 3.3에서. polyglactin multifilament 합성 흡수 소재를 사용 하 여 간단한 연속 봉합 패턴으로.
  2. 피부 봉합입니다.
    1. polyglactin을 사용 하 여 multifilament 합성 재료와 간단한 연속 봉합 패턴 단계 3.2에서 골반을 따라 피부 절 개를 닫습니다.
    2. Using 동일한 multifilament 합자 재료와 간단한 연속 봉합 패턴, 3.2 단계에서 만든 cloaca 흉 골에서 피부 절 개를 닫습니다.

7입니다. 결론

  1. 수술 절차 후 감염 시간 동안 동물 통증을 최소화 하기 위해 진통제의 적절 한 사용과 일반 마 취에서 닭을 유지. 적절 한 마 취 수준 보장 하기 위해 마 취 모니터링을 계속 합니다.
  2. 원하는 감염 시간 후 전신 마 취하에 자 궁 경부 전위에 의해 닭 고통 없이 안락사.
    참고:이 절차에 대 한 C. perfringens 병원 성 긴장으로 미세한 병 변의 유도 하기 위해 필요한 시간 7 h 했다.
  3. 메스 블레이드 #3, 0.5 cm 1 cm 긴 루프 섹션을 잘라내어 10% 포 르 말린 고정 숙박 및 추가 histopathological 분석에.
  4. 같은 메스 칼 날 나머지 루프 섹션을 잘라내어 그들의 유전 특성에 대 한 각 루프 추가 bacteriologic 분석에서 C. perfringens 종자의 격리에 대 한 살 균 microcentrifuge 튜브에.
  5. 모든 루프 사이 메스 블레이드를 변경 하 여 모든 루프에 대 한 단계 7.2와 7.3 단계를 반복 합니다.

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결과

9 장 루프와 8 interloops의 회로도 그림 1에 표시 됩니다. 이 모델에서는 총 9 루프와 8 interloops 간단한 합자 함께 만들어집니다. 2cm 근 합자에서 측정에 의해 인접 하 고 원심 합자 루프에 의하여 이루어져 있다. 두 개의 인접 한 루프는 1 cm의 interloop으로 구분 됩니다. 루프는 합자에서 누설에 의해 사이 상호 오염을의 가능한 위험을 감소, interloop 합자 원심 합자를 2 인접 루프의 인접 합자 중간 방식으로 배치 됩니다. 연구의 요구 사항에 따라 루프의 수를 조정할 수 있습니다.

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그림 1: 합자 장 루...

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토론

Clostridium perfringens Clostridium 남과 어울리지 않 는, 등 다양 한 장 병원 체로 인 한 질병의 병 인 호스트 병원 체 상호 작용을 공부 하 고 수많은 종에 창 자 루프 모델 설명 되었습니다. 살 모 넬 라 enterica7,,913,,1415. 그것은 또한 점 막 면역 응답16, 장 병원 체11 배설 세균성 독 소를 중화 하 고10 장 질병을 방지 하기 위해 백신 후보자를 평가 하는 항 체의 효능을 분석 하 사용 되었다 . 그러나, ...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 작품 대학교 드 몬트리올의 수의학의 학부에서 가금류 연구 (M. Boulianne)에 자에 의해 지원 되었다. 박사 Boulianne 및 부모 모델 개발. 박사 Boulianne 및 부모는 수술을 수행. 박사 화상 마 취 프로토콜을 개발에 도움. 박사 부모 비디오를 편집 하 고 원고를 썼다. Drs 번즈, 원고를 편집 하는 Desrochers 및 Boulianne.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
EZ-Scrub 747Becton Dickinson and Company4% 클로르헥시딘 글루코네이트 세제 함침 멸균 브러시. 사용 가능한 카탈로그 번호가 없습니다. 웹 주소: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/infection-prevention/surgical-hand-scrubs/ez-scrub-preoperative-surgical-scrub-brushes 
이소프로필 알코올 70% USP 4 L상업용 이소프로필 알코올P016IP70웹 주소: http://www.comalc.com/products/
ChlorexidineSigma-Aldrich282227-1G클로르헥시딘 글루코네이트 용액은 4%로 희석해야 합니다. 웹 주소: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/282227?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQ
obChMI8vHr4_OY1wIV3rrACh2Z
WQKuEAAYAiAAEgLKx_D_BwE
수술용 드레이프 스몰 (27 인치 x 24 인치) with 3 x 6 inch 창호수의학 전문 제품32724웹 주소: http://www.vetspecialtyproducts.com/index.cfm?fuseaction=ecommercecatalog.
detail&productgroup_id=15
메스 블레이드 #3Swann-Morton301웹 주소: https://www.swann-morton.com/product/16.php
멸균 식염수 NaCl 0.9%Sigma-AldrichS8776-100ML웹 주소: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8776?lang=fr®ion=CA
Vicryl 3-0EthiconD9003Polyglactin 다중 필라멘트 흡수성 봉합사 재료. 웹 주소: http://www.ethicon.com/healthcare-professionals/products/wound-closure/absorbable-sutures/coated-vicryl-polyglactin-910-suture
주사기 1ml(26G 바늘포함) Becton Dickinson and Company329652웹 주소: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/diabetes-care/insulin-syringes/bd-1-ml-conventional-insulin-syringes
Brain Heart InfusionSigma-Aldrich1104930500웹 주소: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/110493?lang=fr®ion=CA&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xorders-_-prodRecCold2-1
Eppendorf tubeSigma-AldrichT9661-500EA마이크로 원심분리기 튜브. 웹 주소 : http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9661?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQ
obChMI-YizzfiY1wIVRkCGCh
30SQjuEAAYAiAAEgLK5fD_BwE
포르말린 용액, 완충 중성, 10 %시그마 - 알드리치HT501128-4L비율 조직 : 1의 포르말린 : 적절한 고정을위한 10. 웹 주소: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht501128?lang=fr®ion=CA
Clostridium perfringens strainsUniversité de Montré al, Chaire en recherche avicoleN/A각 실험실에 특화되어 있으며, 해당 저자에게 요청 시 제공됩니다
.

참고문헌

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