C2C12 Myotubes에 의해 트랜스-플라즈마 막 전자 전송 측정

요약

이 프로토콜의 목표 spectrophotometrically 트랜스-플라즈마 막 전자 전송 extracellular 전자 수락자를 활용 하 여 모니터링 하 고 이러한 세포 외 전자 수락자로 발생할 수 있는 효소의 상호 작용을 분석 하는입니다.

초록

Trans 플라스마 막 전자 전송 (tPMET) extracellular oxidants에 의해 세포내 감소 스트레스 로부터 세포의 보호 뿐만 아니라 손상 으로부터 보호 역할을 하고있다. Extracellular oxidants 세포내 reductants에서 전자 수송의이 과정은 잘 정의 된. 여기 우리 C2C12 myotubes tPMET 세포 외 전자 수락자를 활용 하 여 모니터링 하 여 spectrophotometric 분석 실험을 제시: 수용 성 tetrazolium 소금-1 (서 부 표준시-1)과 2, 6-dichlorophenolindophenol DPIP (DCIP). 이러한 전자 수락자의 감소, 통해 우리는 실시간 분석에이 과정을 모니터 할 수 있습니다. 효소 superoxide dismutase (SOD)는 분석 실험을 하는데 산화 효소 (AO) 등의 추가 함께 우리 tPMET의 부분 각각 하는데 수출 또는 초과 생산 때문입니다 확인할 수 있습니다. 서 부 표준시-1 낮은 배경 가진 안정적인 결과를 표시 했다, 그러나 DPIP AO와 spectrophotometric 분석 시연 했다 잔디의 추가 후 다시 산화 될 수 있었다. 이 메서드는 실시간, 빠른 멀티 잘 spectrophotometric 분석 결과 tPMET, ferricyanide (FeCN) ferricytochrome c 감소 등을 모니터링 하는 데 사용 하는 다른 방법을 통해 장점 보여 줍니다.

서론

전자 수락자를 줄이기 위해 순화 된 플라즈마 막 수 플라즈마 멤브레인 고유의 redox 용량¹는 보기를 주도하 고 있다. 이전에 곰 팡이, 식물, 그리고 동물에서 본, tPMET는 여러 생물^2,3,,45에 공통 프로세스입니다. 특히,이 과정은 Saccharomyces cerevisiae, 당근 세포, 적혈구, 림프 톨, 다리, 흑색 종, 대 식 세포, 골격 근육, 및 호 중구^2,3, 에서 입증 되었습니다. ^{4 , 5 , 6 , 7}. extracellular oxidants를 줄이기 위해 플라즈마 막에 걸쳐 전자를 수송 하는 과정에서 tPMET는 포함 하는 많....

프로토콜

참고:에 대 한 주요 단계 도식 개요 그림 1 을 참조 하십시오.

1. 서 부 표준시-1 감소 분석 결과

1. 성장 하 고 96 잘 접시 행 A-f.를 활용 하 여 표준 셀 문화 절차⁷ 을 사용 하 여 C2C12 부착 세포 분화
   1. 구성 된 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)의 하 2% 말 혈 청, 100 U/mL 페니실린과 0.1 mg/mL 스 보충 차별화 매체를 사용 합니다. 5% CO₂와 37 ° C에서 세포를 품 어.
   2. TPMET에서 하는데 참여 모니터링, 100 µ M ascorbic 산 차별화 미디어 보충. 셀 ~ 24-48 대 한 차별화 미디어에는 알을 품을 수 h.
2. 재고 서 부 표준시-1 및 PMS 솔루션을 준비 합니다.
   1. 서 부 표준시-1의 10 밀리미터 주식을 하려면 분해 서 부 표준시-1의 0.033 g (수식 무게 (FW): 651.34 g/mol) 5 ml의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS). 4 ° c.에 게
   2. PMS의 5 밀리미터 주식을 하려면 0.0023 g PMS의 분해 (....

결과

통계는 RStudio 통계 소프트웨어²⁵를 사용 하 여 반복된 측정 ANOVA와 수행 했다. 샘플 크기는 그림 범례에 표시 됩니다.

모니터 tPMET, C2C12 myotubes extracellular 전자 수락자, 서 부 표준시-1 및 DPIP 함께 활용 했다. AO는 서 부 표준시-1의 부분을 결정 하는 데 사용 되었다, DPIP 감소 하는데 경과 예정 이었습니다 그리고 잔디 extracellular superoxide 출시로 인해 서 부 표준시-1 감소의 부분을 결정 하 사용 되었다. 그림 2에서 같이, C2C12 myotubes tPMET 서 부 표준시-1의 감소에 의해 볼 수 있다. AO의 추가 함께 서 부 표준시-1 감소 하는데 (

토론

우리는 세포 외 전자 수락자, DPIP, 및 서 부 표준시-1 tPMET C2C12 myotubes에서 모니터링 하는 spectrophotometric 분석 실험에 활용 하는 두 가지 방법 제시. 표준 문화 절차에 셀 라인의 성장과 플레이트 리더를 분 광 광도 계 분석 결과 간단한 microplate에에서 이러한 전자 수락자와 tPMET 모니터링 가능 하다. 서 부 표준시-1 감소는 잘-투-잘 분석 결과, 내에서 재현할 수 이지만 일상적인 변화. PBS는 버퍼를 활용 하 여 편차 (CV)의 일상적인 계수는 0.18 및 버퍼는 0.23 HBS를 활용 하 여 이력서.

이전 문학 Mpm과 서 부 표준시-1을 활용 하 여에서 우리는 수정이 프로토콜 특히, PMS의 사용에 대 한. 따라서, PMS의 적절 한 농도 결정 하는 포함 된 문제 해결 및 설명 하는 서 부 표준시-1는 myotubes와 함께 사용 하기 위해. 우리 또한 (23-37 ° C의 범위)에 있는 온도 결정 하지는 분석 결.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
C2C12 근아세포	미국식 문화 컬렉션	CRL-1772
Dulbecco의 변형된 독수리의 매체 - 저포도	Sigma	D6046
Fetal Plex 동물 세럼 복합체	Gemini Bio-Products	100-602
페니실린-스트렙토마이신	시그마	516106
말 혈청	Gibco Technologies	16050-130
Dulbecco의 인산염 완충 식염수	시그마	D8537
트립신-EDTA	시그마	T4049
15cm 배양 접시	TPP	93150
96 웰 배양 플레이트	TPP	92096
2-(4-요오도페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디설포페닐)-2H-테트라졸륨 나트륨 염 (WST-1)	Accela ChemBio  Inc	SY016315
페나진 메토설페이트	Sigma	P9625
L-아스코르빈산	Sigma	A5960
아스코르브산 산화효소	시그마	A0157
슈퍼옥사이드 디스뮤타제	시그마	S5395
2,6-디클로로인도페놀 나트륨 염	ICN Biomedicals	215011825
D-(+)-포도	Sigma	G7528
HEPES 나트륨 염	Sigma	H3784
염화나트륨	Sigma	S7653
염화칼륨	Fisher Scientific	BP366
마그네슘 황산염 헵타하이드레이트	시그마	M5921
칼슘 클로라이드 디하이드레이트	시그마	C7902
인산칼	Fisher Scientific	BP363
Pierce BCA 단백질 분석 키트	Thermo Scientific	23225
Powerwave X-I 분광광도계	Biotek Insturments	단종
Spectronic Genesys 5 분광광도계	Thermo Scientific	336001
PureGrade 96웰 마이크로플레이트, F-bottom, 투명, 처리되지 않은, 비멸균	MidSci	781602
사수철(II) 염화물 사수화물	시그마	220299
철(II) 황산염 헵타하이드레이트	시그마	215422
하이포잔틴	시그마	H9636
xanthine oxidase	Sigma	X4500
Excel	Microsoft
R Studio	Rstudio		https://www.rstudio.com/products/rstudio/
KC4	Biotek Insturments	단종

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