평가 의해 유도 된 Exon 포함의 결합 스위칭 센스 Oligonucleotides SMA 환자의 섬유 아 세포에서

요약

다양 한 센스 oligonucleotides (AONs) exon 포함 (스플라이스 변조) 유도 및 SMN 식 척수 근육 위축 증 (SMA)에 대 한 구조를 보였다. 여기, 우리는 SMN2 유전자와 SMA 환자의 섬유 아 세포에서 효능을 결정 하는 평가 방법에 exon 포함 유도 하 이온 lipotransfection에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

초록

척수 근육 위축 증 (SMA), SMN1의 손실에 의해 발생 하는 치명적인 신경 질환 선물 센스 oligonucleotide (이온)의 분야에서 독특한 케이스-치료 중재. SMN1 돌연변이 질병에 대 한 책임, AONs SMN2에 intronic 스플라이스 소음 (ISS) 사이트를 대상으로 FDA 승인 nusinersen를 포함 하 여 보였다 SMN 식 복원 하 고 증상을 개선 하. 현재, SMA를 위한 이온 치료를 포함 하는 많은 연구 조사 SMN2 nusinersen 보다 더 효과적이 고 덜 독성 수 있는 대상으로 하는 소설 이온 화학에 초점. 여기, 우리는 exon 포함 AONs 반전 녹음 방송 연쇄 반응 (RT-PCR), 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량), 및 서쪽에 게 더 럽 히기의 lipotransfection를 사용 하 여 체 외에서 평가 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 메서드는 다양 한 이온 화학에 대 한 사용할 수 있습니다. 우리 AONs 번갈아 잠긴된 핵 산 (Lna)의 구성 및 DNA 뉴클레오티드 (LNA/DNA mixmers) 효율적인 SMN2 exon 포함 및 매우 낮은 농도, 그리고 그러므로, LNA에서 SMN 단백질의 복원으로 이어질 입증이 메서드를 사용 하 여 / DNA mixmer 기반 센스 oligonucleotides 유전자 질병으로 인 한 접합 결함을 치료 하는 매력적인 치료 전략을 수 있습니다. 생체 외에서 평가 여기 설명 된 방법은 빠르고, 쉽고, 충분히 다양 한 소설 AONs의 테스트에 대 한 민감한입니다.

서론

척수 근육 위축 증 (SMA) 상 염색체 열성 패턴에서 상속 치명적인 신경 근육 학 질환 이다. 그것은 모터 신경 및 진보적인 간선 및 사지 근육 마비^1,2의 저하에 의해 특징입니다. SMA 발생의 대부분은 생존 모터 신경 1 (SMN1) 유전자³에서 homozygous 돌연변이 때문. 2 모터 뉴런의 생존 (SMN2) 유전자 SMN1의 역 중복 이며 단지 5 개의 기지^4,5다른 거의 동일한 시퀀스 있다. Exon 7에에서 있는 SMN2 에서 C-T 전환 돌연변이 리드 필수 exon 7 SMN2 증명서 (그림 1a)의 거의 90%에서 제외 되 고 하기 때문에 유전자를 거의 작동으로 만든다. 단백질 제품의 불안정 하 고 급속 하 게 저하 하기 때문에 SMN2 mRNAs exon 7 누락 SMN1 함수에 대 한 보상 수 ....

프로토콜

1. 세포 배양

1. 37 ° c.에 CO₂ 배양 기에 성장 매체 (Dulbecco의 수정이 글 중간 1: 【-12 (햄) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 및 0.5% 페니실린/스)에서 문화 SMA 환자의 섬유 아 세포
2. 자동된 셀 카운터를 사용 하 여 셀 농도 결정 하 고 세포에서 성장 매체, 다음 적절 한 판에 씨앗 1 x 10⁵ 셀/mL를 희석. RT-PCR 또는 정량에 대 한 12-잘 접시 (우물 당 1 mL)을 사용 합니다.
3. 37 ° c.에 CO₂ 배양 기에서 24 h에 대 한 번호판을 품 어

2. LNA/DNA mixmer transfection

1. 최적의 transfection 효율 약 65-80%의 셀 confluency를 확인 하십시오.
2. 10 μ M LNA/DNA mixmers 얼음에 천천히 녹여
3. 1.5 mL 튜브에 최종 볼륨 도달 50 μ 혈 청을 박탈 미디어는 mixmers를 추가 하 여 20 x mixmer 솔루션을 준비 합니다.
4. Mixmer 솔루션 50 μ 3 %transfection 시 약 (1:1 비율)를 포함 하는 혈 청을 박....

결과

우리 7 8 다른 센스 LNA/DNA mixmers 5 nM 농도 (그림 3)에서 페 했다를 가진 SMN2 유전자의 intron에서 ISS N1 소음 지역 대상 SMA 환자의 섬유 아 세포를 사용 하 여. mixmers의 각 포함 수정된 phosphorothioated 백본 nuclease 저하를 저항 하는 그들을 활성화. Mixmers, SMN2 exon의 속도의 효능을 평가 하기 위해 7 포함 RT-PCR 및 SMN2에 뇌관을 사용 하 여 정량 정량 했다. Exon transfection 동일한 복용량에서 mixmers #6-8을 이용 하는 동안 mixmers 환자 세포 (그림 4a, b)에 #1-5와 페 때 78-98%에서 배열 했다 7의 포함 효율에 비해 상당한 차이 발생 하지 않.......

토론

생체 외에서 평가 여기 설명 된 방법은 빠르고, 쉽고, 충분히 다양 한 AONs의 테스트에 대 한 민감한입니다. 이 프로토콜은 엑손 스키 핑 및 다른 유전자와 다양 한 셀 형식에 널리 적용 됩니다. 또한, 대부분 이온 화학 (PMOs)를 제외 하 고이 메서드를 사용 하 여 페 수 있습니다. AONs 타겟된 유전자를 운반 하는 플라스 미드 벡터와 공동 transfected 수 그리고 사전-mRNA에서 생 하 고 인위적으로 도입 유전자의 접합 하는 것을 통제할 수 있다.

이 방법의 중요 한 단계는 셀 confluency 해야 약 65-80% AONs fibroblasts에 페는 때입니다. 이 조건은 다른 세포 유형 대 한 수 있습니다. Transfection에 대 한 최고의 AONs 농도 다른도 수 (0.5-100 nM), 대상된 시퀀스 및 셀 형식에 따라 다릅니다.

이 방법은 잠재적인 함정 없이 아니다. 예를 들어 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
SMA 섬유아세포	Coriell NIGMS 인간 유전자 세포 저장소	GM03813
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher	11320033
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F1051
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher	15140122
Trypsin-EDTA (0.05%), 페놀 레드	Thermo Fisher	25300062
혈청 결핍 매체	Thermo Fisher	31985070
Transfection 시약	Thermo Fisher	15338100
guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (TRIzol)	Thermo Fisher	15596-018
RT-PCR Primers			Sequence 5' to 3'SMN2
forward:			CTGCCTCCATTTCCTTCTG
SMN2 반전:			TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC
GAPDH 포워드:			TCCCTGAGCTGAACGGGAAG
GAPDH 리버스:			GGAGGAGTTTGGTCGCTGT
qPCR 프라이머
전체 길이 SMN2 앞으로:			GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT
전체 길이 SMN2 반전:			CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT
GAPDH 포워드:			GCAAATTCCATGGCACCGT
GAPDH 반전:			AGGGATCTCGCTCCTGGAA
클로로포름	시그마-알드리치	P3803
글리코겐, RNA 등급	Thermo Fisher	R0551
ImageJ 소프트웨어
프로테아제 칵테일 억제제	Roche	11836153001
음극 버퍼			0.025 M 트리스 베이스 + 40  mM 6-aminocaproic acid + 20% 메탄올
양극 버퍼			0.03 M Tris 베이스 + 20% 메탄올
중심 양극 버퍼			0.3 M Tris 베이스 + 20% 메탄올
베타 메르캅토에탄올	Millipore	ES-007-E
PVDF 멤브레인	GE	10600021
웨스턴 블로팅용 로딩/샘플 버퍼	NuPage Invitrogen	NP007
원스텝 RT-PCR 키트	키아겐	210210
dNTP	클론텍	3040