통합 이미징 Cytometry Transcriptomic 변경된 Endocytic CD1d 매매 평가 하 프로 파일링

Summary

Cytometry 이미징 개인과 populational 수준에서 세포의 형태학 적 및 기능적 변경 감지 하는 이상적인 접근을 제공 합니다. 오염 물질에 노출 된 인간의 수지상 세포에 지질 항 원 프레 젠 테이 션에 대 한 방해 endocytic 기능 유전자 발현 및 단백질 매매의 형태학 데모의 프로 파일링 결합된 transcriptomic 시연 했다.

Abstract

Endocytic 단백질의 형태 및 기능 변경의 populational 분석은 이미지 캡처 populational 수준에서 단일 셀 수준 및 통계 이미지 분석에서의 수요로 인해 도전. 이 어려움을 극복 하기 위해 우리 사용 이미징 cytometry transcriptomic (RNA-seq)를 프로 파일링 관련 차별화 1 d 단백질 (CD1d)의 클러스터의 변경 된 subcellular 지역화가 결정을 인간에서 손상된 endocytic 유전자 발현과 닥터지 일반에 노출 된 수지상 세포 (DCs), 공기 오염 물질 benzo pyrene [a]. CD1d 셀 이미지 이미징 cytometry 점령의 수천에서 endocytic 마커 Lamp1 단백질의 colocalization 아이디어와 ImageJ 피지를 사용 하 여 분석 프로그램. CD1d에 게이팅 후 공동 스테인드 CD1d 및 Lamp1 단백질 많은 세포 이미지 시각화 했다⁺Lamp1⁺ Dc 아이디어를 사용 하 여. BaP 노출 했다 Mander의 계수 공동 지역화 된 강도를 테스트 하 고 플롯 thresholded scatterplots를 사용 하 여 입증 시 향상 된 CD1d 및 Lamp1 colocalization ImageJ 피지를 사용 하 여 공동 화 된 영역의 비율 기반으로 합니다. 우리의 데이터 오염 물질에 노출 된 인간의 transcriptomic 변경의 장애인된 기능 결과 지 원하는 단일 및 populational 세포 수준에서 단백질 colocalization를 측정 하는 유리 기 악 및 bioinformatic 접근 방식을 제공합니다 Dc입니다.

Introduction

프레 젠 테이 션 항 원 일반적으로 자주 조사 형태학 상 특성 및 phenotypic 항 원 제시 세포^{1,2,3의 프로 파일링을 사용 하 여, 세포내 단백질을 포함} . 이미징 및 형질 방법의 장점을 통합 하는 이미징 분석 플랫폼 단일 세포 및 인간 모 수석 세포 (DCs)에서 변경 된 단백질 colocalization를 보여 인구 수준에서 설명 합니다. 펩 티 드 항 원 프레 젠 테이 션에서 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (MHC) 종류 I 분자 활성화 기존의 CD8 바인딩과 그물에 짧은 펩 티 드 (8-10 잔류물)을 바인딩할⁺ T 세포, MHC 종류 II 분자 바인딩 상대적으로 더 오래 동안 기존의 CD4 활성화 endocytic 구획에 있는 펩 티 드 (~ 20 잔류물)⁺ T 세포^1,4. 반면, 지질 관련 T 세포 지질 항 원 endocytic 구획^5,6에 주로 로드와 CD1....

Protocol

이 연구에서 인간의 프로토콜 신시내티 대학교의 기관 검토 위원회에 의해 승인 했다 및 모든 방법을 관련 지침 및 규정에 따라 수행 했다. 건강 한 기증자 로부터 혈액 샘플은 신시내티 대학 의료 센터에서 Hoxworth 혈액 센터에서 얻은 했다.

1. Transcriptomic 오염 물질에 노출 된 인간 Monocyte 파생 된 Dc의 프로 파일링

1. BaP에 노출 된 Dc의 총 RNA 추출
   1. 인간의 Dc cytokines GM-CSF와 IL-4를 사용 하 여 차별화 하 고 BaP Dc 4 일¹³노출.
   2. BaP에 노출 된 Dc cytometry 표면 표현된 마커 (^-계보 HLA-DR⁺)에 따라 기존 DCs의 구성의 대부분을 사용 하 여 정렬 (CD11c⁺CD1c⁺)¹³. 일반적으로 10%를 포함 하는 문화 매체로 10000 Dc 정렬 FBS, Dc 600 g x 6 분, 4 ° C에서 원심 및 포부 1 mL 피 펫 팁을 사용 하 여 여는 상쾌한을 즉시 제거.
   3. 일단은 상쾌한 포부에 의해 제거, RNA 격리 킷 RNA 추출....

Results

질 성 오염 물질 BaP 변경 각 기증자 로부터 인간의 Dc. 인간의 monocyte 파생 된 Dc에서 endocytic 유전자 클러스터 (n = 3) BaP 함께 incubated 되었고 기존의 DCs, RNA 추출 및 분석용 transcriptomic 설명 된 대로 추가 사용에 대 한 정렬 . 유전자 발현의 정규화에 따라 BaP 노출, 비 노출 그룹 간의 변경된 유전자 차동 표현한 유전자의 기능 상관 관계에 따라 클러스터 했다. 우리는 Toppcluster 프로그램¹⁶ 관련 세포 경로 분석에 대 한 변경 된 유전자 목록을 입력 하 고 p 값 (그림 1B)의 틀린 발견 비율 (FDR) 보정을 사용 하 여 통계 시험을 수행. 지질 대사 및 endocytic 기능을 포함 하 여 몇 가지 주요 변경된 유전자 클러스터 BaP 노출 Dc에서 발견 됐다. 이 연구에서 .......

Discussion

변경 된 유전자 통로의 기능 확인 널리 영향 을된 유전자 발현 포함 여러 통로 개인과 populational 세포 활동을 통합 하는 데 어려움 때문에 도전적 이다. 우리는 특별히 테스트 CD1d endocytic 구획에 인신 매매를 이미징 cytometry 고용. Cytometry 이미징 셀의 populational 측정 및 여러 단백질의 subcellular colocalization의 개별 데모 통합 합니다. Confocal 현미경 검사 법은 이전 단백질 colocalization를 측정에 높은 해상도 제공 하 고 cytometry 다른 세포 인구에 대 한 포괄적인 형질을 제공할 수 있다. Confocal 현미경 검사 법 및 cytometry transcriptomic 변경의 기능 확인에 대 한 높은-프로 파일 방식으로 환경에 의해 단백질 colocalization 분석 하 허용 이미지 해상도 장점을 결합 cytometry 이미징 오염 물질입니다.

Populational 규모.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
전사체학	Illumina	HiSeq 2500 v4	Illumina HiSeq 시스템
ImagingStream X,	Millipore	100220	이미징, 유세포 분석,
mirVana miRNA 분리 키트	, Thermo Fisher		총 RNA 추출
, Agilent RNA 6000, Pico 키트	, Agilent		Total RNA QC 분석
, Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler	Thermo Fisher		PCR, 효소 반응
NEBNext Poly(A) mRNA 자기 분리 모듈	New England Biolab		PolyA RNA 정제
자동화 SMARTer Apollo 시스템	Takara		PolyA RNA 정제
NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina	New England Biolab		Library 준비
Agencourt AMPure XP 자석 구슬	Beckman Coulter		DNA 정제
2100 Bioanalyzer	Agilent		Library QC, 크기 분포 분석
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent		Library QC, 크기 분포 분석
QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher)	Thermo Fisher		Library 정량화
NEBNext Library Quant Kit	New England Biolab		Library 정량
분석cBot	Illumina		라이브러리 클러스터 생성
TruSeq SR 클러스터 키트 v3 - cBot – HS	Illumina		Library 클러스터 생성
HiSeq 1000	Illumina		염기서열분석
TruSeq SBS Kit v3 - HS (50-cycles)	Illumina		염기서열
Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7)	Bio Legend	L243
Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5)	Bio Legend	3.9
Brilliant violet 421	Bio 레전드	L161
PE-안티 마우스 IgG2b	바이오 레전드	51.1
알렉사 플루어 647 (AF647)	바이오 레전드	CD107a(H4A3)