여기, 우리 다운스트림 RNA 분석에 대 한 배수 채널 (TM)를 격리 하기 위한 재현성 레이저 캡처 기정 (LCM)에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. TM에 유전자 발현에 변화를 분석 하는 능력은 TM 관련 눈 질병의 근본적인 분자 메커니즘을 이해에 도움이 됩니다.
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방법 논문
레이저 캡처 서 유전자 표정 분석에 대 한 마우스 눈에서 높은 순수 배수 채널의
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이 논문에서
요약
초록
레이저 캡처 기정 (LCM)는 단일 세포의 유전자 표정 분석을 허용 하 고 조직 섹션에서 세포 인구를 풍성 하 게. LCM 기본 세포 분화와 개발 및 녹 내장을 포함 하 여 다양 한 질병의 진행 하는 분자 메커니즘의 연구에 대 한 훌륭한 도구입니다. 녹 내장, 진보적인 광섬유 neuropathies의 가족 구성, 전세계 돌이킬 수 없는 실명의 가장 흔한 원인입니다. 녹 내장을 개발 하기 위한 주요 위험 요소 증가 안구 내부 압력 (IOP), 구조 변경 및 배수 채널 (TM) 내에서 손상 발생할 수 있습니다. 그러나, 관련 된 정확한 분자 메커니즘이 아직도 제대로 이해 하 고. 유전자 표정 분석을 수행 하는 기능 추가 이러한 셀 및 IOP와 녹 내장 개발의 규칙에 있는 그것의 역할의 기능에 대 한 통찰력을 얻기에 중요 한 될 것입니다. 이를 위해, 높은 격리에 대 한 재현 방법 실시간 정량 및 RNA-Seq 필요와 같은 마우스 눈 및 다운스트림 유전자 표정 분석 방법의 냉동된 섹션에서 TM 농축. 여기에 설명 된 메서드는 다운스트림 디지털 PCR 및 microarray 분석에 대 한 마우스 눈에서 높은 순수 TM을 개발 된다. 또한,이 기술은 다른 매우 풍부한 눈 세포 및 마우스 눈에서 분리 하기 어려운 세포 구획의 격리에 대 한 쉽게 적용할 수 있습니다. LCM 및 RNA 분석의 조합을 녹 내장 기본 셀룰러 이벤트의 보다 포괄적인 이해에 기여할 수 있다.
서론
녹 내장 질병 광섬유 신경 및 망막 궁극적으로 돌이킬 수 없는 실명1,2리드 특징의 그룹입니다. 2020 이상에 의해 70 백만 명 세계적으로 살게 될 것입니다 질병3,,45,,67의 일종으로 추정 된다. 기본 개방 각 녹 내장 (POAG), 녹 내장, 가장 널리 퍼진 유형의 액 (AH) 유출 증가 안구 내부 압력 (IOP)8,,910, 선도 저하에 의해 특징입니다. 11,12,13,14....
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프로토콜
국립 환경 건강 과학 연구소 (NIEHS) 동물 관리 및 사용 위원회 (ACUC) NIEHS 동물 연구 제안 IIDL 05-46에서이 연구의 모든 방법론을 승인 했다.
1. 최적의 조직 컬렉션 레이저 기정에 대 한
- 2, 3 개월 된 생쥐를 얻을 남성 또는 여성 C57BL/6. 최소 1 분 또는 호흡 정지 했습니다 때까지 CO2 를 안락사. 감 금에서 동물을 제거 하 고 자 궁 경관 탈 구, 잘린, 또는 thoracotomy 죽음을 보장.
- 해 부를 하기 전에 모든 해 부 도구는 깨끗 하 고 소독 확인.
참고: 눈의 제거를 위한 곡선가 위 및 톱니 모양의 팁으로 겸 (선호 하는 팁 크기: 0.5 x 0.4 m m) 필요 하 게 됩니다. - 누워 마우스 옆에 평평한 표면에 눈은 쉽게 접근할 수 있도록. 안구는 소켓에서 쉽게 반입할 수 있습니다 때까지 가이드로 눈 소켓을 사용 하 여 눈 주위를 잘라 눈에서 곡선에 직면 하 고, 곡선된가 위를 사용 하 여 다음 마우스를 안정화 하기 위해 집게와 법 (눈의 모서리)에 파악 (커브를 사용 하 여 하지는 가 위의 팁)입니다.
- 부드럽게 당겨 그리고, 궤도 소켓에서 눈을 해제 시 신경 절단 곡선된가 위를 사용 하 여.....
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결과
LCM TM에서 RNA를 수집 및 4 다른 마우스에서 모양 몸은 유전자 발현을 분석 하 고 비교 전체 눈, sclera, 홍 채, 망막, 각 막, 및 렌즈 3 별도 쥐에서 고립에서 그 식 수 절연. TM 유전자 표현, MYOC48 와 ACTA249 격리 TM 샘플 TM에 농축 실제로 높게 했다 확인 모든 수집 된 조직에서 분석 되었다. LCM 샘플에서 cDNA의 매우 낮은 수량에 따라 디지털 PCR 사용 되었다는 입증 된 더 적은 소재50재현할 수 있습니다. MYOC 및 ACTA2 의 식 HSP90a1 내부 관리 유전자를 사용 하 여 정규화 되었는지 다음 각 조직 전체 눈의 비교 되었다. 이러한 결과 MYOC (.......
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토론
TM는 중요 한 역할을 적극적으로 유지 하는 항상성 IOP와 그 장애는 널리 고혈압 녹 내장1,,219에 대 한 주요 원인이 되는 요소 하실. GWAS 분석에 의해 확인 된 여러 유전자에 있는 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상 수 증가 녹 내장 위험 및 TM;에서 아 유출 시설에 증가 저항에 연결 된 그러나,이 질병을 정확한 분자 메커니즘은 아직 완전히 이해21,,2223,,2425. 유전 마우스 모델 녹 내장의 분자 메커니즘을 공부에 대 한 강력한 도구를 제공할 수 있습니.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| ACTA2 ddPCR 프라이머 (dMmuCPE5117282) | BioRad | 10031252 | FAM |
| 애질런트 2100 바이오분석기 | 애질런트 테크놀로지 | G2946-90004 | |
| 애질런트 RNA 6000 피코 키트 | 애질런트 테크놀로지 | 5067-1513 | |
| BioRad QX200 액적 디지털 PCR 시스템 | BioRad | ||
| 소형 페인트 브러시 | |||
| Charged Glass Microscope Slide | Thermo scientific | 4951PLUS-001 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042 | |
| 곡선 가위 | |||
| Eosin Y 염료 | Thermo scientific | 71204 | |
| 에탄올 | |||
| 집게 | 및 톱니 모양 팁(권장 팁 크기: 0.5 x 0.4mm) | ||
| HemaCen | American MasterTech | STHEM30 | |
| 고용량 cDNA 역전사 키트 | 응용 Biosystems | 4368814 | |
| Hsp90a ddPCR 프라이머(dMmuCPE5097465) | BioRad | 10031255 | |
| VEX Leica CM1850 Cryostat | Leica | ||
| Millex-GS 필터 유닛 | EMD Millipore | SLGS033SB | 0.22 µ m |
| MMI CellCut UV 절단 모델 | 분자 기계 및 산업: | LCM, intrument | |
| , MMI, CellTools, 소프트웨어 | , 분자 기계 및 산업 | 50202 | LCM 소프트웨어 |
| 샘플 튜브 Microdisssection | ASEE 제품 | ST-LMD-M-500 | 절연 캡 튜브 / 독일의 Microdissect GmBH에서 제조하고 ASEE 제품에 의해 배포 |
| 캡처 미세 해부 용 샘플 튜브 (대안) | 분자 기계 및 산업 | ||
| 수정 Harris Hematoxylin | Thermo scientific | 7211 | FAM |
| MYOC ddPCR 프라이머(dMmuCPE5095712) | BioRad | 10031252 | |
| PBS | |||
| Memebrane Slides, RNase Free | ASEE 제품 | FS-LMD-M-50r | 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 멤브레인/독일의 Microdissect GmBH에서 제조하고 ASEE 제품 |
| Memebrane Slides, RNase Free (Alternative) | Molecular Machines & 산업 | 50102 | |
| 래피드 픽스 | 써모 과학 | 6764212 | H& E 염색 |
| RLT 버퍼 | Qiagen | 79216 | LCM 샘플에 사용되는 용해 버퍼 |
| RNAseZap | Sigma | R2020 | RNase 오염 제거 솔루션 |
| Protect RNA RNAse 억제제 | Sigma Aldrich | R7397 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA 분리 키트 |
| SMART-Seq v4 초저입력 RNA 키트 | Takara Clontech | LCM 샘플용 저입력 RNA to cDNA 키트 | |
| SuperMix(dUTP 없음) | BioRad | 1863023 | 디지털 PCR 마스터 믹스 |
| Tissue-Tek Cryomold(25mm x 20mm x5mm) | Sakura | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. 컴파운드 | Sakura | 4583 | |
| Stratalinker UV Crosslinker | Stratagene | 400075 | |
| Xylene | Macron | 8668 |
참고문헌
- Foster, P. J., Buhrmann, R., Quigley, H. A., Johnson, G. J. The definition and classification of glaucoma in prevalence surveys. British Journal of Ophthalmology. 86 (2), 238-242 (2002).
- Quigley, H. A. Glaucoma. Lancet. 377 (9774), 1367-1377 (2011).
- Dismuke, W. M., Overby, D. R., Civan, M. M., Stamer, W. D.
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