방법 논문

루트 미생물 탐색: 토양, Rhizosphere, 및 루트 Endosphere에서 세균성 지역 사회 데이터 추출

DOI:

10.3791/57561

⸱

2018년 5월 2일

 ,  ,  , 
1Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley, 2Plant Gene Expression Center, USDA ARS

이 논문에서

요약

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여기, 우리는 토양, rhizosphere, 및 루트 endosphere microbiomes amplicon 시퀀스 데이터를 얻기 위해 프로토콜을 설명 합니다. 이 정보 구성 및 플랜트 관련 미생물 커뮤니티의 다양성을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다 그리고 다양 한 종의 식물 사용에 적합.

초록

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공장 호스트와 관련 된 미생물의 친밀 한 상호작용 공장 피트 니스, 결정에 중요 한 이며 abiotic 스트레스와 질병을 향상 된 공차를 육성 하실 수 있습니다. 매우 복잡 한, 낮은-비용 식물 미생물 수, 16S rRNA 유전자의 amplicon 기반 시퀀싱 등 높은 처리량 방법의 미생물 조성과 다양성 특성화에 대 한 선호 많습니다. 그러나, 이러한 실험을 실시 하는 경우 적절 한 방법론의 선택이 어려운 분석 및 샘플 연구 사이의 비교를 만들 수 있는 편견을 감소 시키기를 위해 중요 합니다. 이 프로토콜 수집 및 토양, rhizosphere, 및 루트 샘플에서 DNA 추출에 대 한 표준화 된 방법론을 세부 사항에 설명합니다. 또한, 우리이 샘플에서 세균성 지역 사회 구성의 탐사를 허용 하는 기초가 튼튼한 16S rRNA amplicon 시퀀싱 파이프라인을 선택 하 고 다른 마커 유전자에 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 파이프라인 식물 종, 사탕수수, 옥수수, 밀, 딸기, 그리고 용 설 란, 등의 다양 한 검증 되었습니다 그리고 식물 세포에서 오염과 관련 된 문제를 극복 하는 것을 도울 수 있다.

서론

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역동적이 고 복잡 한 미생물 지역 사회 박테리아, archaea, 바이러스, 곰 팡이, 그리고 다른 진 핵 미생물의 구성 식물 관련 된 microbiomes에 의하여 이루어져 있다. 식물 질병의 원인에 그들의 잘 공부 역할, 식물 관련 미생물도 긍정적인 영향을 미칠 수 식물 건강 biotic 및 abiotic 스트레스에 내성 개선 하 고, 양분 가용성, 홍보 강화 통해 식물 성장 여 phytohormones의 생산입니다. 이러한 이유로, 특정 관심 taxa 식물 루트 endospheres, rhizospheres, 및 주위 토양 연관 특성화에 존재 합니다. 일부 미생물 실험실 생성 된 미디어에 고립에서 경작 될 수 있다, 하는 동안 많은 수 없습니다, 그들은 다른 미생물과 공생 관계에 따라 달라질 수 있기 때문에 일부 매우 느리게 성장 또는 랩 환경에서 복제 될 수 없는 조건을 요구. 때문에 재배에 대 한 필요를 circumvents 상대적으로 저렴 하 고 높은 처리량, 되었다 환경 및 호스트 관련 미생물 샘플 프로 파일링 계통 발생 시퀀스 기반 미생물 커뮤니티 시 금 선호 하는 방법 구성입니다.

차세대 시퀀싱 (NGS) 플랫폼1 다양 한에서 제공 하는 적절 한 시퀀싱 기술의 선택은 사용자의 요구에 ....

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프로토콜

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1. 수집 및 루트 Endosphere, Rhizosphere, 및 토양 샘플의 분리

  1. 이전에 소독을 필드, 압력솥 초순 (샘플 당 물 90 mL 이상)를 입력 합니다. KH2포46.75 g, 8.75 g의 K2HPO4, 살 균 물 1 l 트라이 톤 X-100의 1 mL를 추가 하 여 epiphyte 제거 버퍼 (샘플 당 적어도 25 mL)를 준비 합니다. 0.2 µ m 기 공 크기와 진공 필터를 사용 하 여 버퍼를 소독.
    1. 1.2 ~ 1.5 단계, 모든 에탄올 소독 깨끗 한 장갑을 착용 시간 하 고 오염을 방지 하기 위해 각 샘플 사이의 장갑 바꿉니다. 70% 에탄올과 모든 장비를 소독 하 고 깨끗 하 게 닦아 샘플 사이의 모든 장비. 샘플링, 전에 실험에 대 한 최적의 샘플링 깊이 결정 하 고 모든 토양 및 루트 컬렉션와 일치.
  2. 대량 토양 샘플을 수집 하기를 사용 하 여 에탄올 소독 토양 코어 수집기는 코어를 수집 하 여 식물의 뿌리는 토양 식물의 기지에서 약 23 ~ 30 cm.
  3. 비닐 봉지에 토양을 전송 하 고 부드러운 떨고 하 여 토양을 균질 한 2 mL 튜브를 채우기 위해 토양 샘플 (약 600 밀리 그램)의 약 수를 ....

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결과

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일치 하는 각 샘플을 다시 하 고 어느 박테리아에 할당 될 수 있는 인덱싱된 쌍 간 읽기의 데이터 집합에서 발생 해야 권장된 프로토콜을 수행 조작 상 분류학 단위 (OTU) 또는 정확한 시퀀스 변종 (ESV, amplicon 라고도 시퀀스 변종 (ASV) 및 sub-operational 분류학 단위 (sOTU)), 다운스트림 분석에 따라. 높은-품질 시퀀스 데이터를 얻으려면 해야 합니다 주의 샘플 간에 일관성을 유지 샘플 처리 또는 라이브러리 준비 하는 동안 어떤 잠재적인 편견의 도입을 최소화 하 고 각 단계에서. 수집, 처리, 및 (1 단계와 2 단계), 샘플에서 DNA를 추출 결과 eluate 표시 명확 하 고 증폭을 억제 하는 생명체의 무료 됩니다. Microvolume 분 광 광도 계를 통해 각 DNA 샘플을 측정 하 여 순도 확인할 수 있습니다, 하는 동안 우리 토양 DNA 추출 키트 안정적으로 모든 오염 물질을 제거 하는 것이 나타났습니다. 예측 가능한 DNA.......

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토론

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이 프로토콜에서는 루트 endosphere, rhizosphere, 및 샘플 처리 및 다운스트림 시퀀싱 필드 샘플링에서 토양 미생물 지역 사회 구성에 대 한 설립된 파이프라인을 보여 줍니다. 공부 루트 관련 microbiomes 선물 독특한 도전, 인해 일부 샘플링에서 고유한 어려움에 토양에서. 토양은 매우 변수 육체 및 화학 재산의 점에서 그리고 다른 토양 조건 만큼 약간 몇 밀리미터28,29에 의해 분리 될 수 있다. 이 상당히 다른 미생물 커뮤니티 구성 및 활동30,31인접 한 샘플링 사이트에서 수집 되는 샘플 발생할 수 있습니다. 따라서, 사용 하 여 토양 코어 수집과 삽 유지 일관 된 샘플링 깊이 이전 DNA 추출 균질 루트 미생물 연구에서 재현성에 필수적입니다. 그것은 또한 rhizosphere 및 루트 분수;.......

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공개 사항

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저자는 공개 없다.

감사의 글

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이 작업은 농 무부-ARS (CRI 2030-21430-008-00D)에 의해 투자 되었다. TS는 NSF 대학원 연구 친교 프로그램에 의해 지원 됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.1-10/20 &마이크로; L 여과 마이크로 피펫 팁USA Scientific1120-3810다른 공급 업체와 동등한 것으로 대체 할 수 있습니다.
1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브USA Scientific1615-5510다른 공급업체와 동등한 것으로 대체할 수 있습니다.
10 & 마이크로; L 멀티 채널 피펫Eppendorf3122000027다른 공급업체와 동등한 제품으로 대체할 수 있습니다.
10 & 마이크로; L, 100 &마이크로; L 및 1000 µ L 마이크로피펫Eppendorf3120000909다른 공급업체의 동급으로 대체할 수 있습니다.
100 &마이크로; L 멀티 채널 피펫Eppendorf3122000043다른 공급업체와 동등한 제품으로 대체할 수 있습니다.
1000 &마이크로; L 여과된 마이크로피펫 팁USA Scientific1122-1830다른 공급업체와 동등한 것으로 대체할 수 있습니다.
2 mL 마이크로 원심분리기 튜브USA Scientific1620-2700다른 공급업체의 동급으로 대체할 수 있습니다.
2mm 토양 체임업 공급 업체60141009다른 공급 업체와 동등한 것으로 대체 할 수 있습니다.
200 &마이크로; L 여과 마이크로 피펫 팁USA Scientific1120-8810다른 공급 업체와 동등한 것으로 대체 할 수 있습니다.
25 mL 저장용기VWR International LLC89094-664다른 공급업체와 동등한 것으로 대체할 수 있습니다.
50 mL 코니컬 바이알Thermo Fisher Scientific352098다른 공급업체의 동급으로 대체할 수 있습니다.
500mL 진공 필터(0.2 &마이크로; m pore size)VWR International LLC156-4020
96-well microplatesUSA Scientific655900
96-well PCR platesBioRadHSP9631
Agencourt AMPure XP beadsThermo Fisher ScientificNC9933872사용 설명서:
https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180
&documentName=B37419AA.pdf
알루미늄 호일Boardwalk7124다른 공급업체와 동등한 것으로 대체할 수 있습니다.
0.001g 해상도의 분석 저울Ohaus PioneerPA323다른 공급업체의 동급으로 대체할 수 있습니다.
Bioruptor Plus 초음파 발생기DiagenodeB01020001
소 혈청 알부민 (BSA) 20 mg/mLNew England BiolabsB9000S
원심분리기Eppendorf581100090850mL 및 96웰 플레이트 버킷 어댑터 포함
극저온 장갑Millipore SigmaZ183490다른 공급업체의 동급 제품으로 대체할 수 있습니다.
DNeasy PowerClean 키트(옵션)Qiagen Inc.12877-50이전 MoBio
DNeasy PowerSoil 키트Qiagen Inc.12888-100이전 MoBio
드라이 아이스모든NA
DynaMag-2 자석Thermo Fisher Scientific12321D로 대체하지 마십시오
VWR International LLC89125-188다른 공급 업체와 동등한 것으로 대체 할 수 있습니다.
갤런 크기의 냉동 백ZiplocNA다른 공급 업체의 동급으로 대체 할 수 있습니다.
Gemini EM 마이크로플레이트 리더Molecular DevicesEM상단에서 96웰 플레이트를 판독하는 다른 형광계를 사용할 수 있습니다.
K2HPO4Sigma-AldrichP3786
KH2PO4Sigma-AldrichP5655
Lab coatWorkriteJ1367다른 공급업체의 동급 제품으로 대체할 수 있습니다.
Liquid N2AnyNA는 다른 공급업체와 동등한 것으로 대체할 수 있습니다.
액체 N2 듀어Thermo Fisher Scientific4150-9000다른 공급업체의 동급 제품으로 대체할 수 있습니다.
Milli-Q 초순수 정화 시스템Millipore SigmaSYNS0R0WW
미니 원심분리기Eppendorf5404000014
분자 등급 정제수Thermo Fisher Scientific4387937다른 공급업체의 동급 제품으로 대체할 수 있습니다.
MortarsVWR International LLC89038-150다른 공급업체와 동등한 것으로 대체할 수 있습니다.
니트릴 장갑Thermo Fisher Scientific19167032B다른 공급업체와 동등한 것으로 대체할 수 있습니다.
종이 타월VWR International LLCBWK6212다른 공급 업체와 동등한 것으로 대체 할 수 있습니다.
PCR 플레이트 밀봉 필름Thermo Fisher ScientificNC9684493
PCR 스트립 튜브USA Scientific1402-2700
유봉VWR International LLC89038-166다른 공급업체와 동등한 것으로 대체할 수 있습니다.
플라스틱 주걱LevGo, Inc.17211
Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x)Thermo Fisher Scientific13000014
PNA - 엽록체 및 미토콘드리아PNA BioNA생물정보학
보호 안경Millipore SigmaZ759015다른 공급업체와 동등한 제품으로 대체할 수 있습니다.
Qubit 3.0 형광측정기Thermo Fisher ScientificQ33216
Qubit dsDNA HS 분석 키트Thermo Fisher ScientificQ32854
고무 망치(옵션)Ace 하드웨어2258622다른 공급업체의 동급 제품으로 대체할 수 있습니다.
가위 또는 가위VWR International LLC89259-936다른 공급 업체와 동등한 것으로 대체 할 수 있습니다.
ShovelHome Depot2597400다른 공급업체와 동등한 것으로 대체할 수 있습니다.
토양 코어 수집기 (소경 : < 1 인치)Ben Meadows221700다른 공급 업체와 동등한 것으로 대체 할 수 있습니다.
스프레이 병Santa Cruz Biotechnologysc-395278다른 공급 업체와 동등한 것으로 대체 할 수 있습니다.
표준 탈염 바코드 프라이머(10 µ M) (표 1)IDTNA4 nmole Ultramer DNA Oligo, 표준 탈염. NGS 어댑터 및 염기서열분석 프라이머(표 1)는 v3 화학을 사용하여 Illumina MiSeq와 함께 사용하도록 설계되었습니다.
ThermocyclerThermo Fisher ScientificE950040015다른 공급업체와 동등한 제품으로 대체할 수 있습니다.
Triton X-100Sigma-AldrichX100다른 공급업체와 동등한 것으로 대체할 수 있습니다.
계량 보트Spectrum ChemicalsB6001W다른 공급업체와 동등한 것으로 대체할 수 있습니다.
은 에탄올는 , , , , 은 는

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17 (6), 333-351 (2016).
  2. Soergel, D. A. W., Dey, N., Knight, R., Brenner, S. E. Selection of primers for optimal taxonomic cl....

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16S rRNADNAPCRDNA

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