모터 축 삭 탐색 및 빛 시트 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 마우스 배아에서 축 삭 Arborization의 정량화의 시각화

Summary

여기, 우리가 모터 뉴런 프로젝션과 유전자 변형 Hb9::GFP 마우스 배아에서 축 삭 arborization 시각화에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 모터 뉴런에 대 한 immunostaining, 후 우리는 후속 정량 분석에 대 한 이미지 배아를 빛 시트 형광 현미경 검사 법 사용. 이 프로토콜은 중앙 신경 조직에 있는 다른 신경 탐색 프로세스에 적용 됩니다.

Abstract

척추 모터 신경 (MNs) 확장 운동과 척추 동물에서 복잡 한 작업을 제어 함으로써 그들의 innervating 목표와 의사 소통을 그들의 축 삭. 따라서, 어떻게 모터 축 삭으로 이동, arborize, 그리고 그들의 주변 근육을 자극을 개발 및 변성 동안 대상의 분자 메커니즘을 밝히기 위해서 중요 하다. 축 삭 터미널 arborization의 전체 스펙트럼에 대 한 자세한 설명은 남아 패턴 복잡성 때문에 불완전 한 유전자 변형 Hb9::GFP 마우스 라인 모터 축 삭 궤도 배아 개발 하는 동안 시각화를 오래 해 왔으나, 비록 고 현재 광학 현미경 검사 법의 제한입니다. 여기, 우리는 빛 시트 형광 현미경 검사 법 (LSFM) 및 질적 및 양적 시각화 모터 축 삭을 개발 하기 위해 강력한 이미지 분석을 결합 하 여 향상 된 프로토콜을 설명 합니다. 이 시스템은 교차 하는 유전 돌연변이 또는 Hb9::GFP 라인, 모터 축 삭 탐색 및 arborization 결함으로 이어질 새로운 분자 메커니즘을 드러내는 미네소타 질병 모델에 쉽게 채택 될 수 있습니다.

Introduction

중앙 신경의 일부인 척수 MNs 하지만 이동을 컨트롤 하기 위해 주변 근육을 자극. 개발 척수에서 미네소타 창시자 (pMNs) notochord 그리고 인접 한 somites에서 나오는 신호에 따라 설정 됩니다. 모든 포스트 mitotic MNs 분화 다음 pMNs, 결국 척수^1,2의 rostrocaudal 축 미네소타의 일련에 기한에서 생성 됩니다. 척추 MNs 지형학과 해부학 잘 구성 되어 있습니다. 그들의 형태학 배열 주변³에 그들의 각각 대상의 위치와 상관 한다. 그들의 근육 목표에 도달, axons 수신 확장 하 고 분기 하도록 유도 하는 세포와 외 인 neurotrophic 요인 근육으로. 신경 분포 및 분기 결함 neuromuscular 접속점 (NMJ)를 형성 하는 실패에 기여할 수 있습니다. 예를 들어 폐해 파생 된 neurotrophic 요인 (GDNF)-유도 Pea3은 축 삭 arborization 피부 막시무스 (CM)에 대 한 필수 및 latissimus dorsi (LD) 근육^4,5. 또한, 식사 녹아웃 마우스 배아 탄생^6,7직후 호흡 실패 및 사망률을 일으키는 횡 경 막에 인할지 신경의 결함 arborization를 표시 합니다. 따라서, 미네소타 성숙 (즉, axonal 프로젝션 및 분기)의이 마지막 단계가 신경 세포와 대상 세포 간의 통신을 보장 하기 위해 중요 합니다.

Arborization 패턴을 보려면, 연구자는 일반적으로 confocal 영상 또는 sectioned 또는 전체 마운트 샘플^8,,910의 2 광자 형광 가벼운 현미경 검사 법 실시. 현미경 검사 법 기술을 둘 다 생성 허용 해상도 깊이 침투 합니다. 2-광자 형광 가벼운 현미경 검사 법¹¹두 낮은 에너지 광자 동시 흡수 fluorophores의 흥분을 포함 한다. 두 광자 여기 근처-적외선 방사선을 사용 하 여, 이후 감소 여기 주파수 감소 산란 및 1 m m 더 큰 깊이 가진 이미징 되므로 조직에서에서 더 나은 조직 침투에 기여 한다. Confocal 현미경 검사 법 제거 필터 초점 아웃 신호 및만¹²초점 비행기 내에서 빛을 수집 합니다. 이 방식으로 Z-스택 기능을 통해 3 차원 (3D) 이미지를 생성 하 다른 초점 비행기에서 샘플의 이미지를 결합 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 신호 강도 빛의 대부분을 차단 하 고 높은 수치 apertures 모호한 필드의 깊이 감소 된다. 더 중요 한 것은, 두 기법 때문에 하나의 비행기는 주어진된 시간에 촬영 하는 경우에 전체 표본 조명 받는 심각한 photodamage 및 phototoxicity에 기여 한다.

이러한 단점을 우회 되 고 빠른, 빛 효율의 장점을 선호 대안 및 더 적은 phototoxic^13,14LSFM 되고있다. 또한, LSFM 분할 영상이 있습니다. 이 방식은 모터 축 삭 및 그들의 분산 터미널을 시각화 하는 그들은 3D 공간을 통해 확산에 특히 적합 합니다. LSFM 샘플 수직 축과 x, y 및 z 축을 따라 움직임 회전을 허용 하는 단계에 탑재 되어 있기 때문에 다른 두 가지 옵션을 능가. 이 설정 뿐만 아니라 둘 다 요구 플랫 슬라이드 샘플 장착 샘플의 최소 차단된 보기 뿐만 아니라 바람직한 조명 경로, 2 광자 고 confocal 현미경 검사 법의 단점에 대 한 선택 수 있습니다. 따라서, LSFM는 마우스 배아에 있는 모터 신경 맨끝의 정량화 및 축 삭 arborization의 3D 영상에 대 한 가장 적합 한 도구입니다.

Protocol

모든 살아있는 동물의 특정 병원 체 자유롭게 (SPF) 동물 시설, 승인 및 학계 Sinica IACUC에 의해 감독에 유지 했다.

1입니다. 고정

1. 배아 하루 12.5 (E12.5)의 배아를 수집 다음 목을 벨 하 고 그들 내장을 들어낸.
2. 수정 배아 개별적으로 24-잘 접시에 1 mL/갓된 4 %paraformaldehyde 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1에서의 하룻밤. 통에 4 ° C에서 품 어.
3. 1 x PBS의 1 mL와 함께 x, 5-10 분, 각각 고정된 배아 적어도 3를 세척 하 고 잔여 paraformaldehyde 제거를 통에 4 ° C에서 밤새 품 어.

2. 전체-마운트 Immunostaining

1. 0.5%의 1 mL에 각 배아를 permeabilize PBS-트리톤-X-100 (PBST) 통에 4 ° C에서 하룻밤.
2. 10 %FBS 통에 4 ° C에서 하룻밤 1 x PBS에 준비의 1 mL와 함께 각 샘플을 차단 합니다.
3. 안티-GFP 1 차적인 항 체의 1 mL와 함께 태아를 품 어 (1:1, 000 희석 10 %FBS에서) 모터 신경의 GFP 신호 강화로 지속적인 떨고 72 h 4 ° C에서.
4. 1 차적인 항 체 외피 후에 0.5%의 1 mL로 씻어 0.5%를 변경 하는 한 통에 4 ° C에서 1-2 일에 걸쳐 PBST PBST 적어도 세 번.
5. 이차 항 체의 1 mL를 적용 (1:1, 000 희석 10 %FBS에서) 및 일정 한 동요와 4 ° C에서 어둠 속에서 밤새 품 어.
6. 씻어 0.5%의 1 mL와 함께 3 x 2-3 일에 걸쳐 통에 4 ° C에서 PBST. 이미징 전날까지 4 ° C에서 1 x PBS에서 샘플 계속.
   참고: 배아는 개간, 배아의 일부 것입니다 몇 군데 따라 하기 전에 작은 세그먼트로 해 부 될 수 있다. 앞 발이 실험 방법 (그림 1A)에서 유지 됩니다.
7. 이미징에 대 한 투명 한 태아를 렌더링 하룻밤 실 온에서 빛에서 보호 1.5 mL 튜브에 1.49의 굴절률을 가진 상업적인 청소 시에 태아를 품 어.
   참고: 개간 시 약의 볼륨은 약 5 배 샘플 볼륨의.

3. LSFM (2-3 h)

1. 샘플 설정
   1. 5 X / 0.1 설정 조명 광학 및 5 X / 0.16 감지 광학. 샘플 홀더 및 샘플 모 세관 (1.5 m m 내부 직경, 녹색)를 조립 하십시오 하 고 현미경으로 그들을 배치.
      참고: 자세한 설정 절차에 대 한 현미경의 운영 설명서를 참조 하십시오.
   2. 다음과 같이 태아를 탑재.
      1. 그것은 모 세관의 직경에 맞도록 위쪽 부분을 멀리 절단 하 여 P200 피 펫 팁을 준비 하 고 뾰족한 부분을 제거 (~ 3 mm) 샘플 첨부 파일에 대 한.
      2. 작은 불꽃을 사용 하 여 피 펫 팁의 무딘된 끝을 녹여.
      3. 불꽃을 소화 하 고 신속 하 게 녹 인된 끝에 수직으로 태아를 연결 합니다.
      4. 샘플 모 세관 피 펫 팁의 위쪽 부분에 맞게.
   3. Equilibrate 파편 또는 거품을 1 분 동안 태아와 챔버 버퍼를 수 있습니다.
   4. 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 찾기 탭 아래 모 세관 찾기 를 선택 하 고 x, y, z 축 샘플 모 세관의 위치 조정.
   5. 찾기 샘플 을 선택 하 고 0.6 X 배아에 초점을 확대. 군데 사지의 긴 축 (그림 1B) 두 광원의 빛 경로와 정렬 있도록 배아를 회전 합니다.
2. 이미지 수집
   1. 인수 탭 검출 목적 등 가벼운 경로 매개 변수 정의 차단 필터, 빔 스플리터, 카메라 및 레이저 레이저.
      참고: GFP 채널은이 실험에 사용 (여기 파장: 488 nm; 방출 필터: BP 505 545 nm, 빔 스플리터: SPS LP 560).
   2. 그림자 감소의 피벗 스캔 확인란을 확인 하십시오.
   3. 수집 설정을 정의: 비트 수준, 16 비트; 확대/축소, 0.36-0.7 X; 단일 측면 조명 (왼쪽/오른쪽) 또는 듀얼 사이드 조명.
   4. 연속 을 클릭 하 고 선명한 이미지 레이저 강도, 노출 시간, 레이저 전력 및 빛 시트 위치를 설정 합니다.
      참고: 레이저 전원 photodamage 최소화 하기 위해 가능한 한 낮은 유지 됩니다.
   5. 이미지 수집 끝에 중지 를 누릅니다.
3. 다차원 수집
   1. 첫 번째 및 마지막 이미지에 대 한 Z 위치를 이동 하 여 z-스택을 정의 합니다. 최적 조각 수 설정을 클릭 합니다.
   2. 선택한 z-스택 얻으려고 실험 시작 을 클릭 합니다.
   3. 완료 되 면.czi 형태로 이미지를 저장 합니다.
4. 이미지 처리 (선택 사항)
   1. 듀얼 사이드 조명을 적용 하는 경우 처리 하는 Lightsheet 채널에서 듀얼 사이드 퓨전 으로 진행 합니다. Multiview 처리 하는 것은 멀티 플레이 여러 각도에서 이미지를 결합 하 여 취득 하는 경우에 필요 합니다.
   2. 최대 강도 투영 채널에서 투영 축 따라 최고 강도 픽셀에서 데이터를 사용 하 여 2D 이미지를 만듭니다.
   3. 복사 채널에서 원래 집합에서 이미지의 하위 집합을 선택 하려면 하위 집합 을 클릭 합니다.

4. 축 삭 Arborization (30 분 각 개별 신경에 대 한)의 정량화

1. 영상 분석 소프트웨어에서 이미지 파일을 열고 (기본적으로 XYZ 데이터를 포함 하는 이미지 오픈 Surpass 모드에서 3D 렌더링 보기).
2. 이미지 색상, 밝기, 조정 하 고 디스플레이 조정 창을 사용 하 여 대조 (편집 | 디스플레이 조정 표시) 로컬 강도 대비에 따라 필 라 멘 트 감지 하.
3. 추가 새 필 라 멘 트 아이콘을 클릭 하 고 드롭-다운 메뉴에서 Autopath (루프) 알고리즘을 선택 합니다.
4. (이 경우 관심의 분단 축 삭)에 관심 영역을 선택 합니다. 다음 완료를 클릭 합니다.
5. 분할 모드를 사용 하 여 측정 될 수 있는 크고 얇은 직경 측정을 할당 하 여 시작 및 씨앗 포인트를 정의 합니다.
6. 관심 영역의 가장자리에 시작점을 지정 합니다. 수동으로 추가 또는 제거 시작 지점에 달성 하기 위해, 먼저 포인터 모드 변경 (탐색 | 선택) 및 다음 shift 키를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 관심의 포인트에.
7. 보이는 arborization의 모든 표시 되도록 씨 포인트에 대 한 수동 임계값을 선택 합니다. 포인터 모드 변경 (탐색 | 선택) 다음 Shift + 왼쪽 클릭 관심의 포인트에 수동으로 추가 하거나 씨앗 포인트를 제거 하 고.
   참고: 그것은 이웃 신경에서 배경 소음 및 신호를 수동으로 제거 하는 것이 중요입니다.
8. 확인란 시작 지점 주변 씨앗 포인트를 제거합니다.
9. 포인트는 너무 멀리 떨어져 있으며 배경 잡음을 나타내는 수 있습니다의 배제를 허용 하도록 제거 분리 세그먼트를 확인 합니다. 제외에 대 한 상한값을 정의 하는 다음 단계에서 최대 간격 길이 나타냅니다.
10. 모든 복의 배경 강도 추정 하는 가우스 필터를 사용 하 여 배경 빼기에 대 한 임계값을 조정 합니다.
11. 대략적인 횡단면 영역 알고리즘을 사용 하 여 모 수석 직경에 대 한 자동 임계값을 설정 합니다.
12. 척추 계산에 대 한 단계는 건너뜁니다.
13. 프로세스를 완료 하 고 원하는 스타일과 색상을 선택 합니다.
14. 볼만 재건된 축 삭을 속성 에서 볼륨 상자 선택을 취소 합니다.
15. 통계 탭에서 자세히를 선택 합니다. 필 라 멘 트를 사용 하 여. 모 수석 터미널 포인트 모터 축 삭 arborization의 지표로 서 모터 신경 맨끝을 계량 하기.
    참고: 통계 주석을 추가할 수 있습니다 원하는 경우.
16. .Tif 파일로 복원된 축 삭의 이미지를 내보냅니다.

Results

LSFM 배아를 마우스에서 미네소타 궤도 및 축 삭 arborization의 상세한 3D 시각화를 제공합니다. 밝은 필드 아래에서 조직 상업 개간 시 약에 몰입 되 고 후 완전히 투명 하 게 나타납니다. 수축 또는 샘플의 붓기는 이미징 하기 전에 시 약을 지우기에 스토리지의 최대 1 주일 후 발견 되었다. 형광 채널에서 모터 뉴런 transgenically 표현된 GFP (영화 1)으로 표시 되어 있습니다. 일부 경우에, 축 삭 구조의 세부 정보는 손상 된다. 예를 들어 그림 2 낮은 품질 이미지를 나타냅니다. 여러 가지 요인이 이미징 품질을 방해 수 있습니다. 첫째, 부족 permeabilization 및 세척 단계 높은 배경 신호 발생할 수 있습니다. 둘째, 이미지를 흐려 inadequately 허가 조직을 통해 산란 발생 합니다. 마지막으로, 차선의 샘플 이미지 중 위치 수 산란 늘...

Discussion

프로토콜의 여러 단계 특정 상황에서 변화에 대상이 될 수 있습니다. 예를 들어 고정 기간의 2 h에서 1 이상의 일 갓 만든 paraformaldehyde를 사용 하 여 다양 한 태아의 나이에 따라 달라 집니다. 고정 단백질 가교에 민감한 항 체에 대 한 전체 마운트 immunostaining 이전 실시 이후 메탄올 대체 통 요원으로 사용할 수 있습니다. 얼룩에 높은 신호 대 잡음 비율, 그것은 세제 농도 최적화 하는 데 필요한 (사이 0.1-0.5%). 추가 세척 단계 전후에 항 체 외피 또한 신호 대 잡음 비율을 높일 수 있습니다. 또한, 조직 개간 단계는 빛 깊은 axonal 예측을 통해 차단 되는지 확인 해야 합니다. 조직의 투명성을 강화 하려면 개간 효과 다시 버퍼 솔루션에 샘플을 immersing에 의해 반전으로 상업 개간 에이전트에서 부 화 하는 동안 PBS의 최소한의 소개를 위해 중요 하다. 그렇지 않으면, 높은 굴절률 또는 장기간 개간으로 개간 시 약이 좋습니다. 한편, 이미지 수집 하는 동안 매개 변수는 다른 ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hb9 :: GFP	잭슨 연구소	005029	배아 일 12.5 (E12.5)
4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)			200ml의 경우 : ddH2O에 20ml 10X PBS, 8g PFA를 추가합니다. NaOH(10N)로 pH를 7.4로 조정합니다. 필터는 -20°C에서 살균 및 보관합니다.
인산염 완충액 식염수 10X(PBS 10X)			1L의 경우: NaCl 80g, KCl 2g, Na2HPO4 14.4g, KH2PO4 2.4g을 넣고 ddH2O를 보충합니다. 오토클레이브 및 RT에 보관하십시오.
Triton X-100	Sigma	X100-500ML
태아 소 혈청	ThermoFisher	26140079
Sheep polyclonal anti-GFP	AbD Serotec	4745-1051	1:1000
Alexa Fluor 488 당나귀 안티 양	Invitrogen	A-11015	1:1000
RapiClear 1.49 투명 시약	SunJin Lab	RC149001
1.5ml 마이크로 튜브	Sarstedt	72.690.001
24웰 플레이트	ThermoFisher	142475
5 SA 핀셋	ideal-tek	3480641
홍채 가위 선조체 날카롭고 날카로운	Aesculap	BC110R
미세 수술 메스, 일회용	Aesculap	BA365
해부 현미경	Nikon	SMZ800
Shaker	TKS	RS-01
Lightsheet Z.1 현미경	Carl Zeiss 현미경 Imaris
8.4.0 이미지 분석 소프트웨어	Bitplane, 취리히, 스위스
B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP 마우스)	잭슨 연구소	005029