Method Article

루트 미생물 탐색: 토양, Rhizosphere, 및 루트 Endosphere에서 세균성 지역 사회 데이터 추출

DOI:

10.3791/57561

⸱

May 2nd, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley, 2Plant Gene Expression Center, USDA ARS

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기, 우리는 토양, rhizosphere, 및 루트 endosphere microbiomes amplicon 시퀀스 데이터를 얻기 위해 프로토콜을 설명 합니다. 이 정보 구성 및 플랜트 관련 미생물 커뮤니티의 다양성을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다 그리고 다양 한 종의 식물 사용에 적합.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

공장 호스트와 관련 된 미생물의 친밀 한 상호작용 공장 피트 니스, 결정에 중요 한 이며 abiotic 스트레스와 질병을 향상 된 공차를 육성 하실 수 있습니다. 매우 복잡 한, 낮은-비용 식물 미생물 수, 16S rRNA 유전자의 amplicon 기반 시퀀싱 등 높은 처리량 방법의 미생물 조성과 다양성 특성화에 대 한 선호 많습니다. 그러나, 이러한 실험을 실시 하는 경우 적절 한 방법론의 선택이 어려운 분석 및 샘플 연구 사이의 비교를 만들 수 있는 편견을 감소 시키기를 위해 중요 합니다. 이 프로토콜 수집 및 토양, rhizosphere, 및 루트 샘플에서 DNA 추출에 대 한 표준화 된 방법론을 세부 사항에 설명합니다. 또한, 우리이 샘플에서 세균성 지역 사회 구성의 탐사를 허용 하는 기초가 튼튼한 16S rRNA amplicon 시퀀싱 파이프라인을 선택 하 고 다른 마커 유전자에 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 파이프라인 식물 종, 사탕수수, 옥수수, 밀, 딸기, 그리고 용 설 란, 등의 다양 한 검증 되었습니다 그리고 식물 세포에서 오염과 관련 된 문제를 극복 하는 것을 도울 수 있다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

역동적이 고 복잡 한 미생물 지역 사회 박테리아, archaea, 바이러스, 곰 팡이, 그리고 다른 진 핵 미생물의 구성 식물 관련 된 microbiomes에 의하여 이루어져 있다. 식물 질병의 원인에 그들의 잘 공부 역할, 식물 관련 미생물도 긍정적인 영향을 미칠 수 식물 건강 biotic 및 abiotic 스트레스에 내성 개선 하 고, 양분 가용성, 홍보 강화 통해 식물 성장 여 phytohormones의 생산입니다. 이러한 이유로, 특정 관심 taxa 식물 루트 endospheres, rhizospheres, 및 주위 토양 연관 특성화에 존재 합니다. 일부 미생물 실험실 생성 된 미디어에 고립에서 경작 될 수 있다, 하는 동안 많은 수 없습니다, 그들은 다른 미생물과 공생 관계에 따라 달라질 수 있기 때문에 일부 매우 느리게 성장 또는 랩 환경에서 복제 될 수 없는 조건을 요구. 때문에 재배에 대 한 필요를 circumvents 상대적으로 저렴 하 고 높은 처리량, 되었다 환경 및 호스트 관련 미생물 샘플 프로 파일링 계통 발생 시퀀스 기반 미생물 커뮤니티 시 금 선호 하는 방법 구성입니다.

차세대 시퀀싱 (NGS) 플랫폼1 다양 한에서 제공 하는 적절 한 시퀀싱 기술의 선택은 사용자의 요구에 따라 포함 하는 중요 한 요소: 원하는 범위, amplicon 길이, 예상 커뮤니티 다양성, 뿐만 아니라 오류 속도, 읽기-길이, 그리고는 비용-당-실행/megabase 시퀀싱. Amplicon 기반 시퀀싱 실험에서 고려 되어야 또 다른 변수 어떤 유전자 증폭 될 것 이며 어떤 뇌관을 사용 됩니다. 때 설계 또는 뇌관을 선택, 연구 결과 amplicons에서 달성 증폭의 보편성과 분류학 해상도 간의 절충이 종종 밖에 없습니다. 이러한 이유로 이러한 유형의 연구는 자주 뇌관 및 마커는 미생물의 특정 하위 집합을 대상으로 선택적으로 선택 했다. 세균성 지역 사회 구성 평가 연속 하나 이상의 세균의 16S rRNA 유전자2,3의 하이퍼 지역 일반적으로 수행 됩니다. 이 연구에서 설명 하는 기반 하는 amplicon 시퀀싱 프로토콜 NGS 플랫폼에 대 한 충분 한 다양성을 제공 하는 동안 세균 taxa의 넓은 확대를 위한 수 있는 세균의 16S rRNA 유전자의 그 대상 500 bp V3-V4 지역 개발 다른 taxa 사이 구별. 또한,이 프로토콜을 쉽게 다른 뇌관 집합, 버섯의 ITS2 마커 나 진핵생물의 18S rRNA 소 단위를 대상으로 함께 사용 하기 위해 적용할 수 있습니다.

다른 접근 같은 샷건 metagenomics, metatranscriptomics, 및 단일 셀 시퀀싱, 이점이 다른 해결된 미생물 게놈 및 커뮤니티 기능의 더 직접적인 측정을 포함 하 여, 이러한 기술은 일반적으로 더는 비싸고 계통 발생 프로 파일링 보다 계산 집중4여기 설명합니다. 또한, 루트 샘플에 샷건 metagenomics 및 metatranscriptomics을 수행 호스트 식물 게놈에 속하는 읽기의 큰 비율 수 있고이 한계를 극복 하는 방법을 여전히 개발된5,6되 고 있습니다.

어떤 실험 플랫폼와 마찬가지로 amplicon 기반 프로 파일링 하는 것은 실험적인 디자인 및 데이터 분석 하는 동안 고려 되어야 하는 잠재적인 편견의 수를 발생할 수 있습니다. 샘플 수집, DNA 추출, PCR 뇌관의 선택 및 라이브러리 준비를 수행 하는 방법을 방법을 포함 됩니다. 다른 방법을 생성 하 고, 사용 가능한 데이터의 양을 크게 영향을 미칠 수 고 또한 연구 사이 결과 비교 하는 노력을 방해 수 있습니다. 예를 들어 rhizosphere 박테리아7 와 다른 추출 기술의 사용 또는 DNA 추출 키트8,9 의 선택 제거 하는 방법 표시 되었습니다 크게 영향을 다운스트림 분석에 이르게 이 관한 미생물은 현재와 그들의 상대 나타났는데 되는 다른 결론 프로 파일링 amplicon 기반 사용자 지정할 수 있습니다, 이후 연구에서 비교를 만드는 전하실 수 있습니다. 지구 Microbiome 프로젝트 공장 관련 미생물 같은 복잡 한 시스템을 공부 하는 연구자의 응용 프로그램에 의해 발생 하는 변화를 최소화 하는 수단으로 표준화 된 프로토콜의 개발에서 도움이 될 것 이라고 제안 했다 연구10,11사이 다른 방법. 여기, 우리가 위의 주제의 대부분을 토론 하 고 어디 유용한 제안을 제공 적절 한.

프로토콜 색 사탕수수 에서 추출 DNA 기초가 DNA 분리 키트11를 사용 하 여 수집, rhizosphere, 토양과 루트 샘플 과정을 보여 줍니다. 또한, 우리의 프로토콜 세균성 지역 사회12,,1314의 구조를 결정 하는 일반적으로 이용한 NGS 플랫폼을 사용 하 여 자세한 amplicon 시퀀싱 워크플로 포함 합니다. 이 프로토콜 식물 뿌리, rhizosphere, 및 사탕수수 색, 지 시 메이 스, 그리고 Triticum aestivum15를 포함 하 여 18 monocot 종의 관련 된 토양의 최근 출판된 연구에 호스트의 넓은 범위에서 사용에 대 한 확인 되었습니다. 이 메서드는 또한 검증 된 다른 마커 유전자와 함께 사용 하기 위해 agave 미생물16,17 및 딸기 미생물 의 연구에 곰 팡이 ITS2 마커 유전자를 공부 하 고 그것의 성공적인 응용 프로그램에서와 같이 18.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 수집 및 루트 Endosphere, Rhizosphere, 및 토양 샘플의 분리

  1. 이전에 소독을 필드, 압력솥 초순 (샘플 당 물 90 mL 이상)를 입력 합니다. KH2포46.75 g, 8.75 g의 K2HPO4, 살 균 물 1 l 트라이 톤 X-100의 1 mL를 추가 하 여 epiphyte 제거 버퍼 (샘플 당 적어도 25 mL)를 준비 합니다. 0.2 µ m 기 공 크기와 진공 필터를 사용 하 여 버퍼를 소독.
    1. 1.2 ~ 1.5 단계, 모든 에탄올 소독 깨끗 한 장갑을 착용 시간 하 고 오염을 방지 하기 위해 각 샘플 사이의 장갑 바꿉니다. 70% 에탄올과 모든 장비를 소독 하 고 깨끗 하 게 닦아 샘플 사이의 모든 장비. 샘플링, 전에 실험에 대 한 최적의 샘플링 깊이 결정 하 고 모든 토양 및 루트 컬렉션와 일치.
  2. 대량 토양 샘플을 수집 하기를 사용 하 여 에탄올 소독 토양 코어 수집기는 코어를 수집 하 여 식물의 뿌리는 토양 식물의 기지에서 약 23 ~ 30 cm.
  3. 비닐 봉지에 토양을 전송 하 고 부드러운 떨고 하 여 토양을 균질 한 2 mL 튜브를 채우기 위해 토양 샘플 (약 600 밀리 그램)의 약 수를 전송. 바로 드라이 아이스에 2 mL 튜브 또는 플래시 DNA 추출 (2 단계)와 진행 준비까지 액체 N2 에 튜브를 고정 합니다.
    1. 일부 환경에서는 주위 토양 식물 재료를 포함할 수 있습니다. 이 경우 멸 균된 2 mm 체를 사용 하 여 비닐 봉투에서 그것을 배치 하기 전에 토양에서 식물 파편을 분리.
  4. 루트 및 rhizosphere 수집, 많은 가능한 루트를 돌보는 공장을 발굴 하는 에탄올 소독 삽을 사용 합니다. 깊이 식물에 따라 달라 집니다. 반면 밀 등 작은 식물 사탕수수 30 cm 이상 필요할 수 있습니다와 같은 몇몇 센티미터, 더 큰 식물을 파고에 의해 제거할 수 있습니다. 루트 표면에 고착 하는 토양의 약 2 m m까지 부드럽게 뿌리에서 과잉 토양을 흔들어.
    참고: 작은 식물, 연약한 뿌리, 또는 건조 하 고, 높은 점토 콘텐츠 토양에서 작업할 때는 주의 합니다. 이상적으로,만 동요 후에 뿌리에 남아 있는 흙의 얇은 층 이어야 한다. 토양의 큰 집계 남아 있으면 부드럽게 촬영의 기지를 타격 하 여 토양을 꺼내 려 고무 망치를 사용할 수 있습니다. 경우 토양이이 과정 후 남은 금액을 초과 하거나 2 mm의 짧은 폭포, 대략 두께 지적 한다.
  5. 큰 식물에 대 한 뿌리의 대표적인 하위 섹션을 잘라 하 고 루트 조직의 500 밀리 그램의 최소 50 mL 원뿔 유리병을 소독가 위 또는 위를 사용 합니다. 작은 잔디에 대 한 유리병에 전체 루트 시스템을 배치. 플래시 동결 액체 N2샘플 또는 뿌리를 커버 다음 즉시 샘플 드라이 아이스에 충분 한 epiphyte 제거 버퍼를 추가 합니다.
    참고: 주의 하지 연극 50 mL 원뿔 유리병 세척 단계를 어렵게 만들 것입니다 그것으로. Epiphyte 버퍼가 바닥에 흐름, 유리병, 내내 뿌리를 둘러싸고 상단 커버 하는 충분 한 빈 공간이 이어야 한다. 일부 잔디 때문에 50 mL 원뿔 유리병에 맞는 것 보다 더 많은 루트 바이오 매스, 뿌리의 일부를 수집 해야 합니다. 그러나, 그것은 주목 해야한다 endophytic 박테리아 rhizosphere 분수에 밖으로 세척 되 고 이어질 수 뿌리 절단, 그래서 뿌리를 파괴를 최소화 한다. 샘플 랩 귀국 후 즉시 처리 되지 않습니다, 그들은 수 저장-80 ° c.에
  6. 뿌리에는 rhizosphere 구분, 얼음, 루트 샘플을 녹여 다음 160 W 30의 펄스와 10 분 동안 4 ° C에서 루트 샘플 sonicate 냉장된 (4 ° C)에 뿌리 30 미 전송으로 구분 s, 소독 집게를 사용 하 여 50 mL 튜브 청소. 버퍼와 토양, rhizosphere 분수 (그림 1)은 원래 튜브를 폐기 하지 마십시오.
  7. 포함 하는 버퍼 튜브 원심 및 rhizosphere 4000 x g. Decant 상쾌한, 4 ° C에서 10 분 플래시 동결 튜브 액체 N2에서 rhizosphere 분수를 포함 하 고 DNA와 진행 준비까지-80 ° C에서 rhizosphere 분수를 저장 추출 (2 단계)입니다.
  8. 뿌리를 씻어, 루트 분수를 냉장된 (4 ° C) 살 균 물의 약 20 mL를 추가 합니다. 적극적으로 (또는 의해 핸드 믹서, 15-30 s), 떨고 하 여 루트를 세척 하 고 물을 배수.
  9. 아무 토양도 루트 표면에 남아 때까지이 단계를 두 번 이상 반복 합니다. DNA 추출 (2 단계)는 즉시 수행 되지 않습니다, 뿌리 소독 알루미늄 호 일에 포장, 플래시 동결 액체 N2, 그리고 저장소-80 ° c까지 샘플 DNA 추출 진행 준비에 뿌리.

2. DNA 추출

참고: 단계 2와 3 단계를 통해 에탄올으로 소독 하는 깨끗 한 장갑 착용 한다 항상 고 에탄올으로 소독 하는 표면에 모든 작업을 수행 해야 합니다.

  1. 토양 및 rhizosphere 샘플에서 DNA를 추출 합니다.
    1. 사용 하 여 신속 하 게 별도 컬렉션 튜브로 1.3, 1.7 단계에서 토양 및 rhizosphere의 250 밀리 그램을 전송 하는 메 마른 주걱 상업 DNA 분리 키트에 제공 된 토양에서 추출 설계 다음 DNA 절연 키트 공급 업체를 사용 하 여 진행 프로토콜입니다.
    2. 방출 후 DNA 분리 kit에서 제공 하는 차입 버퍼에서 DNA 준비 3 단계 진행까지-20 ° C에서 DNA를 저장 합니다.
  2. 루트 샘플에서 DNA를 추출 합니다.
    1. 진정 소독된 박격포와 유 봉 액체 N2를 사용 하 여. 루트 조직의 600 700 mg에 밖으로 측정 하 고 박격포 조직을 넣습니다. 조심 스럽게 뿌리를 충당 하기 위해 충분 한 액체 N2 를 추가 합니다.
    2. 작은 조각으로 뿌리를 갈아. 액체 N2 를 추가 하 고 연 삭 과정을 계속 (적어도 두 번 샘플 사이 일관 되), 뿌리는 좋은 분말까지. 루트 조직이이 단계 동안 재개 하지 않습니다 확인 합니다.
      주의: 적절 한 개인 보호 장비 (연구실 코트와 극저온 장갑, 보호 안경,) 때 사용 액체 N2를 사용.
      참고: 낮은-품질 DNA 추출에 대 한 도움이 될 수 초과 뿌리 분말으로 갈아 분말-80 ° c.에 저장 하
    3. 신속 하 게, 루트 전에 분말 동, 메 마른 주걱을 사용 하 여 얼음에 미리 무게 1.5 mL 튜브에 루트 파우더를 전송 하기 시작 합니다. 튜브와 파우더의 무게를 기록 합니다. 일반적으로 300-400 mg 분말의 전송 됩니다.
    4. 신속 하 게 상용 DNA 분리 키트에 제공 된 컬렉션 튜브를 루트 파우더의 150 밀리 그램을 전송 하는 메 마른 주걱을 사용 하 여 토양에서 추출 설계 다음 DNA 절연 키트 공급 업체의 프로토콜을 사용 하 여 진행 합니다.
      참고: 일부 루트 샘플에 대 한 있을 수 있습니다 유기 물이 PCR, 특히 때 다른 DNA 추출 프로토콜 중 DNA의 확대를 방지 DNA 펠 릿에 남아의 높은 농도 (예., CTAB 추출) 사용 됩니다. 필요한 경우 환경 DNA 정리 키트에 제공 된 지침에 따라 DNA를 청소.
  3. 고감도 벤치탑 fluorometer를 사용 하 여 모든 DNA 샘플의 농도 측정 합니다.
    1. 튜브 dsDNA 높은 민감도 분석 결과 키트에 제공 된 각 eluted DNA 샘플의 1-20 µ L를 추가 합니다. 200 µ L까지 fluorometer 작업 솔루션 (1: 200 염료: 버퍼)를 추가 합니다.
    2. 표준 2 (100 ng / µ L)의 DNA 표준 1 (0 기 / µ L DNA) 또는 10 µ L의 10 µ L을 포함 하는 두 개의 추가 튜브를 준비 하 고 각 표준 fluorometer 작업 솔루션의 190 µ L를 추가 합니다.
    3. 표준 및 각 샘플의 농도 측정 합니다. 자동으로 수행 하지, DNA 농도 흡 광도 출력에서 두 개의 표준 선형 회귀 계산 합니다.

3. Amplicon 라이브러리 준비 및 제출

  1. 증폭 반응에 대 한 자료를 설정 합니다.
    1. 4 ° C에서 DNA 샘플을 해 동 하 고 3 단계에 걸쳐 얼음에 그들을 유지. PCR (표 2)에 위치 편견을 최소화 하기 위해 DNA 샘플의 순서를 임의화
    2. 96-잘 PCR 접시에 희석 DNA 분자 급 물에 각 샘플에서 20 µ L. 추가 20 µ L 분자 급 물 4 코너 웰 스의 총 볼륨에서 5 ng / µ L에 확대 (공백) (표 2)에 대 한 부정적인 컨트롤.
    3. 다중 채널 피 펫 (그림 2)와 함께 추가할 수 있습니다 그런 바코드 뇌관 (10 µ M) PCR 스트립 튜브 또는 96 잘 접시에 배열.
    4. 3 중에서 각 DNA 샘플을 증폭 하는 충분 한 PCR 마스터 믹스를 준비 합니다. BSA (20 mg/mL)의 1.5 µ L, 미리 만든 2 마스터 믹스 (PCR 버퍼, MgCl2, dNTPs, Taq DNA 중 합 효소의 구성된) x 37.5 µ L, 엽록체 PNA의 0.57 µ L를 준비 (100 µ M), 미토 콘 드 리아 PNA의 0.57 µ L (100 µ M), 그리고 분자 학년 물 25.86 µ L.
    5. 멀티 채널 피 펫 저수지의 메 마른 25 mL로 마스터 믹스와 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 새로운 96-잘 PCR 플레이트의 각 음에 마스터 믹스의 66 µ L를 배포.
      참고: 마스터 믹스에 대 한 시 볼륨을 계산할 때 또한 접시 당 4 빈 우물을 포함 있는지 확인 합니다.
    6. 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 5 ng / µ L 마스터 믹스 플레이트 (표준화 된 DNA 접시)에서 DNA의 6 µ L를 추가 합니다. 각 열에 다른 앞으로 바코드 및 1.5 µ L 10 µ M의 각 행에는 다른 역방향 바코드 (그림 2)는 뇌관을 반대는 10 µ M 앞으로 뇌관의 마스터 플레이트 1.5 µ L에 추가 합니다.
      참고: 프라이 머를 추가 하기 전에 무작위로 접시와 마스터 혼합 사용 될 수 다른 뇌관 추가 된 경우 ITS 또는 ITS2 곰 팡이 유전자를 증폭 하는. 이 경우 유사한 뇌관 디자인을 사용할 수 있습니다.
    7. 3000 x g.에서 짧게 접시 아래로 회전 부드럽게, 혼합 후 반응 혼합물의 25 µ L 3 접시로 분할 다중 채널 피 펫을 사용 합니다.
      참고: 세 개의 복제는 엄격 하 게 필요 하지 않습니다, 비록 그것은 기술 변화의 영향 감소.
  2. Thermocycler 다음과 설정을 사용 하 여 각 접시에서 DNA를 증폭: 180 s 98 ° C에, 30의 주기: 45 98 ° C s (변성 시키기), 78 ° C 10 s (PNA 어 닐 링), 55 ° C 60 s (뇌관 어 닐 링), 그리고 72 ° C 90에 대 한 s (확장) 다음 600 72 ° c에서 4 ° c s 보유 단계. 증폭, 후 한 단일 96 잘 접시에 세 가지 복제 판 풀.
  3. 96 잘 접시 리더에서 고감도 fluorometer 시 약을 사용 하 여 DNA를 계량.
    1. Fluorometer 작업 솔루션 (1: 200 염료: 버퍼)의 98 µ L 함께 96-잘 microplate에 각 PCR 제품의 2 µ L를 추가 합니다. 표준으로 4 우물을 포함: 5 µ L의 DNA 표준 1 (0 기 / µ L DNA), 표준 2 (10 ng / µ L)의 1 µ L, 2 µ L의 표준 2 (20 ng / µ L), 및 표준 2 (50 ng / µ L)의 5 µ L. Fluorometer 100 µ L의 최종 볼륨에 대 한 작업 솔루션을 추가 합니다.
      참고: 각 샘플 수 측정 단계에서 설명한 2.3 플레이트 리더를 사용할 수 없는 경우에 벤치탑 fluorometer를 사용 하 여.
    2. 4 개의 표준 선형 회귀 하 여 흡 광도 출력에서 DNA 농도 계산 합니다.
    3. 성공적으로 증폭 된 바코드에 대 한 제품 (그 농도 15 ng / µ L 보다 큰), 수영장 100 단일 1.5 mL 튜브 (표 2)에 각 샘플의 ng.
    4. 스프레드시트 프로그램에서 =AVERAGE() 함수를 사용 하 여 풀에 추가 하는 샘플의 평균 볼륨을 계산 합니다. 풀링된 샘플에 "빈" PCR 제품의 볼륨을 추가 합니다.
      참고: "공백" PCR 제품 그들의 자신의 고유한 바코드 조합 때문에, 그들은 수 수 시퀀싱 어떤 실험실 오염 물질에 대 한 확인.
  4. DNA의 단계, 2.3과 걸릴 600에 설명 된 대로 벤치탑 fluorometer를 사용 하 여 풀링된 제품의 농도 측정 하 고 1.5 mL 튜브에 100 µ L의 최종 볼륨을 분자 수준의 물에 희석. -20 ° c.에 나머지 풀링된 제품 저장
  5. 몇 가지 예외와 함께 96-잘 형태로 상자성 정화 구슬과 설립된 PCR 정화 과정에 따라 600 ng DNA aliquot 세척.
    1. 신선한 600 µ L 70% 에탄올의 aliquot 확인 합니다. 다시 바닥에 침전 하는 구슬 중단 자석 구슬의 병을 흔들어.
    2. DNA의 600 ng 약 수를 구슬 솔루션의 1 x 볼륨 (100 µ L)를 추가 합니다. 10 번 pipetting으로 철저 하 게 혼합. 실 온에서 5 분 동안 품 어.
    3. 마그네틱 스탠드 2 분 (또는 때까지 솔루션은 분명 하다)에 튜브를 놓고 비즈 솔루션에서 분리. 여전히 마그네틱 스탠드에서에서 튜브를 실행 하는 동안 자석 구슬, 건드리지 않고 맑은 상쾌한을 신중 하 게 발음 하 고 맑은 상쾌한 삭제.
      참고:이 시점에서, amplicon 제품에 바인딩됩니다 자석 구슬. 방해 또는 동안 포부는 어떤 구슬 DNA의 손실이 발생 합니다.
    4. 마그네틱 스탠드에 튜브를 두고 관;에 70% 에탄올의 300 µ L를 추가 에탄올 및 삭제 30 s. Aspirate에 대 한 실 온에서 품 어. 이 과정을 반복 하 고 두 번째 세척 후 모든 에탄올을 제거 합니다. 마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거 하 고 5 분 동안 건조 한 공기.
    5. 말린된 구슬에 분자 급 물 30 µ L을 추가 하 고 10 번 pipetting으로 혼합. 비즈 솔루션에서 분리 하는 2 분 1 분 마그네틱 스탠드에 반환 튜브에 대 한 실 온에서 품 어. 새로운 튜브는 eluate 전송.
      참고: 자석 구슬 다운스트림 반응 영향을 주지 않습니다.
  6. 청소, 2.3 단계에서 설명한 대로 벤치탑 fluorometer를 사용 하 여 풀링된 DNA의 최종 농도 측정 합니다. 10 약 수를 희석 농도에 또는 30 µ L의 최종 볼륨 및 볼륨 시퀀싱 시설 선호 nM.
  7. NGS 플랫폼, 300 bp 쌍-엔드 시퀀싱 x 2에 DNA 시퀀싱 하는 시퀀싱의 서비스를 활용 합니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

일치 하는 각 샘플을 다시 하 고 어느 박테리아에 할당 될 수 있는 인덱싱된 쌍 간 읽기의 데이터 집합에서 발생 해야 권장된 프로토콜을 수행 조작 상 분류학 단위 (OTU) 또는 정확한 시퀀스 변종 (ESV, amplicon 라고도 시퀀스 변종 (ASV) 및 sub-operational 분류학 단위 (sOTU)), 다운스트림 분석에 따라. 높은-품질 시퀀스 데이터를 얻으려면 해야 합니다 주의 샘플 간에 일관성을 유지 샘플 처리 또는 라이브러리 준비 하는 동안 어떤 잠재적인 편견의 도입을 최소화 하 고 각 단계에서. 수집, 처리, 및 (1 단계와 2 단계), 샘플에서 DNA를 추출 결과 eluate 표시 명확 하 고 증폭을 억제 하는 생명체의 무료 됩니다. Microvolume 분 광 광도 계를 통해 각 DNA 샘플을 측정 하 여 순도 확인할 수 있습니다, 하는 동안 우리 토양 DNA 추출 키트 안정적으로 모든 오염 물질을 제거 하는 것이 나타났습니다. 예측 가능한 DNA...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜에서는 루트 endosphere, rhizosphere, 및 샘플 처리 및 다운스트림 시퀀싱 필드 샘플링에서 토양 미생물 지역 사회 구성에 대 한 설립된 파이프라인을 보여 줍니다. 공부 루트 관련 microbiomes 선물 독특한 도전, 인해 일부 샘플링에서 고유한 어려움에 토양에서. 토양은 매우 변수 육체 및 화학 재산의 점에서 그리고 다른 토양 조건 만큼 약간 몇 밀리미터28,29에 의해 분리 될 수 있다. 이 상당히 다른 미생물 커뮤니티 구성 및 활동30,31인접 한 샘플링 사이트에서 수집 되는 샘플 발생할 수 있습니다. 따라서, 사용 하 여 토양 코어 수집과 삽 유지 일관 된 샘플링 깊이 이전 DNA 추출 균질 루트 미생물 연구에서 재현성에 필수적입니다. 그것은 또한 rhizosphere 및 루트 분수;...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작업은 농 무부-ARS (CRI 2030-21430-008-00D)에 의해 투자 되었다. TS는 NSF 대학원 연구 친교 프로그램에 의해 지원 됩니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.1-10/20 &마이크로; L 여과 마이크로 피펫 팁USA Scientific1120-3810다른 공급 업체와 동등한 것으로 대체 할 수 있습니다.
1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브USA Scientific1615-5510다른 공급업체와 동등한 것으로 대체할 수 있습니다.
10 & 마이크로; L 멀티 채널 피펫Eppendorf3122000027다른 공급업체와 동등한 제품으로 대체할 수 있습니다.
10 & 마이크로; L, 100 &마이크로; L 및 1000 µ L 마이크로피펫Eppendorf3120000909다른 공급업체의 동급으로 대체할 수 있습니다.
100 &마이크로; L 멀티 채널 피펫Eppendorf3122000043다른 공급업체와 동등한 제품으로 대체할 수 있습니다.
1000 &마이크로; L 여과된 마이크로피펫 팁USA Scientific1122-1830다른 공급업체와 동등한 것으로 대체할 수 있습니다.
2 mL 마이크로 원심분리기 튜브USA Scientific1620-2700다른 공급업체의 동급으로 대체할 수 있습니다.
2mm 토양 체임업 공급 업체60141009다른 공급 업체와 동등한 것으로 대체 할 수 있습니다.
200 &마이크로; L 여과 마이크로 피펫 팁USA Scientific1120-8810다른 공급 업체와 동등한 것으로 대체 할 수 있습니다.
25 mL 저장용기VWR International LLC89094-664다른 공급업체와 동등한 것으로 대체할 수 있습니다.
50 mL 코니컬 바이알Thermo Fisher Scientific352098다른 공급업체의 동급으로 대체할 수 있습니다.
500mL 진공 필터(0.2 &마이크로; m pore size)VWR International LLC156-4020
96-well microplatesUSA Scientific655900
96-well PCR platesBioRadHSP9631
Agencourt AMPure XP beadsThermo Fisher ScientificNC9933872사용 설명서:
https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180
&documentName=B37419AA.pdf
알루미늄 호일Boardwalk7124다른 공급업체와 동등한 것으로 대체할 수 있습니다.
0.001g 해상도의 분석 저울Ohaus PioneerPA323다른 공급업체의 동급으로 대체할 수 있습니다.
Bioruptor Plus 초음파 발생기DiagenodeB01020001
소 혈청 알부민 (BSA) 20 mg/mLNew England BiolabsB9000S
원심분리기Eppendorf581100090850mL 및 96웰 플레이트 버킷 어댑터 포함
극저온 장갑Millipore SigmaZ183490다른 공급업체의 동급 제품으로 대체할 수 있습니다.
DNeasy PowerClean 키트(옵션)Qiagen Inc.12877-50이전 MoBio
DNeasy PowerSoil 키트Qiagen Inc.12888-100이전 MoBio
드라이 아이스모든NA
DynaMag-2 자석Thermo Fisher Scientific12321D로 대체하지 마십시오
VWR International LLC89125-188다른 공급 업체와 동등한 것으로 대체 할 수 있습니다.
갤런 크기의 냉동 백ZiplocNA다른 공급 업체의 동급으로 대체 할 수 있습니다.
Gemini EM 마이크로플레이트 리더Molecular DevicesEM상단에서 96웰 플레이트를 판독하는 다른 형광계를 사용할 수 있습니다.
K2HPO4Sigma-AldrichP3786
KH2PO4Sigma-AldrichP5655
Lab coatWorkriteJ1367다른 공급업체의 동급 제품으로 대체할 수 있습니다.
Liquid N2AnyNA는 다른 공급업체와 동등한 것으로 대체할 수 있습니다.
액체 N2 듀어Thermo Fisher Scientific4150-9000다른 공급업체의 동급 제품으로 대체할 수 있습니다.
Milli-Q 초순수 정화 시스템Millipore SigmaSYNS0R0WW
미니 원심분리기Eppendorf5404000014
분자 등급 정제수Thermo Fisher Scientific4387937다른 공급업체의 동급 제품으로 대체할 수 있습니다.
MortarsVWR International LLC89038-150다른 공급업체와 동등한 것으로 대체할 수 있습니다.
니트릴 장갑Thermo Fisher Scientific19167032B다른 공급업체와 동등한 것으로 대체할 수 있습니다.
종이 타월VWR International LLCBWK6212다른 공급 업체와 동등한 것으로 대체 할 수 있습니다.
PCR 플레이트 밀봉 필름Thermo Fisher ScientificNC9684493
PCR 스트립 튜브USA Scientific1402-2700
유봉VWR International LLC89038-166다른 공급업체와 동등한 것으로 대체할 수 있습니다.
플라스틱 주걱LevGo, Inc.17211
Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x)Thermo Fisher Scientific13000014
PNA - 엽록체 및 미토콘드리아PNA BioNA생물정보학
보호 안경Millipore SigmaZ759015다른 공급업체와 동등한 제품으로 대체할 수 있습니다.
Qubit 3.0 형광측정기Thermo Fisher ScientificQ33216
Qubit dsDNA HS 분석 키트Thermo Fisher ScientificQ32854
고무 망치(옵션)Ace 하드웨어2258622다른 공급업체의 동급 제품으로 대체할 수 있습니다.
가위 또는 가위VWR International LLC89259-936다른 공급 업체와 동등한 것으로 대체 할 수 있습니다.
ShovelHome Depot2597400다른 공급업체와 동등한 것으로 대체할 수 있습니다.
토양 코어 수집기 (소경 : < 1 인치)Ben Meadows221700다른 공급 업체와 동등한 것으로 대체 할 수 있습니다.
스프레이 병Santa Cruz Biotechnologysc-395278다른 공급 업체와 동등한 것으로 대체 할 수 있습니다.
표준 탈염 바코드 프라이머(10 µ M) (표 1)IDTNA4 nmole Ultramer DNA Oligo, 표준 탈염. NGS 어댑터 및 염기서열분석 프라이머(표 1)는 v3 화학을 사용하여 Illumina MiSeq와 함께 사용하도록 설계되었습니다.
ThermocyclerThermo Fisher ScientificE950040015다른 공급업체와 동등한 제품으로 대체할 수 있습니다.
Triton X-100Sigma-AldrichX100다른 공급업체와 동등한 것으로 대체할 수 있습니다.
계량 보트Spectrum ChemicalsB6001W다른 공급업체와 동등한 것으로 대체할 수 있습니다.
은 에탄올는 , , , , 은 는

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17 (6), 333-351 (2016).
  2. Soergel, D. A. W., Dey, N., Knight, R., Brenner, S. E. Selection of primers for optimal taxonomic classification of environmental 16S rRNA gene sequences. ISME J. 6 (7), 1440-1444 (2012).
  3. Takahashi, S., Tomita, J., Nishioka, K., Hisada, T., Nishijima, M. Development of a Prokaryotic Universal Primer for Simultaneous Analysis of Bacteria and Archaea Using Next-Generation Sequencing. PLoS One. 9 (8), e105592(2014).
  4. Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and Limitations of 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing in Revealing Temporal Microbial Community Dynamics. PLoS One. 9 (4), e93827(2014).
  5. Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Front Plant Sci. 5, 209(2014).
  6. Jiao, J. -Y., Wang, H. -X., Zeng, Y., Shen, Y. -M. Enrichment for microbes living in association with plant tissues. J Appl Microbiol. 100 (4), 830-837 (2006).
  7. Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research. Front Microbiol. 7, 773(2016).
  8. Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R., Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 5709, 623-628 (2011).
  9. Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
  10. Busby, P. E., et al. Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture. PLoS Biol. 15 (3), e2001793(2017).
  11. Thompson, L. R., et al. A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity. Nature. , (2017).
  12. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
  13. Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a Dual-Index Sequencing Strategy and Curation Pipeline for Analyzing Amplicon Sequence Data on the MiSeq Illumina Sequencing Platform. Appl Environ Microb. 79 (17), 5112-5120 (2013).
  14. Degnan, P. H., Ochman, H. Illumina-based analysis of microbial community diversity. ISME J. 6 (1), 183-194 (2012).
  15. Naylor, D., DeGraaf, S., Purdom, E., Coleman-Derr, D. Drought and host selection influence bacterial community dynamics in the grass root microbiome. ISME J. , (2017).
  16. Desgarennes, D., Garrido, E., Torres-Gomez, M. J., Peña-Cabriales, J. J., Partida-Martinez, L. P. Diazotrophic potential among bacterial communities associated with wild and cultivated Agave species. FEMS Microbiol Ecol. 90 (3), 844-857 (2014).
  17. Coleman-Derr, D., et al. Plant compartment and biogeography affect microbiome composition in cultivated and native Agave species. New Phytol. 209 (2), 798-811 (2016).
  18. De Tender, C., et al. Dynamics in the Strawberry Rhizosphere Microbiome in Response to Biochar and Botrytis cinerea Leaf Infection. Front Microbiol. 7, 2062(2016).
  19. Kapp, J. R., et al. Variation in pre-PCR processing of FFPE samples leads to discrepancies in BRAF and EGFR mutation detection: a diagnostic RING trial. J Clin Pathol. 68 (2), 111-118 (2015).
  20. Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692(2013).
  21. O'Neill, M., McPartlin, J., Arthure, K., Riedel, S., McMillan, N. Comparison of the TLDA with the Nanodrop and the reference Qubit system. J Phys Conf Ser. 307 (1), 012047(2011).
  22. Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., Holmes, S. P. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nat Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
  23. Amir, A., et al. Deblur Rapidly Resolves Single-Nucleotide Community Sequence Patterns. mSystems. 2 (2), e00191-e00116 (2017).
  24. Edgar, R. C. UNOISE2: improved error-correction for Illumina 16S and ITS amplicon sequencing. bioRxiv. , 081257(2016).
  25. Nguyen, N. -P., Warnow, T., Pop, M., White, B. A perspective on 16S rRNA operational taxonomic unit clustering using sequence similarity. NPJ Biofilms Microbiomes. 2, 16004(2016).
  26. Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Holmes, S. P. Exact sequence variants should replace operational taxonomic units in marker-gene data analysis. ISME J. , (2017).
  27. Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing. Nat Methods. 10 (10), 999-1002 (2013).
  28. O'Brien, S. L., et al. Spatial scale drives patterns in soil bacterial diversity. Environ Microbiol. 18 (6), 2039-2051 (2016).
  29. Fierer, N., Lennon, J. T. The generation and maintenance of diversity in microbial communities. Am J Bot. 98 (3), 439-448 (2011).
  30. Fierer, N. Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nat Rev Microbiol. 15 (10), 579-590 (2017).
  31. Buckley, D. H., Schmidt, T. M. Diversity and dynamics of microbial communities in soils from agro-ecosystems. Environ Microbiol. 5 (6), 441-452 (2003).
  32. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87(2014).
  33. Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564(2014).
  34. Sutlović, D., Definis Gojanović, M., Andelinović, S., Gugić, D., Primorac, D. Taq polymerase reverses inhibition of quantitative real time polymerase chain reaction by humic acid. Croat Med J. 46 (4), 556-562 (2005).
  35. Sutlovic, D., Gamulin, S., Definis-Gojanovic, M., Gugic, D., Andjelinovic, S. Interaction of humic acids with human DNA: proposed mechanisms and kinetics. Electrophoresis. 29 (7), 1467-1472 (2008).
  36. Aleklett, K., Leff, J. W., Fierer, N., Hart, M. Wild plant species growing closely connected in a subalpine meadow host distinct root-associated bacterial communities. PeerJ. 3, e804(2015).
  37. Bogas, A. C., et al. Endophytic bacterial diversity in the phyllosphere of Amazon Paullinia cupana associated with asymptomatic and symptomatic anthracnose. Springerplus. 4, 258(2015).
  38. Hiscox, J., Savoury, M., Müller, C. T., Lindahl, B. D., Rogers, H. J., Boddy, L. Priority effects during fungal community establishment in beech wood. ISME J. 9 (10), 2246-2260 (2015).
  39. Zhang, T., Yao, Y. -F. Endophytic Fungal Communities Associated with Vascular Plants in the High Arctic Zone Are Highly Diverse and Host-Plant Specific. PLoS One. 10 (6), e0130051(2015).
  40. Ghyselinck, J., Pfeiffer, S., Heylen, K., Sessitsch, A., De Vos, P. The effect of primer choice and short read sequences on the outcome of 16S rRNA gene based diversity studies. PLoS One. 8 (8), e71360(2013).
  41. Wintzingerode, F., Landt, O., Ehrlich, A., Göbel, U. B. Peptide nucleic acid-mediated PCR clamping as a useful supplement in the determination of microbial diversity. Appl Environ Microb. 66 (2), 549-557 (2000).
  42. Cruaud, P., Vigneron, A., Lucchetti-Miganeh, C., Ciron, P. E., Godfroy, A., Cambon-Bonavita, M. -A. Influence of DNA extraction method, 16S rRNA targeted hypervariable regions, and sample origin on microbial diversity detected by 454 pyrosequencing in marine chemosynthetic ecosystems. Appl Environ Microb. 80 (15), 4626-4639 (2014).
  43. Yang, B., Wang, Y., Qian, P. -Y. Sensitivity and correlation of hypervariable regions in 16S rRNA genes in phylogenetic analysis. BMC Bioinformatics. 17, 135(2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Root Microbiome16S rRNA SequencingSoil DNA ExtractionRhizosphere IsolationRoot EndosphereAmplicon Library PreparationPCR PurificationBacterial Community AnalysisPlant Microbiome ProfilingDNA Isolation Kit

Related Articles