녹음 및 Microelectrode 배열에 결합 하는 설치류 뇌 조각에 Epileptiform 활동의 변조

요약

우리는 microelectrode 배열을 사용 하는 설치류 뇌 조각에 4 aminopyridine 이용한 epileptiform 활동의 기록 및 전기 변조를 수행 하는 방법을 보여 줍니다. 사용자 지정 녹음 실 조직 생존 연장된 실험 세션에 걸쳐 유지합니다. 전극 매핑 라이브 고 자극 쌍의 선택 사용자 지정 그래픽 사용자 인터페이스에 의해 수행 됩니다.

초록

측 두 엽 간 질 (TLE)은 가장 일반적인 부분 복잡 한 간 질 증후군 및 약물 이상 반응. 깊은 두뇌 자극 (DBS) 때 유망한 접근 약물 치료 실패 또는 신경외과 권장 하지 않습니다. 급성 뇌 조각 microelectrode 배열 (MEAs)에 결합 된 전기 자극에 의해 신경 네트워크 상호 작용 및 그들의 변조를 공부 하는 유용한 도구를 나타냅니다. 기존의 세포 외 기록 하는 기술을, 비교 관찰 포인트와 알려진된 전극 간 거리, 전파 경로 속도 electrophysiological의 공부 수 있도록 더 많은 수의 추가 장점 제공 신호입니다. 그러나, 조직의 산소 MEA 기록, 감소 신호 대 잡음 비율 고 실험 온도에 높은 진동 오는 높은 관류 속도 요구 하는 동안에 크게 장애가 있을 수 있습니다. 전기 자극 더 장시간된 녹음/자극 신기를 추구 하 고 어려운 뇌 조직을 강조 한다. 또한, 뇌 조각 활동의 전기 변조 전극 매핑 쉽고 신속 하 게 수행 함을 라이브 실험 기간 동안 필요한 뇌 조각 내 특정 구조/경로 대상으로 해야 합니다. 여기, 우리는 4-aminopyridine (4AP)의 녹음 및 전기 변조를 수행 하는 방법을 설명-설치류 뇌 조각 사용 하 여 평면 MEAs에에서 epileptiform 활동을 유도. 우리 쥐에서 얻은 뇌 조직의 능가 쥐 뇌 조직 및 MEA 실험에 대 한 더 적합 따라서 보여줍니다. 이 프로토콜 생성 및 유지 보수의 안정적인 epileptiform 패턴을 충실 하 게 재현 기존의 필드 잠재적인 기록 관찰 electrophysiological 기능, 몇 시간 동안 지속 하 고 outlasts 지속 보장 장시간된 신 기원에 대 한 전기 자극입니다. 실험을 통해 조직 생존 관류 속도 층 류 및 낮은 (1 mL/min) 에서도 빠른 해결책 교환을 위한 수 있도록 작은 볼륨 사용자 지정 녹음 챔버의 사용 덕분에 이루어집니다. 실시간 모니터링 및 자극 전극의 선택에 대 한 빠른 MEA 매핑은 사용자 지정 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)에 의해 수행 됩니다.

서론

간 질은 뇌¹;의 통제 활동을 일으키는 생명이 진보적인 장애 그것은 질병 및 중요 한 사회적인 낙인^2,3의 가장 높은 부담 중 수행합니다. TLE은 가장 빈번한 증후군 (40%)와 가장 자주 (~ 30%)⁴항 간 질 약물 저항. Epileptogenic 직물의 외과 제거는 환자의 상태를 개량 수 있습니다, 그러나 그것은 모든 환자에서 가능 하지 않습니다 하 고 완전히 발작-무료 생활⁵하지 못할 수 있습니다. 전기 DBS에 의해 간 질 변 네트워크의 유망한 접근 때 약리 치료 또는 신경외과 적합 하지 않습니다.

그들은 보존, 적어도 부분, 원래 건축과 뇌의 연결 설치류 뇌 조각 전기 생리학 기술 시험관에 의해 건강과 질병⁶ 어떻게 신경 네트워크 기능을 공부 하는 유용한 도구는 관심 (ROI)의 지구. 특히, 수평 결합 된 해 마 entorhinal 외피 (해 마-EC) 조각 TLE에 관련 된 필수적인 신경 네트워크를 구성 하 고는 따라서 정기적으로 TLE 연구⁷ 체 외에서 .

발작 같은 활동 수 있습니다 심하게 유도 될 두뇌 조각에서 마그네슘 칼륨^8,,910, 증가 하면서 감소 하는 등 인조 척수 (실제)의 이온 구성을 변경 하 여 또는 금지 GABAergic 활동을 차단 하는 등 약리 조작에 의하여 (종합적인 검토에 대 한¹¹ 참조). 그러나, 이러한 모델 기반 흥분 및 억제;의 불균형된 변경 따라서, 그들은 상호 작용 및 흥분 성의 억제 네트워크 ictogenesis의 공동된 기여를 공부 하 고 허용 하지 않습니다. 뇌 조각 convulsant 마약 4AP로 지속적인 관류 강화 흥분 성의 억제 neurotransmission, 그대로 유지 하면서 시 냅 스 활동이 전반적으로 급성 ictogenesis 공부 하 되므로¹².

MEAs 기존의 extracellular 필드 잠재적인 녹음, 공간 제한 될 수 있는 전극의 수를 제한 하는 어디에 비교 하 여 관찰 포인트의 큰 숫자에서 신경 네트워크에 의해 생성 된 전기 활동을 기록 허용 뇌 조각 표면에 수용. 또한, MEA 칩 추적 전파를 매우 유용 하는 알려진된 전극 간 거리의 추가 된 이점을 제공 하 고 기록 된 신호의 이동 속도 평가. 처음 경작된 뉴런^13,14에서 기록에 대 한 잉태, 비록 MEAs 지금 또한 사용 된다 설치류¹⁵ 와 인간¹⁶에서 얻은 급성 뇌 조각의 electrophysiological 기능 하. 따라서, 간 질 연구의 맥락에서 MEAs ictogenesis^16,,1718의 핵심에 신경 네트워크의 상호 작용을 정확 하 게 유용한 도구를 나타냅니다.

그러나, MEA 녹음 본질적으로 오랫동안 (몇 시간) 실험 프로토콜에 걸쳐 안정적인 epileptiform 패턴을 유지 하거나 기술 과제를 수행 합니다. 첫째, 조직의 산소 하지 큰 내에서 적절 한 및 수 불 쌍 한 신호 대 잡음 비율 및 온도 불안정성에 영향을 하는 동안 침수 형 녹음 실^19,20 상용 MEAs의 전형적인 라운드 때 높은 관류 속도 (6-10 mL/min) 녹음의 품질 (난방 및 관류 장비²¹예 기술 노트를 참조) 뇌 조각에 산소 공급을 향상 하는 데 사용 됩니다. Epileptiform 방전 등의 높은 주파수 구성 요소를 갖춘 두 번째, 재발 성 방전은 거의 침수 형 녹음 실¹⁹;를 사용 하 여 관찰 이것은 특히 사건 때 급성 epileptiform 패턴 화학적으로 유도 된 ephaptic 메커니즘을 포함 4AP 모델²² 의 경우 처럼 (¹¹ 에 대 한 포괄적인 개요 참조). 이러한 한계를 극복 하기 위해 몇 가지 전략 연구원에 의해 제안 되었습니다. 예를 들어 조직에 적절 한 산소 공급을 달성 하는 데 중요 한 요소는 두뇌 슬라이스 두께 (≤300 µ M) 및 지역^17,18 줄이면서 관류 속도^19,20 증가. 또한, 향상 된 뇌 조각 생존 모두 양쪽¹⁸에서 뇌 조직 perfusing 수 있도록 천공된 MEAs (pMEAs)를 사용 하 여 또한 수행할 수 있습니다.

설명된 방법을 크게 두뇌 조각에서 MEA 녹음의 가능성 향상, 반면 그들은 테스트 되지 않았습니다에 대 한 연장 (몇 시간)는 후자를 나타내는 중요 한 기록 및 전기 자극 세션 뇌 조직에 대 한 스트레스입니다. 장시간된 녹음 세션 단기 측정에 의해 정체 수 없습니다 epileptiform 패턴의 특정 기능의 시간에 진화를 연구 하 필요할 수 있습니다. DBS 연구의 맥락에서 장기간된 실험 프로토콜 평가 하 고 동일한 뇌 조각에 여러 자극 패러다임의 효과 비교 하 여 필요할 수 있습니다.

필요가 있을 때만 자발적인 전기 활동 기록, 투자 수익에 관하여 전극의 매핑 일반적으로 이루어집니다 귀납적은, 즉, 데이터 분석; 중 대신, 갖는 응답 또는 전기 neuromodulation 패러다임의 연구는 실험 기간 동안 신속 하 고 쉽게 라이브 전극 매핑 필요 지시 된 특정 ROI(s)에 자극 전달는 필요 합니다.

여기, 우리는 유도 및 설치류 뇌 조각에 안정적인 4AP 유도 epileptiform 패턴의 유지 보수에 대 한 허용 하는 간단한 실험 프로토콜을 설명 합니다. 기존의 세포 외 전기 생리학 기술을 사용 하 여 특징 관찰된 활동 충실 하 게이 모델의 electrophysiological 기능을 재생산 한다. 그것은 몇 시간 동안 지속 되 고 반복된 장시간된 신 기원에 대 한 지속적인된 전기 자극을 outlasts. 유지 하 고 품 어 뇌 조각 하는 데 사용 하는 챔버 조립 될 수 있다 쉽게 표준 실험실 공급 (그림 1A)를 사용 하 여 있지만 최적 환율 및 층 류 흐름 (그림 1B)에 대 한 허용 하는 사용자 지정 녹음 실 상업적인 소스에서 얻을 수 또는 저렴 한 가격에 3D 인쇄 기술을 사용 하 여. 실시간 모니터링 및 자극 전극의 선택에 대 한 ROI(s)의 빠른 매핑 가능한 mapMEA, 요청에 따라 자유롭게 사용할 수 있는 명명 된 사용자 지정 사용자 친화적인 GUI에 의해 이루어집니다.

그림 1:이 프로토콜 사용 하는 사용자 정의 장비. (A) 복구, 미리 데우고는, 및 4AP 사전 보육에 대 한 실 비 커, 페 트리 접시를 사용 하 여 조립 하는 지주. 페 트리 접시 지름에서 보다 작아야 차단기 고 주사기 플런저에 의해 장소에서 개최 됩니다. 페 트리 접시의 바닥은 나일론 메쉬 (부드러운 스타킹)에서 페 트리 접시의 가장자리에 cyanoacrylate와 붙어으로 바뀝니다. 산소는 구부러진된 척추 바늘 (22 세대), 페 트리 접시의 벽과 비 커 사이 삽입을 통해 제공 됩니다. 거품 비 커와 결코 도달 뇌 조각 변위를 피하기 위해 나일론 메시의 측면에서 등장 한다. 페 트리 접시 위에 실제 증발을 방지 하 고 산소 포화를 유지 하는 뚜껑으로 사용할 수 있습니다. (B) 사용자 지정 녹화 챔버입니다. : 난방 정 및 참조 전극에 맞게 입구 저수지. 개: 흡입 바늘에 맞게 콘센트 저수지. rec: 녹화 챔버입니다. (C) 유리 파스퇴르 피 펫, 화재 연마 하 여 웅크리고 조직 처리 기록 챔버 내에서 위치를 조정 하는 데 사용. (D) 사용자 정의 슬라이스 고정 앵커. (E) 최종 조립 녹음 실의 MEA 칩에 장착. 뇌 조각 앵커에 의해 장소에서 개최 하는 하단에 달려있다. 빨간색 화살표는 반면 빨간색 원 참조 전극, 포화 KCl 펠 릿 실제 입구 저수지에 의해 잠긴 나타냅니다 난방 정 취재 PTFE 튜빙을 나타냅니다. 파란색 화살표는 콘센트 저수지에서 흡입 바늘을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드는 EU 지침 2010/63/EC 동물 복지에 준수 건강 (권한 부여 명. 860/2015-홍보)의 이탈리아 정부에 의해 승인 되었습니다 있다.

1. MEA/사용자 정의 챔버 어셈블리의 준비

참고: 시작 2 일 전에 실험. MEA는 반지 없이 사용 ( 자료 표참조).

1. 청소는 MEA (지속 시간: 35-40 분).
   1. 따뜻한 증류수로 enzymatic 청소기 분말을 디졸브. 따뜻한 표면에 MEA 솔루션을 청소 브러시 후 적어도 3 h에 대 한 솔루션을 청소 하는 따뜻한에는 MEA를 담가.
   2. MEA 증류수로 깨끗이 린스 하 고 보풀 없는 스크래치 조직을 사용 하 여 그것을 건조.
2. 녹음 챔버와 MEA 조립 (지속 시간: 10 분 + 하룻밤).
   1. 균등 하 게 확산 녹음 챔버의 하단 표면에 탄성 실 란 트. 아니 거품 있다 다는 것을 확인 하십시오.
   2. 족집게의 도움으로 MEA에 녹음 챔버 탑재 고 부드러운 압력을 적용 합니다. 어떤 거품 경우 약간 이동 챔버 원에서 모든 거품이 사라진 때까지 손가락으로 부드러운 압력을 적용 하는 동안. 줄곧 녹음 실의 외부 테두리 주위에 실 란 트 레이어를 확산.
      참고: 중요! 실 란 트와 나 연락처를 커버 하지 마십시오.
   3. MEA/챔버 어셈블리를 15 cm 배양 접시 안에 놓습니다. 페 트리 접시 5 mL 또는 10 mL 비 커는 MEA 가까이 증류수 가득합니다. 습 한 환경 유지 하기 위해 모든 것을 커버. 하룻밤 실 온에서 치료 하자.
      참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.
3. 친수성 수 있도록 MEA 코트 (기간: 5-10 분 + 하룻밤).
   1. 15 cm 배양 접시에는 MEA를 놓습니다. MEA 기록 영역에 폴 리-D-신의 50 µ L를 붓는 다. 페 트리 접시, 닫고, 영화, 씰링 함께 인감 4 ° c.에서 밤새 껏 저장
   2. MEA 증류수를 사용 하 여 철저 하 게 린스를 증류수에 4 ° C에서 나를 저장 합니다.
      참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 코팅된 MEAs 저장 하 고 몇 가지 실험에 대 한 다시 사용할 수 있습니다. 정기적으로 청소 하 고 다시는 MEA 코팅 조직 파편을 제거 하 고 신호 대 잡음 비율을 향상 시킬 수 있습니다.

2입니다. 재고 솔루션의 준비

참고: 실험 전에 1 일 시작 (기간: ~ 2 h). 재고 솔루션 가속화 실험 실험 하루에 도움이 됩니다. 그들은 사전에 준비 고 저장 될 수 있습니다. 농도 요인 및 구성에 대 한 표 1 을 참조 하십시오. 최종 솔루션의 구성 표 2 를 참조 하십시오.

1. 상 온에서 증류수에 화학 물질을 분해. 재고 솔루션 필터 병을 필터링 (필터 직경: 0.22 μ m).
2. 4 ° C에 저장 (권장 최대 저장 시간에 대 한 표 1 참조).
   참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.

3입니다. 한 천 준비

참고: 실험 전에 1 일 시작 (기간: ~ 1 h).

1. 500 mL 비 커에 증류수 250 mL를 붓고 하 고 350 rpm에서 교 반 시작. 한 천 5 g을 추가 하 고 완전히 해산 될 때까지 기다립니다.
2. 250-300 ° c.에 솔루션을 열 솔루션은 수익률 2.5 %w / v agar 솔루션 ~ 200 mL 때까지 증발 물 하자.
   참고: 온도 물 버블링 없이 증발 하도록 충분히 높은 해야 합니다.
3. ~1.5의 200 mL 플라스틱 사각형 상자에 agar 솔루션 cm 높은 벽을 부 어 하 고 열기가 식도록 실 온에서 고체 될 때까지.
4. 상자를 커버와 4 ° c.에 그것을 저장합니다 한 블록은 몇 주 동안 좋은.
   참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.

4입니다. 냉동된 면의 준비

참고: 실험 전에 1 일 시작 합니다.

1. 0.5-1 cm 가장자리 아래까지 증류수에 평면 하단 스테인리스 그릇 채워.
2. 하룻밤-20 ° C에서 저장 합니다.

5. 실제 절단 신경의 준비

참고: 시작 1 일전 실험 또는 실험의 같은 날 ( 표 1 및 표 2참조) (지속 시간: 30 분).

1. 500 mL 비 커에 증류수 200ml를 부 어 하 고 350 rpm는 자력을 사용 하 여 교 반 시작.
2. B 주식의 50 mL 및 50 mL 주식 C의 추가 ( 표 1참조).
3. 3mm pyruvic 산, 208 mM 자당, 10 m m D-포도 당, 1mm L-아 스 코르 빈 산을 추가.
   참고: 실제 볼륨 pyruvic 산의 밀도 순도에 따라 및 일괄 처리와 다를 수 있습니다. 새 일괄 처리를 열 때 항상 필요한 볼륨을 계산 합니다.
4. 씰링 필름 커버 그리고 30 분 동안 저 어.
5. 500 mL 부피 플라스 크에 솔루션을 전송 하 고 플라스 크를 채우기 위해 증류수를 추가 합니다.
6. 씰링 영화와 부피 플라스 크를 밀봉 하 고 부드럽게 반전 3-5 번까지 솔루션은 균등 하 게 분명 하다.
7. 모자와 유리 병에 실제 절단을 전송 합니다.
8. 4 ° c.까지 냉각 절단 실제 또는 20-30 분-80 ° C에서 4 ° C에서 하룻밤을 저장합니다
   참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기 경우 하룻밤 냉각 하는 것이 좋습니다. 그렇지 않으면 시간 마찬가지임 절단 실제 냉각 단계 6 추구 하 사용할 수 있습니다.

6. 준비 개최의 실제

참고: 실험 당일 솔루션 신선한 준비 (기간: 5-10 분). 실제 린스 조각화 절차 동안 실제 절단에서 뇌 조각 하는 데 사용할 것입니다 지주 (단계 8.16 참조)과 뇌 조각 장기 저장과 미리 온난화에 대 한. 두뇌 분할 영역을 씻어, 하 실제의 100 mL은 충분 합니다. 이 프로토콜에 사용 되는 보유 하 고 전 지구 온난화 실 주문 품 이며 300 mL 및 100 mL의 볼륨을 각각 포함 (cf. 그림 1A). 이 설정을 사용 하 여 실제의 500 mL 는 충분 합니다. 상업적인 소스에서 얻은 실 있는 경우 준비를 실제의 전체 양을 적절 하 게 조정 되어야 한다 다른 볼륨을 포함할 수 있습니다.

1. 500 mL 부피 플라스 크에 증류수 200ml를 부 어.
2. A 주식의 50 mL, B 주식의 50 mL, M, 주식의 6.5 mL 및 1 m m L-아 스 코르 빈 산을 추가 합니다. 부드럽게 회전 움직임을 사용 하 여 L-아 스 코르 빈 산 완전히 해산 될 때까지 교 반 하십시오.
3. 마지막 볼륨에 도달, 영화, 씰링으로 부피 측정 플라스 크를 밀봉에 증류수를 추가 하 고 부드럽게 반전 3-5 번까지 솔루션은 균등 하 게 분명 하다. 실제 구성 지주 표 2 를 참조 하십시오.

7입니다. 실험 벤치의 준비

참고:이 분, 플러스 따뜻한 목욕의 꾸준한 온도를 30 분 필요 합니다.

1. 녹음 벤치
   1. 따뜻한 목욕을 시작 32 ° C에 그것을 설정 하 고 그것의 온도 유지 하기 위해 그것을 커버.
      참고: 따뜻한 목욕이이 프로토콜에 사용 된 주문 품을 사용 하 여 단단한 플라스틱 상자와 원하는 온도에서 pre-set 수족관 온도 될 수 있습니다. 꾸준한 원하는 온도 실 온에서 시작 ~ 30 분에 도달 수 있습니다. 이후 전 지구 온난화 및 배양 챔버 플라스틱 상자 아래쪽에 앉아, 물 수준 해야 그냥 부동에서 챔버를 지키기 위하여 온도 커버 하기에 충분 합니다.
   2. 개최와 (cf. 그림 1A), 미리 데우는 챔버 어셈블합니다 그리고 지주 실제 그들로 부 어. 실 온에서 지주 챔버를 유지 하 고 따뜻한 욕조 안에 미리 데우는 챔버를 놓습니다. 버블링 95% O₂/5% CO₂ 가스 혼합 솔루션을 시작 하 고 거꾸로 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 어떤 덫을 놓은 거품을 제거. 덮여 유지.
2. 조각화 벤치 및 vibratome
   1. Cyanoacrylate 접착제를 사용 하 여 견본 디스크의 중심에 작은 천 블록을 붙입니다.
   2. 250 mL 비 커를 얼음 양동이에 넣고 그것으로 실제 절단 부 어.
   3. 2 100 mL 비 커 고 각으로 실제의 50 mL를 붓고. 실 온에서 비 커를 둡니다. 이들은 헹 구는 비 커입니다.
   4. 버블링 95% O₂/5% CO₂ 가스 혼합 솔루션을 시작 합니다.
   5. vibratome에 버퍼 트레이 탑재 하 고 얼음을 둘러싸고. 조각화 절차 동안 찬 온도 유지에서 원조 하는 얼음에 일부 에탄올을 붓는 다. 붓는 에탄올 후 필요에 따라 더 많은 얼음을 추가 합니다.
      참고: 2 ° C의 온도 최적입니다.
   6. 버퍼 트레이 내부 bubbler 다음 조립 놓고 vibratome 블레이드 블록을 탑재 합니다.
      참고: 블레이드 ~ 10 °의 클리어런스 각도에 마운트되어 있는지 확인 합니다.
   7. 볼륨 및 증류수와 칠의 2/3는 500 mL 비이 커에 얼음을 올려.
   8. 냉장고에서 냉동된 그릇을가지고, 그것은 거꾸로 조각화 벤치에 놓고 종이 타월 및 필터 종이 디스크 커버 합니다.
3. 마 취 벤치
   1. 얼음 가득 트레이에 작은 그릇을 놓고 실제 절단 부 어. 버블링 95% O₂/5% CO₂ 가스 혼합물으로 시작 합니다.

8. 뇌 슬라이스 준비 및 유지 보수

참고:이 프로토콜 성인 (4-6 주 오래 된)의 사용 남성 CD1 마우스, 하지만 다른 긴장 (예를들면, c57/bl6^17,18)를 사용할 수 있습니다. 우리는 나중에 또한 같은 나이의 남성 Sprague-Dawley 쥐에서 얻은 뇌 조각에 의해 굴복 그 마우스 두뇌 분할 영역을 사용 하 여 얻은 실험 출력을 비교 합니다. 다음 단계는 조각의 부분 분리 뇌 CA3 기반 빠른 interictal 같은 활동 적절 한 해 마를 제 지 하는 parahippocampal 외피가로 전파할 수 없습니다 준비를 참조 하십시오 ²³에서 설명합니다. 해 마 피 단절 해 마-EC 두뇌 슬라이스 준비를 사용 하 여 전기 변조 연구를 추구 하는 필수입니다. 사용 하는 vibratome 자료 테이블에 나열 된 모델을 말합니다. 다른 모델 다른 절차를 요구할 수 있습니다.

1. 설치류 isoflurane를 사용 하 여 anesthetize는 carbogen에 5 %2 L/min에서 마 취 유도 실에 전달 하는 혼합 가스.
2. 깊은 마 취 (없음 반사 발에 대 한 응답에 발 꼬 집),²³에서 표준 절차를 수행 하는 1 분 이내 뇌를 추출. Equilibrated 얼음 절단 실제를 포함 하는 작은 그릇에 두뇌를 배치 하 고 90-120 s에 대 한 진정 하자.
   참고: 너무 오래 진정 하는 두뇌 하지 마십시오, 그렇지 않으면 그것을 고정 수 있습니다.
3. 얼음 절단 실제 버퍼 쟁반에 부 어. 실제 냉동된 그릇에 필터 종이에 절단 확산. 필터 종이에 두뇌 놓고 필요한 뇌 조직 블록 소 뇌를 제거 하 고 바로 밖으로 정면 장 대를 절단 하 여 분리 합니다.
4. 구부러진된 주걱의 도움으로 컷 정면 면 한 블록 및 vibratome 블레이드를 직면 하 고 후 두 극 견본 디스크에 뇌의 등 쪽 측을 접착제. Cyanoacrylate 접착제의 얇은 층을 사용 합니다. 표본 디스크 버퍼 트레이에 즉시 놓고 그것을 확보 합니다.
5. 한 블록까지 조직에 걸쳐 줄곧 vibratome 블레이드를 이동 하기 위하여 단면 범위를 조정 합니다. 뇌 조직 블록 블레이드 수준에 도달 하려면 견본 디스크 높이 조정 합니다.
6. 해 마는 명확 하 게 표시 될 때까지 조직 단면도 삭제 (보통 ~ 900 µ m). 그런 다음 400 µ m의 슬라이스 두께 설정 하 고 조직 단면도 유지 하는 깔 끔 히 시작. 각 뇌 섹션에 대 한 두 개의 반구를 분할 하 고 두 개의 뇌 조각을 얻기 위해 불필요 한 조직 트림. 버퍼 트레이 후속 섹션 동안 고조는,으로 채울 버퍼 트레이 lodgment 아이스 증류수 (단계 7.2.7 참조).
7. 거꾸로 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 부드럽게 뇌 조각 첫 번째 헹 구는 비 커에 옮기고 파스퇴르 피 펫, 비어 고 두 번째 헹 구는 비 커에 두뇌 분할 영역을 전송. 그리고, 뇌 조각을 들고 챔버로 전송 그들이 적어도 60 분 동안 복구.
   참고: 일반적으로 6-8 두뇌 분할 영역 전체를 얻기 위해 가능 하다. 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다.

9. 4-AP (4AP-실제)을 포함 하는 실제의 준비

참고:이 준비를 위한 10 분 플러스 온난화의 20 분 필요합니다. 주의! 4 AP convulsant 마약 이며, 그것은 독성. 장갑과 처리 하며 유출 방지.

1. 500 mL 부피 플라스 크에 증류수 200ml를 부 어.
2. A 주식의 50 mL, B 주식의 50 mL, M, 주식의 5 mL 및 1 m m L-아 스 코르 빈 산을 추가 합니다. 부드럽게 회전 움직임을 사용 하 여 L-아 스 코르 빈 산 완전히 해산 될 때까지 교 반 하십시오.
3. 4AP 주식의 500 µ L를 추가 합니다.
4. 마지막 볼륨에 도달, 영화, 씰링으로 부피 측정 플라스 크를 밀봉에 증류수를 추가 하 고 부드럽게 반전 그것은 3-5 회까지 솔루션은 균등 하 게 분명 하다.
5. 어셈블합니다 4AP incubating 챔버 (cf. 그림 1A)와 그것에 4AP-실제의 ~ 80 mL를 붓는 다. 챔버를 커버 하 고 따뜻한 목욕을 전송 95% O₂/5% CO₂ 가스 혼합물으로 버블링 시작 합니다. 거꾸로 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 어떤 덫을 놓은 거품을 제거 합니다. 덮여 유지.
6. 4AP-실제 온도 30-32 ° C (~ 20 분) 때까지 기다립니다.
   참고: 프로토콜 수 있습니다 수 일시 중지 여기 뇌 조각을 아직도 회복 하는 경우.

10. 미리 온난화와 4AP에 조각의 외피 (지속 시간: 90 분)

1. 전 지구 온난화 실제와 4AP-실제 온도 30-32 ° c.
2. 거꾸로 유리 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 미리 데우는 챔버로 1 두뇌 슬라이스를 전송 하 고 25-30 분에 대 한 조직의 나머지. 다음 뇌 조각 4AP 실제 incubating 챔버로 전송 하 고 60 분 동안 휴식 하자.

11입니다. 잘못 설정 준비

참고: 녹음 하기 전에 15 분 시작 합니다.

1. 500 mL 삼각 플라스 크에 4AP-실제의 나머지 볼륨을 전송.
2. MEA 앰프 위의 선반에 삼각 플라스 크를 놓고 튜브를 사용 하 여 솔루션을 지속적으로 60 mL 주사기를 피드를 허용 합니다. 삼각 플라스 크와 1 mL/min의 중력 먹인 속도 있도록 주사기의 높이 조정 합니다.
   참고: 올바른 높이 튜브 내경 (ID)에 따라 달라 집니다. 5/32 인치 ID의 튜빙, 30 cm는 충분 하다.
3. 버블링 4AP-실제 95% O₂/5% CO₂ 가스 혼합물으로 주사기와 삼각 플라스 크에서 시작 합니다.
4. 거기까지 비 커에 관류 튜브를 통해 하자 4AP-실제 흐름은 공기 내부; 다음 솔루션 흐름을 중지 합니다.
5. 온도에 MEA 기지에서 난방 요소를 연결 합니다. MEA 앰프 내부 건조 MEA 칩 놓고 앰프 헤드를 확보 합니다. 플라스틱 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 입구와 녹음 실의 외부 저수지 4AP-실제 전송.
6. 자석 홀더를 난방 정 고 녹음 실 입구 포트; 내부 팁 배치 MEA 앰프 헤드;에 자기띠를 자석 홀더를 연결 정;에 관류 튜브를 연결 온도에 정 맥을 연결 합니다.
   주: 난방 정 경사진된 소계 (PTFE) 튜브 입구 포트 녹음 실에 도착 하 고는 정 맥의 금속 소재 때문에 잡음을 최소화 하 여 적용 한다. 입구 저수지는 4AP-실제와 채워집니다 적절 하 게 때 관류 시스템에서 떨어지는 방울 표시 됩니다.
7. 저수지 안에 흡입 바늘을 놓고 흡입 바늘 실제;에 잠수 하 여 부정적인 압력 인지 확인 일정-저주파 흡입 소음에 대 한 확인 하십시오.
   참고: 흡입 바늘 4AP-실제 뇌 조각 표면 바로 위에 흐름 수 있도록 배치 되어야 합니다. 진공 라인 또는 저 잡음 진공 펌프를 사용할 수 있습니다.
8. 1 mL/min의 유량 및 perfusing 시작 흐름 레 귤 레이 터를 설정 합니다.
   참고: 중력 먹인 관류; 연동 펌프에 의해 발생할 수 있는 잡음을 제거 한다. 연동 펌프는 기본, 저 잡음 모델은 필수입니다.
9. 4AP-실제는 정 맥을 통해 흐르는, 일단 온도 켭니다. 37 ° C와 32 ° C 기록 챔버 내부 32-34 ° C의 온도 달성 하기 위해 MEA 기지에 열 정을 설정 합니다.
   참고: 주의! 결코 열 솔루션 그것 또는 그것 없이 정 돌이킬 수 없 손상 될 수 있습니다. 정은 내장 온도 오프셋 설정된 값과 난방 정의와 챔버 내에 녹음 끝에 실제 값에 대 한 계정 기록 온도 (즉, 32-34 ° C) 보다 더 높은 온도 설정 합니다. 유량, 환경 온도, 및 녹음의 볼륨 모든 영향 기록 솔루션의 온도 챔버. 설정 단계 11.9에서에서 보고 설명된 프로토콜 및 장비 최적화 되어 있다. 항상 실제 기록 온도 열전대를 사용 하 여 확인 하 고 필요에 따라 설정을 조정. 뇌 조각 과열 방지를 위해 34 ° C의 위 MEA 자료가 열 하지 마십시오.
10. 녹음 실 입구 저수지에 외부 기준 전극을 배치 합니다.
    참고: MEA 칩 내부 기준 전극 갖추고 있습니다, 하지만이 사용자 지정 녹음 실에 의해 포함 된다. 따라서, 외부 기준 전극은 사용 되어야 한다. 포화 KCl 펠 릿 때문에 수돗물에 대 한 필요 없이 사용할 준비가 가장 실용적 이다.

12. MEA 라이브 매핑

1. 일단 4AP 실제 수준 및 기록 온도 안정화 원하는 회전으로는 관류와 일시적으로 그들을 막으려고 off 위치에 흡입 stopcocks 합니다.
   1. 신속 하 게 거꾸로 유리 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 잘못 녹음 실에 한 뇌 조각을 전송 합니다. 필요한 사용 하 여 한 불 세련 된 컬된 파스퇴르 피 펫 (그림 1C) 또는 부드러운 소형 작은 브러쉬를 잘못 기록 영역에 그것의 위치를 조정 합니다. 뇌 조각에 고정 앵커 (그림 1D)를 놓습니다. 그들의 stopcocks에 위치를 다시 설정 하 여는 관류와 흡입을 다시 시작 합니다.
      참고: 중요! 분할 전송 한다 되었다가 관류 이내 s 또는 조직 죽을 수도 있습니다. 조각을 고정 앵커 4AP-실제 뇌 조각 표면 장력의 차이로 인해 뇌 조각에 앵커를 배치 하는 동안 이동 하지 않도록 하려면에서 유지 되어야 한다. 앵커는 MEA에 두뇌 슬라이스를 확보 하기 위해 스테인레스 스틸 와이어 나일론 스레드 (그림 1D)를 사용 하 여 주문 품 일 수 있다 또는 상업적인 소스에서 얻은. 그림 1E 쇼 MEA 칩 최종 실험 설정 앰프의 헤드에 연결: MEA 칩 기록 챔버 내에 뇌 조각 사용자 정의 앵커에 의해 개최 됩니다. 반면 흡입 바늘 (파란색 화살표) 콘센트 저수지에 위치 참조 전극 (빨간색 원)와 난방 정 (빨간색 화살표)을 덮고 튜브 PTFE 입구 저수지에 배치 됩니다.
2. 거꾸로 현미경 스테이지에 장착 된 카메라를 사용 하 여 뇌 조각의 사진을 찍을.
3. 전극 지도에 GUI를 시작 하는 컴퓨터 소프트웨어에서 mapMEA 스크립트 실행 합니다.
   참고: 맞춤 소프트웨어 선택 전극 뇌 조각의 특정 구조에 해당 하는 사용자를 수 있습니다. 이 단계는 정확한 경로 활성화 하 고 전기 자극을 사용 하 여 ictal 활동을 억제 하는 중요 한.

그림 2: GUI에 대 한 라이브 MEA 전극 매핑. (A)는 MEA에 결합 된 해 마-EC 슬라이스의 도식 적인 표현입니다. 이 프로토콜에 사용 되는 기본 구조는 뿔 ammonis 3 (CA3), enthorinal 피 질 (EC), perirhinal 피 질 (PC), 그리고 subiculum (하위). 기준 전극은 삼각형 표식으로 도식화. 전극 점선에 둘러 쌓여 있어 교정 하는 이미지에 대 한 XY 좌표를 나타냅니다. (B) 화면 라이브 MEA 매핑하는 동안 GUI의 캡처. 플로우 차트 캡처의 왼쪽에 따라 단계별 절차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

4. 뇌 조각 그림 로드를 찾아보기 단추를 클릭 합니다. 참조 전극 반-왼쪽의 MEA (그림 2A, 삼각형 표시)의 위쪽 행에 표시 됩니다 있는지 확인 합니다. 포인터 활성화 단추를 클릭 다음 이미지 교정 및 전극 매핑을 위한 XY 좌표를 표시 하려면 배열의 왼쪽 행에 있는 위쪽 및 아래쪽 전극 선택 합니다.
5. 분할 영역 유형 드롭 다운 메뉴에서 수평을 선택 합니다. 구조를 기본 확인란을 체크.
   참고: 그것은 새로운 구조를 입력 버튼을 선택 하 여 구조를 사용자 정의할 수입니다. 수평 뇌 조각에 대 한 기본 구조는 그림 2A에서 묘사 된다.
6. 아래 뇌 조각 그림 번호 푸시버튼, 투자 수익에 해당 하는 전극 선택한 클릭 (그림 2B); 할당 구조 패널에서 해당 푸시버튼 각 투자 수익에 대 한이 단계를 반복 합니다.
7. 저장 버튼을 누르면: #EXP_LabelledElectrodes 선택한 전극 및 ROIs를 보고 테이블을 포함 하는 결과 폴더를 생성 하는 소프트웨어.

13. 기록 및 전기 변조 Epileptiform 활동의

1. 챔버 내에 녹음 녹음 하기 전에 5-10 분 동안 안정화 뇌 조각 허용.
2. 자기 교정 및 안정화를 허용 하도록 자극 프로토콜 전에 자극 단위 적어도 10 분을 켭니다. 자극 제어 소프트웨어를 시작 하 고 자극 및 MEA 앰프 연결 되어 확인 제대로 자극 제어 소프트웨어의 주요 패널의 녹색 LED로 표시. 특정 악기와 자료 테이블 cf. 자세한 내용은 소프트웨어 설명서를 참조 하십시오.
3. 바이 폴라 구성에서 자극을 설정 합니다. (Cf. 섹션 12) 스크립트 mapMEA 와 매핑된 것 들 가운데 CA1/인접 subiculum (cf.^24,25)의 피라미드 세포 층 접촉 전극 쌍을 선택 합니다. 선택 된 전극 중 하나는 자극과 같은 자극 채널의 긍정적인 플러그 다른 전극의 부정적인 플러그를 연결 하는 와이어를 사용 합니다. 다른 와이어를 사용 하 여 앰프의 접지에는 자극의 접지를 연결.
4. 레코딩 소프트웨어를 시작 합니다. 데이터를 얻기 위해 레코딩 소프트웨어의 주요 패널에서 재생 버튼을 누릅니다. 기록 적어도 4 ictal 출력.
   참고: 2 kHz의 샘플링 주파수는 하드 디스크 공간 사용을 최소화 하면서 공정 해상도 필드 잠재력을 취득 수 있습니다. 5 분 녹화 파일 ~ 80 MB 걸립니다. 더 높은 샘플링 주파수가 필요할 수 있습니다 예를 들어, 레코드 자극 또는 멀티 유닛 활동을. 관찰 하기 위해 필드 전위만, 300 Hz에서 라이브 로우-패스 필터를 사용 하 여 멀티 유닛 활동을 차단.
5. 자극 강도 결정 합니다.
   1. 자극 제어 소프트웨어에서 주요 패널을 사용 하 여 평방 복 형 긍정적-부정적 현재 펄스의 지속 시간이 100 µs/단계 디자인.
      참고: 주의! 직류 자극 균형된 충전 펄스를 장비 손상을 방지 해야 합니다.
   2. 최고의 자극 강도 식별 하는 빠른 입력/출력 (I/O) 테스트를 실행 합니다. 5 간 펄스 간격을 추가 하 여 0.2 Hz 또는 낮은 13.5.1 단계에서 설계 된 자극 펄스를 전달 s 자극 제어 소프트웨어의 적절 한 형태로 이상. 펄스 진폭 탭에서 100 µ A/위상의 초기 펄스 진폭 입력 하 고 각 재판에서 50-100 µ A 단계까지 자극 parahippocampal 외피가에서 interictal와 같은 이벤트를 보여주고 안정적으로 수 증가 (확인 하 여 시각 신호는 녹음 소프트웨어)입니다.
6. 변 ictogenesis의 전기 변조
7. 프로그램의 자극 프로토콜 제공 하 자극 단위. I/O 테스트 중 확인 된 자극 진폭을 사용 합니다.
   참고: 갖는 응답의 실패 비율 ≤20% 이어야 한다.
8. 자극 중지 후 적어도 4 ictal 방전 (13.4 단계)로 기록 하 여 네트워크 복구 사전 자극 상태를 확인 합니다.

결과

6 x 10 레이아웃과 500 µ m 전극 간격 평면 MEAs는 여기, 때문에 그들의 기록 영역에 걸쳐 뇌 조각 전체에 걸쳐 설명 실험 프로토콜에 대 한 이상적인 녹음 장치 (그림 3A,¹⁷참조). 구멍이 MEAs (pMEAs) 조직 산소를 개선 하는 것이 좋습니다 것입니다, 그들의 기록 영역 너무 작습니다 (~ 2 mm 직경). 이 해 마와 parahippocampal 외피가 생성 하는 전기 신호의 동시 시각화를 허용 하지 않습니다 (데이터 표시 되지 않습니다;¹⁸참조).

관찰된 4AP 유도 epileptiform 패턴 (그림 3A) 충실 하 게 재현 한 무슨이 생체 외에서 사용 하 여 모델 기존의 필드 잠재적인 기록에서에서 일반적으로 관찰 하 고 구성 하는 세 가지 유형의 활동^{7, 26}: (나) ictal 같은 이벤트 (그림 3B, 화살촉)는 강력한 오래 견 딘 (> 20 s, 범위: 20-60 s) 토 닉와 clonic 부품 (그림 3C); 발작 활동의 electrographic 기능을 닮은 이벤트 그들은 모든 3-5 분 parahippocampal 외피가 내에서 생성 되 고 재입력 (3D 그림, 화살표);가 이랑 통해 hippocampal 형성 (ii) 느린 interictal 같은 방전 (그림 3B, EC 추적, 검은 바;에 확장 된 그림 3E)는 짧은 (< 1 s) 해 마-EC 두뇌 슬라이스 준비 내 편 ictal 이벤트 사이 생성 된 인구 이벤트 느린 속도 (범위 10-30 s)에서 발생 (iii) 빠른interictal 같은 방전 (그림 3B, CA3 추적, 검은 바; 그림 3E에 확장)는 되풀이 브리핑 (< 1 s) 인구 이벤트 CA3 hippocampal 하위;에 의해 생성 된 Schaffer 민간인 보존 빠른 CA3 기반 interictal 이벤트 hippocampal 루프를 따라 전파 하 고 발휘 한 안티-ictogenic 효과²⁴ (데이터 표시 되지 않음); ictal 활동을 방지 하기 위해 설명된 프로토콜 위해 런다운 CA3 출력 중단 됩니다 (cf. 그림 3B, E). MEAs를 사용 하 여 기록 빨리 CA3 구동 interictal 활동 느린 속도로 발생 하는 것을 주목 해야 하는 데 필요한 (~ 0.4 Hz) 유리 펫과 녹음 하는 기존의 필드 잠재력을 사용 하 여 관찰은 무엇 보다 (~ 1 Hz, 범위: 0.5-2.0 Hz, 데이터 표시 되지 않음).

전기 neuromodulation 설치류 두뇌 조각에서의 성공적인 결과 준비²⁴에 포함 하는 지역 간의 기본 연결 함께 특정 신경 통로²⁷ 의 활성화에 따라 다릅니다. 우리 성인 남성 Sprague-Dawley 쥐에서 얻은 조각 테스트 하 고 CD1 마우스와 우리 나타났습니다 그 마우스 크기, 두께, 그리고 내장 연결 중 최상의 트레이드 오프를 제공 하는 쥐 두뇌 조각 보다는. 첫째, 그들의 더 작은 크기 덕분에 그들은 상업적으로 이용 가능한 MEAs의 작은 기록 영역 더 잘 맞는 (그림 4A, 왼쪽: 쥐, 오른쪽: 마우스); 둘째, 그들은 내장 MEA (cf. 소개) 기록 하는 불리 한 조건에 탄력: ictal 같은 방전이 두 조직 (그림 4B)에 의해 생성 된 있지만 의 유사한 기간 (그림 4C 왼쪽), 발생의 그들의 속도 상당히 짧은 마우스 뇌 조각에서 (n = 10 조각 각 종; 2 꼬리 짝이 없는 t-검정, p < 0.001; 그림 4C 오른쪽)입니다. 후자 과속 업 실험 프로토콜, 실험 하루 동안 뇌 조각 더 큰 수를 테스트 수 있습니다:이 대표 결과이 집합에 대 한 우리 두 종에서 뇌 조각 비슷한 수 테스트 수 (쥐: n = 58. 마우스: n = 52), 쥐의 수만 (n = 18) 2-fold 쥐의 수보다 작은 (n = 42).

또한, 마우스 뇌 조각 밀도가 연결 현재 표시 되 고 따라서 더 높습니다 더 나은 지속적인된 전기 neuromodulation (그림 4D)에 대응. 따라서,이 생체 외에서 의 모델에서 ictogenesis, ictal 활동을 제어 하기 위한 전기 자극에 대 한 생존 능력은 쥐 뇌 조직에 대 한 보다 마우스에 대 한 상당히 큰. 이 부분 또한 자극 실험 쥐 뇌 조각 대 마우스를 사용 하 여 여러 지속적인된 자극 프로토콜 (그림 4E를 추구 하는 경우에 수행의 상당히 높은 성공률에 의해 반영 됩니다). 사실, 마우스 뇌 조직 더 나은 테스트 실험 시간 프레임 내에-4 h (그림 4 층)의 높은 생존 율에 의해 제안으로 지속적인된 전기 자극을 견딜 수 있도록 나타납니다. 따라서, 기본 연결의 더 나은 보존 함께 작은 크기 게 마우스 뇌 조각 MEA hippocampal parahippocampal 네트워크 상호 작용을 공부 하 고 겨냥 녹화를 수행 하 고 평가 하는 가장 적합 한 후보 전기 TLE 관련이 있는 neuromodulation 프로토콜.

정기적인 성 CA1/subiculum 전달 4AP 취급 해 마-EC 슬라이스 준비^24,25,27, 가장 효과적인 주파수²⁷로 1 Hz와 변 ictogenesis 제어 알려져 있다. 따라서, 그것은 또한 (예를 들어²⁵참조) 효능과 다른 neuromodulation 정책의 효율성을 평가 하는 긍정적인 컨트롤으로 유용. 위에서 설명 했 듯이, MEA (즉, 외부 자극 전극의 필요 없이)를 통해 직접 전달 하는 전기 펄스 설치류 뇌 조직에 인구 응답을 보여주고 있습니다 (²⁸참조). 뇌 조각 내 신경 네트워크 연결의 충분 한 보존, MEA, 그리고 자극 전극 쌍의 적절 한 선택에 두뇌 분할의 정확한 위치 추구 수 있도록 전기 neuromodulation 실험을 ictogenesis는 효과적으로 제어 합니다. 그림 5A같이 정기적인 프로토콜 사용 하 여 평면 MEAs 모두 녹음으로 자극 장치, 전기 자극의 효과 통해 구상 될 수 있다 추가 혜택으로 서 정식 1 Hz를 재현 가능 하다는 기존의 필드 잠재적인 녹음에 비해 동등 하 게 간격 둔된 관찰 포인트의 높은 숫자와 함께 두뇌 조직 섹션. 그림 5B 는 n에 대 한 얻은 결과의 정량화를 보여줍니다 = 총 시간 (총 ictal 활동 기간/관찰 시간²⁵) 자극 동안 압류의 상당한 감소를 나타내는 9 뇌 조각 (한 방법-ANOVA, F(df): 6.84(2), p < 0.01, 피셔의 LSD 특별 게시물 테스트, 보호). 결과 외부 자극 전극^24,25에 대 한 문학과 일치.

계산 시간, 관측 시간을 압류 총 ictal 이벤트 사이의 간격에 따라 달라 집니다 그리고 그것은 또한 자극 프로토콜의 최소 기간을 결정 합니다 자신 있게 neuromodulation의 효과 평가 해야 합니다. 우리 4 ictal 방전 (그리고 ictal 이벤트 사이 따라서 적어도 3 간격)을 기록 하는 것이 수집 된 샘플 및 필요한 컬렉션 시간 사이 좋은 트레이드 오프입니다 찾을. 제어 상태 (즉, 아무 자극), 관찰 시간은 첫 번째 측정된 ictal 이벤트의 개시와 마지막의 종료 사이의 지연입니다. Neuromodulation, 동안 관측 시간 측정의 목적은 척도 섭 동 시스템에 도입 시간에 걸쳐 발생 하는 현상 이므로 자극 프로토콜 기간을 같습니다. 컴퓨팅과 비교 하는 시간 보다는 기간 그리고 ictal 이벤트의 간격을 압류 총 유형 II 오류를 피하기 위해 가장 적절 한 매개 변수입니다. 사실, ictal 활동의 완전 한 억제, 함께 그것도 하나만 ictal 이벤트 여러 이벤트 반대 전기 자극 중에 생성 된 제어 상태에서 관찰 가능. 이 경우에, 이벤트 사이의 간격을 측정 하는 것은 불가능 하다, 반면 자극 효능의 견적으로 ictal 기간 측정 (즉, ictal 활동 감소) neuromodulation의 실제 결과 대표 하지 않는다.

전반적으로, 여기에 제시 된 결과 마우스 뇌 조각 MEAs에 결합 된 귀중 한 도구 간 질 연구에 대 한 사전 간 질 치료에 대 한 DB의 필드 관련 된 신뢰할 수 있는 neuromodulation 연구를 수행 하는 나타냅니다. 또한, 여기에 설명 된 프로토콜 뇌 조각 생존 능력 향상과 필요할 수 있습니다., 예를 들어 다른 전기 자극의 효과 비교 하기 위해 몇 시간 (그림 6)에 대 한 실험 세션을 추구 하 고 있습니다. 패러다임입니다.

그림 3 : 평면 측정으로 시각화 하는 전형적인 4AP 유도 epileptiform 패턴 (A) 마우스 뇌 평면 6 x 10 MEA에 슬라이스 (전극 간격: 500 µ m) 및 MEA 녹음 시각 4AP 유도 epileptiform 패턴의 측면-의해-개요. 눈금에서 각 사각형 뇌 조각 내의 해당 위치에 기록 하는 활동을 수용 한다. 파란색 파선 보다 명확 대 한 전극 행을 참조 하십시오. 각 사각형의 왼쪽 위 모서리에 파란색에서 기록 전극 번호 식별 됩니다. 회색 사각 교차 참조 전극을 나타냅니다. (B) EC 및 CA3 패턴 빠른 시간 단위에서 시각의 대표적인 추적 세그먼트. 화살촉 ictal 이벤트를 나타냅니다. EC 추적에서 그것은 느린의 발생을 감사 수 interictal 방전 (검은 막대), CA3 하위 전형적인 지속적인된 fastinterictal 패턴 (검은 막대)를 생성 하는 반면. (C) 일반적인 강장제 clonic 패턴을 보여주는 ictal 방전의 기록 확장. (D) EC (빨강) 및 CA3 (검정) 추적 세그먼트에 해당 하는 사전-ictal-하-ictal 전환의 빠른 규모 시각화 (B)에서 붉은 막대로 표시. 화살표 ictal 방전의 개시를 나타냅니다. 겹쳐 추적 ictal 이벤트는 EC에서 유래 하 고 이후에 CA3 하위 필드에 전파를 강조 표시 합니다. (E) (B)에 검정색 막대로 표시 interictal 기간의 확장 된 보기는 느린 사이 상호 관계의 부족을 강조 및 fastinterictal에서 생성 된 패턴 EC (빨강) 및 CA3 (검정), 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4 : 쥐 뇌 조각 보다는 더 높은 실험 출력을 제공 하는 마우스 뇌 조각. (A) 뇌 쥐 (왼쪽)와 일치 된 나가의 (오른쪽) 마우스에서 슬라이스. 쥐 뇌 조각 MEA 기록 영역 보다 훨씬 더 큰 이며, 그것의 전기 활동 전체에 구상 될 수 없습니다. (B) 마우스 및 쥐 enthorinal 피 (EC)에 의해 생성 된 재발 ictal 활동의 직접적인 시각적 비교. (C) 쥐 및 쥐 두뇌 분할 영역 생성 비슷한 기간의 ictal 출력 이러한 이벤트 사이의 간격 이지만 거의 2-fold에 쥐 뇌 조직. * p < 0.05. (D) 쥐, 쥐에 비해 제공 가능한 전기 자극 실험에 대 한 뇌 조각의 2-fold 높은 수익률 ictogenesis 제어 목적으로 합니다. 전기 자극은 subiculum의 20 58 (34%) 쥐 뇌 조각, 52 (63%)의 33 반대로 마우스 뇌 조각에에서 parahippocampal 외피가에 인구 응답 연상 수 (치²: 9.22; p = 0.002). p < 0.05. (E) 가능한 조각 사이 ictal 활동 제어에 성공률은 2-fold 쥐 뇌 조각 대 마우스 (마우스: 33 뇌 조각, 60%의 20: 쥐: 6 20 뇌 조각, 30%; 치²: 4.67; p = 0.03). p < 0.05. (F) 마우스 뇌 조각 견딜 수 있는 지속적인된 전기 자극 (회색 음영 지역)의 장시간된 신 기원 반복. 자극 철수 시 마우스 뇌 조직 전시 epileptiform 패턴의 전체 복구 쥐 뇌 조직 생존 3 헤에서 극적으로 떨어지는 반면 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 5 : 두뇌 분할 영역을 사용 하 여 ictogenesis의 전기 변조의 대표적인 실험 측정을 결합 4AP 유도 ictal 활동의 EC 및 PC에서 정기적인 1 Hz에 (PP)를 서 성 제어 상태 (자극), (A) 녹화 (자극 유물 잘립니다), 그리고 자극 철수 시 복구 하는 동안. (B) 시간을 점유 하는 총에 1 Hz에서 PP의 효과의 정량화. p < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 6 : 4AP 유도 ictal 활동의 대표적인 장기 기록. (A) 추적 절차를 자르는 뇌 후 기록된 8 h와 4AP 응용 프로그램의 다음 2 시간 세그먼트. (B) 확장 된 추적 세그먼트에 해당 하는 편지는 는, b및 c 패널에 의해 식별 된 박스형된 ictal 출력 (A) 표시 장기간된 관찰 시간-과 부에 걸쳐 생성 된 ictal 활동의 일관성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

주식 A	화학	분자량	농도 (mM)
	NaCl	58.44	1150
용 매: 물 소 주	KCl	74.55	20
집중: 10 x	KH2포4	136.1	12.5
저장 온도: 4 ° C	CaCl2* 2 H2O	147.02	20
최대 저장 시간: 1 주	D-포도 당	180.2	250
참고: 50mm 멤브레인 필터를 사용 하 여 필터링
주식 B	화학	분자량	농도 (mM)
	NaHCO3	84.01	260
용 매: 물 소 주
집중: 10 x
저장 온도: 4 ° C
최대 저장 시간: 1 주
참고: 50mm 멤브레인 필터를 사용 하 여 필터링
주식 C	화학	분자량	농도 (mM)
	KCl	74.55	20
용 매: 물 소 주	KH2포4	136.1	12.5
집중: 10 x	MgCl2* 6 H2O	203.3	50
저장 온도: 4 ° C	MgSO4* 6 H2O	246.47	20
최대 저장 시간: 2 wks	CaCl2* 2 H2O	147.02	5
참고: 50mm 멤브레인 필터를 사용 하 여 필터링
주식 M	화학	분자량	농도 (mM)
	MgSO4* 6 H2O	246.47	100
용 매: 물 소 주
집중: 100 x
저장 온도: 4 ° C
최대 저장 시간: 4 wks
4AP 주식	화학	분자량	농도 (mM)
	4-aminopyridine	94.11	250
용 매: 물 소 주
집중: 1000 x
저장 온도: 4 ° C
최대 저장 시간: 2 wks
참고: 2-3 분 또는 30-60 분에 대 한 stirr에 대 한 소용돌이
참고: 주의! 4 AP는 독성 및 cinvulsant. 장갑을 사용 하 고 확산 또는 유출 방지.

표 1: 주식 솔루션입니다.

실제 들고			녹음 실제			절단의 실제
화학	C [m m]		화학	C [m m]		화학	C [m m]
NaCl	115		NaCl	115		자당	208
KCl	2		KCl	2		KCl	2
KH2PO4	1.25		KH2PO4	1.25		KH2PO4	1.25
MgSO4	1.3		MgSO4	1		MgCl2	5
CaCl2	2		CaCl2	2		MgSO4	2
D-포도 당	25		D-포도 당	25		CaCl2	0.5
NaHCO3	26		NaHCO3	26		D-포도 당	10
L-아 스 코르 빈 산	1		L-아 스 코르 빈 산	1		NaHCO3	26
						L-아 스 코르 빈 산	1
pH	7.4		pH	7.4		Pyruvic 산	3
Osmolality	300 mOsm/Kg		Osmolality	300 mOsm/Kg
						pH	7.4
						Osmolality	300 mOsm/Kg

표 2: 솔루션 구성입니다.

문제 해결
문제			대책
'청크' ictal 출력 보기			관류 속도 감소 또는 흡입 바늘 위치를 조정 하 여 뇌 조각 위에 실제 볼륨을 낮추십시오.
아니 ictal 활동			CA3 기반 빠른 interictal 이벤트는 피 질에 전파 되지 않습니다 (1) 확인 작은 메스 블레이드 (예: n.10)를 사용 하 여 또는 경우 Schaffer Collaterals를 끊을 수 바늘, 하지만 슬라이스 고정 앵커의 나일론 스레드를 절단 하지 않도록 주의 하십시오. 거꾸로 한 현미경이이 작업이 매우 어려운 반면 스테레오-또는 똑바로 현미경은 가장 적합 합니다.
			(2) 슬라이스 생존 확인: 강한 전기 자극 ictal 활동을 일으킬 수 있다? 4AP 응용 프로그램의 약 2 시간까지 기다립니다 다음 ictal 활동 발생 하지 않으면 뇌 조각을 변경 합니다.
뇌 조각 이동 때 고정 앵커			(1) 부드럽게 조각 앵커를 제거 하 고 뇌 조각 위치.
			(2) 슬라이스 앵커 4AP-실제의 균등 하 게 젖은 있는지 확인 합니다.
			(3) 선호는 MEA 뇌 조각을 접착 하 녹음 실에서 4AP-실제를 제거 합니다.
			(4) 조각 고정 앵커를 재조 정할.
두뇌 분할 전송 후 MEA 칩에 수레			(1) 부드럽게 파스퇴르 피 펫과 초과 실제 발음.
			(2)는 MEA 칩 다시 코팅 되도록 해야 합니다.
네트워크 응답을 유도 하지 않는 전기 자극			자극 강도 증가, 전극 쌍을 변경.
전기 자극 인접 하지만 하지 말 초 피 질 영역에 인구 응답을 이끌어 낼 수 있습니다.			문제는 불 쌍 한 연결 또는 너무 낮은 자극 강도 ikely. 전기 자극 대뇌 피 질의 일부분만 되거나 효과가 있을 수 있습니다. 뇌 조각을 변경 하는 것이 좋습니다.
신호는 시끄러운			(1) 확인 참조 전극: 시끄러운 기준 시간에 의해 발생할 수 있습니다 입구 저수지의 불완전 한 채우기를 참조 전극은 완전히는 실제 깊은.
			(2) 장비의 전반적인 접지 확인.
			상수, 부드러운 흡입 소리가 그래서 (3) 조정 흡입 바늘 위치 땅 흡입 바늘입니다.
			(4) 면봉을 사용 하 여 에탄올과 MEA 외부 연락처를 청소.
			(5)는 MEA 칩 손상 될 수 있습니다: MEA 칩을 변경 하 고 확인 유물과 신호 대 잡음 비율.

표 3: 문제 해결.

토론

MEAs 신경 생리학 조사에 대 한 귀중 한 도구 이며, 수십 년간의 탐사 및 개발 덕분에 최근 몇 년 동안에 성숙에 도달 했습니다. 기존의 필드 잠재적인 녹음에 비해 MEAs 관찰 포인트와 알려진된 전극 간 거리는 정확 하 게 신경 네트워크 상호 작용을 정확 하 게 중요 한의 높은 숫자의 큰 이점을 제공 합니다.

MEA 녹음 기술 또한 패치 클램프 기록¹⁵, 단일 신경 세포와 신경 네트워크 활동 사이의 관계를 조사 등 다른 전기 생리학 방법에 결합 될 수 있습니다. 또한, 필드 전위와 멀티 유닛 활동을 동시에 시각화의 가능성의 작은 신경 앙상블 활동 및 집단 신경 네트워크 간의 상관 관계에 대 한 귀중 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 전압에 민감한 염료, 칼슘 이미징, 및 optogenetics²⁹ 함께 신경 생리학 현상 다면체 접근을 사용 하 여 추론 수 있습니다. 약리 연구 뿐만 아니라 녹화와 같은 시스템 자극의 가능성은 MEA 녹음 기술은 매우 강력 하 고 다재 다능 한: 예, 그것은에 시 냅 스가 소성 현상을 공부 하는 코어 메모리 형성³⁰, 여기, neuromodulation 프로토콜을 사용 하 여 간 질 및 다양 한 뇌 질환을 치료 하는 DBS와 관련 있는. MEA 녹음 기술을 적용할 수 있는 성공적으로 인간의 간 질 뇌 조직¹⁶ 최근 증거 보여 둘이 치명적인 질병을 기본 기본 메커니즘을 이해 하는 간 질 연구에 귀중 한 유용성 그리고 그것을 개량 하는 DBS 알고리즘을 미세 조정 합니다.

그러나 MEAs 뇌 조각, 침수 녹음 챔버의 요구와 뇌의 필요성에 대 한 '제한' 조건 하에서 전기 생리학 실험의 추구를 강제 하는, 고체 기판에 나머지 부분을 슬라이스 어디 마이크로 전극 통합 되어 있다. 따라서, 뇌 조직에 충분 한 산소 공급, 차례로 녹음의 품질에 영향을 미칠 수 있습니다 받을 수 없습니다.

여기에 설명 된 프로토콜 수 안정적으로 기록 하 고 MEAs 급성 체 외 4AP 모델을 사용 하 여 결합 하는 설치류 변 네트워크에 ictogenesis 연구 및 평가 대 한 관련 정보를 제공 하는 전기 자극의 장시간된 신 기원 추구 하 DBS 정책의.

기존의 필드 잠재적인 기록의 사용에 따라 간 질 변 네트워크의 전기 neuromodulation에 이전 연구 비슷한 결과^24,25; 마우스 또는 쥐 뇌 조각 사용 그러나 쥐 뇌 조직을 사용 하 여 더 많은 도전, 합리적으로 마우스⁷에서 얻은 뇌 조직에 비해 약한 연결 때문. MEA 기술 관련 마우스 뇌 조각 그들의 더 작은 크기의 덕택으로 가장 적합 하다. 또한, 쥐 뇌 조직 대 마우스 ictal 같은 방전의 발생의 더 높은 속도 감안할 때, 그것은 차례로 데이터 수집 빠르고 효율적이 게, 하나의 실험 하루 동안 훨씬 더 많은 두뇌 분할 영역을 테스트 하 여 수 있습니다. 사용 하는 동물의 수를 줄일 수 있습니다.

기존의 방법에 관하여 의미:

여기 설명 하는 사용자 지정 챔버를 사용 하 여 기록 ictal 출력 기간 및 기존의 MEA 반지 챔버와 동일한 MEA 형식 (평면 마이크로 전극, cf. ¹⁷)를 사용 하 여 관찰 하는 그 발생의 비율에 유사한 것 처럼. 그러나, 그것은 인해 실험 neuromodulation의 성공적인 추구를 방해 수 있습니다 낮은 관류 속도 (1 mL/min)와 함께 기존의 라운드 기록 챔버를 사용 하 여 때 뇌 슬라이스 두께 현저 하 게 감소 되어야 한다 강조 될 필요가 하 불 쌍 한 연결입니다.

이 프로토콜에는 낮은 볼륨 사용자 지정 녹음 실 패치 클램프 기록 챔버 디자인에 의해 영감된는 MEA 녹음;의 성공적인 추구에 대 한 중요 안정적이 고 신뢰할 수 있는 층 흐름을 제공 합니다. 그것은 또한 조직 생존 능력 및 기본 연결 사이 공정한 교환을 달성 하기 위하여 400 µ m 두뇌 슬라이스 두께 증가 수 있습니다. 그것은 참으로 인식 챔버 내에 기록 솔루션의 층 류 흐름은 온도, 산소에 의해 영향을 받지 않습니다 원형 흐름에서 관찰 된다 pH 기온 변화도 라운드 기록 때문에 뇌 조각 전기 생리학에 대 한 매우 바람직한 (사람)과 같은 상용 MEA 제공^19,,2031 실 이러한 그라디언트 실험적인 바이어스를 소개 하 고 또한 뇌 조각에 해로운. 높은 관류 속도 (5-6 mL/min)^16,31 함께 상대적으로 작은 볼륨 (~1.5 mL)의 녹음 실 관류 매체의 적절 한 교환에 대 한 허용 (≥3 시간 / 분). 사용자 지정 챔버 쉽게 될 수 있는 저렴 한 가격에 상용 소스에서 얻은 또는 3D 인쇄 기술을 사용 하 여 자체 생산. 다른 연구는 저 잡음 연동 펌프의 도움으로 MEA 녹음 400 µ m 두께 인간의 두뇌, 조각¹⁶ 1 mL에 실제 볼륨을 유지 하 고 높은 관류 속도 (5-6 mL/min)를 시행 하면서 기존의 MEA 반지 챔버를 사용 하 여를 보고 있다. 그러나, 저자는 모델을 사용 다른 ictogenesis, 즉, 낮은 마그네슘^{2 +}, 어떤은 더 적은 4AP 모델 보다 extracellular K⁺ 농도에 상당한 증가 포함 하는 ephaptic 메커니즘에 의해 영향을 가능성이 ^{11 , 22}. 우리 높은 관류 속도 크게 녹음 실제¹⁶에 증가 될 필요가 있을 수도 축적 된 세포 외 K⁺의 밖으로 빠른 세척으로 인해 4AP 모델에 없습니다 것으로 나타났습니다. 사실, ictal 이벤트 등장 더 '청크' ASCF 관류 속도 2-3 mL/min로 증가 하 고 뇌 슬라이스 두꺼운 실제 층에 의해 가라앉아 있었고 반면 강력한 강장제 clonic 구성 요소를 전시 하는 본격적인 방전을 반환 시 복원할 수 있습니다. 낮은 관류 속도 (1 mL/min)와 얇은 실제 계층 조직 표면 수준 (데이터 표시 되지 않음)에서 권리. 이 프로토콜에서 설명 하는 사용자 지정 녹음 챔버 수 교환 관류 매체 3-5 시간 / 1 mL/min의 유량에 분. 따라서, 전체 산소 공급 뇌 조각을 여전히 안정 온도 및 높은 신호 대 잡음 비율을 보장 하면서도 상대적으로 낮은 관류 속도에서 향상 강하게 됩니다. 가장 중요 한 것은, 생리 적인 가치에 extracellular K⁺ 농도 유지 가능 하다.

Ictogenesis의 4AP 모델 낮추는 Mg^{2 +} 또는 증가 K⁺, 같은 실제 이온 구성의 중요 한 수정 필요 하지 않습니다 그리고 흥분 성의 억제 전송을 그대로 유지의 독특한 장점을 제공 합니다. ¹², 높은 glutamatergic 및 epileptiform 동기화 (cf. ⁷)에 GABAergic 네트워크의 중요 한 역할에 비추어 간 질 연구에 관련 된 부분입니다. 4AP-실제가이 프로토콜에 사용 되는 생리 적 K⁺ 농도 (3.25 m m)와 지주 실제 (1.3 m m와 1 m m) 보다 약간 낮은 Mg^{2 +} 농도 포함 되어 있습니다. 이 농도 아직도 쥐 CSF에에서 Mg^{2 +} 농도의 보고 생리 적인 값에 폭포와 많은 실험실 (예^17,18참조)에 사용 됩니다. 설명된 프로토콜의 목적에 우리는이 약간 감소 4AP의 효과에 도움을 선호 발견.

이전 작업에서는 4AP 적용 되었습니다 뇌 조각에 때 그것은 이미 녹음 실^17,18안으로 배치 했다. 4AP 응용 프로그램 epileptiform 패턴의 시작 간의 시간 대기 시간을 관찰 하는 실험 필요 하지 않는 한 우리가 찾을이 방법은 오히려 시간이 많이 걸리는 이며 장시간된 녹화 및 자극 세션을 추구 하는 적합 하지 않습니다. 이 프로토콜에서 설명합니다. 사전 부 화 뇌 조각 4AP 32 ° C에서의 뇌 조각을 다른 조직 단면도 사용 하 여 실험을 추구 하면서 시리즈에서 사전 처리 될 수 있으므로 많은 실험 시간을 살려주는 수 있습니다.

뇌 조각의 장기 생존 능력 장기에 네트워크 기능을 분석 유용할 수 있습니다. 또한, 반복적인 전기 자극에 그들의 향상 된 복구 큰 장점은 실험 통계 견고성에 대 한 동일한 두뇌 조각에서 수행 해야 하는 여러 자극 프로토콜을 비교 하고자 하는 경우입니다. 우리의 손에서 3 자극 프로토콜을 테스트 하는 경우 각 컨트롤 단계 앞 하 고 복구 단계 이어서, 실험 3-5 시간 지속 될 수 있습니다. 이러한 맥락에서 라이브 MEA 매핑 올바른 경로 활성화 하 고 억제 보다는 전기 자극을 통해 ictogenesis를 부탁 하기 위해 결정적 이다. 우리의 사용자 친화적인 GUI 매핑할 다른 뇌 구조의 전극 신속, 간단 하 고 유연한 도구를 나타냅니다. 상용 소프트웨어에 반대 그것은 기본적인 프로그래밍 기술도 함께 MEA 레이아웃 사용자 지정을 추가할 수입니다. 이미지는 밝은 분야에서 취득 될 수 있다 따라서, 범용 카메라 어떤 좋은 해상도 현미경에 적당 하다. 거꾸로 한 현미경 똑바로 현미경을 사용 하는 경우이 조직 아래 숨겨져 있을 것 이라고 이후 뇌 슬라이스는 microelectrodes 위치를 시각화 하는 필수적 이다. 그러나, 스테레오 현미경 좋습니다 거꾸로 종류는 실험 수행 칼-인하 특정 신경 경로 방해 하는 경우.

마지막으로,는 더 제안 된 방식의 장점은 대부분의 필요한 도구는 비용이 많이 드는의 불필요 한 사용 뿐만 아니라 사용자 지정 녹음 실 및 지주 챔버, 따뜻한 목욕과 슬라이스 앵커 같은 저렴 하 고 상대적으로 쉬운 조립 저소음 연동 펌프입니다.

기술의 한계:

MEA 녹음 매우 느린 파도, 즉시각화를 허용 하지 않습니다, 그리고 DC 신호에 있는 이동. 이러한 초기 심한 ictal 출력 기간의 점근 측정을 도움이 될 수 있으며, 가장 중요 한, 그들은 근본적인 외피 퍼지는 불경기 (현상 간 질³² 에서 갑자기 예기치 않은 죽음에 관한 공유 하를 공부 하는 사이 간 질과 편두통³³).

전기 neuromodulation 관련 여기에 설명 된 프로토콜 뇌 조각 생존 능력을 영향을 주지 않고 여러 자극 세션을 수행할 수 있습니다. 우리는 성공적으로 20-45 분, 어떤 이전 작품²⁵에 보고 유사한의 3 자극 세션을 수행할 수 있습니다. 뇌 조각 아마 자극 세션 또는 더 이상 자극 프로토콜의 높은 수를 견딜 수 있습니다, 비록 우리가 않았다 테스트 하지 뇌 조각 이와. 3 자극 프로토콜 수를 제한 하 고 피하 자극 철수 시 회복의 부족까지 이러한 제한 조건에서 유지 하는 뇌 조직 스트레스 크게 수 있습니다 (≥60 분) 자극 세션 연장 하는 것이 좋습니다.

프로토콜 내에서 중요 한 단계:

몇 가지 중요 한 요소는 녹음의 성공적인 추격과 뇌 조각 MEA에 결합 된 epileptiform 활동의 방해 수 있습니다. 게다가 사용 설치류 종 뇌 조각, 기록 하는 동안 관류 속도의 품질과 실제 흐름의 역학 (즉,., 층 류 원형 대) 챔버 내에 기록, 우리는 발견 복구의 조건 및 4AP 응용 프로그램의 모드 뿐만 아니라 뇌 조각의 장기적인 유지 관리에서 가장 중요 한 단계가 있습니다.

침수 지주 챔버를 사용 하 여 때 뇌 조직 네트워크 활동을 보존 4AP 응용 프로그램에 의해 ictal 같은 방전의 유도 부탁을 실 온에서 두뇌 분할 영역을 저장 하는 데 결정적 이다. 우리의 손에서 복구 및 32 ° C에서 유지 보수 조각화의 3-4 h 이내 뇌 조직의 악화.

그러나 4AP-실제 실내 온도에에서 부 화 뇌의 조각와 32 ° C에서 녹음은,, 아닙니다 바람직한. 우리는이 조건에서 강력한 재발 ictal 출력을 관찰에서 많은 어려움을 발견 했다. 사실, 20-24 ° C 범위에서 낮은 온도 저해할 또는 심지어 방지 4AP 유도 ictogenesis 모두 에 체 외³⁴ 그리고 vivo에서³⁵보고 되었습니다. 따라서, 4AP 인큐베이션 및 기록 온도 30-34 ° C에 속하는 해야 합니다와 일치 해야 합니다. 않도록 하기 위해 hyperexcitability의 동시 유도 인해 너무 많은 스트레스를 받고 뇌 조직의 4AP 및 뇌 조각의 갑자기 노출에 의해 실내 온도에서 따뜻한 (32 ° C) 4AP-실제에, 그것은 수행 하는 중간 사전 온난화 기본적 이다 단계 및 하자 뇌 조각 길 들 32 ° C에서 실제 지주에 대 한 20-30 분이이 단계를 건너뛰는 4AP로 ictogenesis 유도 영향을 미칠 수 있습니다.

언급 하는 또 다른 측면은 슬 라이 싱 후에 실제 D-포도 당 농도의 중요성. 25 mM 농도 뇌 조각 많은 실험실에서 사용 하는 10mm 농도 보다 더 보존 하 고 또한 빠릅니다 2-fold ictal 활동의 발생의 속도 향상 (따라서, 쉽게 실험의 긴 시리즈를 추구 하 여러 뇌 조각 매일 프로토콜).

마지막으로, 조각화 절차 동안 몇 가지 중요 한 세부 묘사가 언급 될 필요가 있다. 첫째, 허용 하지 않습니다는 그대로 뇌와 뇌 조각 절단 실제 추위에 얼어. 재미를 위한 두뇌 < 2 분은 충분 한 마우스 뇌의 작은 크기를 주어진. 조직 섹션 해야 전송 즉시 버퍼 용지함에서 실내 온도에 헹 구는 비 커. 절단을 rinsing 실제 그렇지 않으면 높은 자당 농도 뇌 조각 지주 챔버의 나일론 메쉬에 충실 할 것입니다 매우 중요 하다. 효과적으로 조직 린스, 그것이 지나치게 지주 실제를 오염 하지 있도록 전송 피 펫 내에서 절단 실제 콘텐츠를 최소화 하기 위해 중요 합니다. 2 단계 rinsing 오염 최소화에 에이즈. 완료 되 면 잘리는 절차, 조직 섹션 해야 전송 즉시 헹 구는 비 커에서 지주 챔버, 어디 부드러운 나일론 메쉬 정지 도중 실제 양쪽 모두에 조직의 산소 수 지주에. 조각화 절차에 따라 모든 단계에서 동일한 원리를 적용 한다: 두뇌 분할 한다 결코 비 커의 하단에, 그들은 지주 챔버의 측면 접촉 해서는 안 앉아서 그들은 결코 서로 접촉 해야도 오버랩.

수정 및 문제 해결:

실제 구성 실험의 필요에 따라 수정할 수 있습니다. 예를 들어 약물의 특정 신경 전달 물질 또는 이온 채널 전기 neuromodulation의 효능에 기여를 해 부를 추가할 수 있습니다. 또한, pyruvic 및 의약품 (cf. 표 2) 생략할 수 있습니다, 비록 우리가 그들은 강력한 신경 역할 발휘 찾을. 우리 보고 표 3 이 프로토콜에 그들과 함께 처리 하는 방법을 발생할 수 있는 가장 일반적인 문제.

결론:

MEA 녹음은 의심할 여 지 없이 건강 및 질병에 신경 네트워크의 상호 작용을 해결 하기 위해 귀중 한 기술입니다. 약리 연구 이외에 간 질 및 다른 신경 성 질환에 적용 하는 DBS와 관련 된 전기 neuromodulation 프로토콜 평가 가능 하다. 이 프로토콜에서 우리는 그것이 기존의 extracellular 필드 잠재적인 녹음으로 얻은 그 비슷한 결과 함께 전형적인 정기적인 자극 실험을 재현 가능 하 고 외부 전극을 자극 것으로 나타났습니다. 상업 사용자 친화적인 장비 및 고급 소프트웨어 툴의 증가 가용성 MEA 녹음 기술 또한 폐쇄 루프 자극 실험, 뇌 조직 하 고 임시 자극을 제공 하기에 적합 하 게 신경 네트워크 응답을 피드백 메커니즘의 기여를 조사 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
폴리-D-라이신	MEA 코팅에 필요한	Sigma-Adrich	P7886
NaCl	Sigma-Adrich	S9888	화학 물질
KCl	Sigma-Adrich	P9541	화학
KH2PO4	Sigma-Adrich	795488	화학
CaCl2*2 H2O	Sigma-Adrich	C3306	화학
-포도	Sigma-Adrich	RDD016	화학
NaHCO3	Sigma-Adrich	S5761	화학
MgCl2*6 H2O	Sigma-Adrich	M2670	화학
MgSO4*6 H2O	Sigma-Adrich	M5921	화학
설탕	시그마-애드리치	RDD023	화학
피루브산, 98%	Sigma-Adrich	107360	화학
4-아미노피리딘	Sigma-Adrich	A78403	경련제
STG-2004	다채널 시스템	STG4004-1.6mA	4채널 자극 발생기 전압 (± 8 V) 및 전류 출력(± 1.6mA)
MEA1060	멀티채널 시스템	N/A	MEA 앰프
평면 MEA	멀티채널 시스템	60MEA500/30iR-Ti(링 없음	맞춤형 녹음실을 사용하려면 링이 없어야 합니다.
McRack	멀티채널 시스템		녹음 소프트웨어
McStimulus II	멀티채널 시스템		STG4004 제어 소프트웨어
TC02	다채널 시스템	TC02	2-채널 온도조절기
PH01	다채널 시스템	PH01	가열 관류 캐뉼라
MPH	멀티채널 시스템	MPH	PH01 및 흡입 바늘용 마그네틱 홀더
Elastostil E43	Wacker	E43	엘라스토머 실란트는 MEA
MEA 맞춤형 챔버	Crisel Instrument	SKE-챔버 MEA	맞춤형 녹음 챔버
Ag/AgCl 전극, 펠릿, 1.0 mm	Crisel Instrument	64-1309	커스텀 레코딩 챔버용 기준 전극
Tergazyme	Sigma-Adrich	Z273287-1EA	효소 세척기
MATLAB	The Mathworks		전극 매핑을 위한 프로그래밍 환경
VT1000S	Leica Biosystems	VT1000S	Vibratome
	Warner Instruments	64-1309	Ag-AgCl 전극 펠릿 1.0mm(E205). 참조 전극.