레이저 캡처 서 유전자 표정 분석에 대 한 마우스 눈에서 높은 순수 배수 채널의

Summary

여기, 우리 다운스트림 RNA 분석에 대 한 배수 채널 (TM)를 격리 하기 위한 재현성 레이저 캡처 기정 (LCM)에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. TM에 유전자 발현에 변화를 분석 하는 능력은 TM 관련 눈 질병의 근본적인 분자 메커니즘을 이해에 도움이 됩니다.

Abstract

레이저 캡처 기정 (LCM)는 단일 세포의 유전자 표정 분석을 허용 하 고 조직 섹션에서 세포 인구를 풍성 하 게. LCM 기본 세포 분화와 개발 및 녹 내장을 포함 하 여 다양 한 질병의 진행 하는 분자 메커니즘의 연구에 대 한 훌륭한 도구입니다. 녹 내장, 진보적인 광섬유 neuropathies의 가족 구성, 전세계 돌이킬 수 없는 실명의 가장 흔한 원인입니다. 녹 내장을 개발 하기 위한 주요 위험 요소 증가 안구 내부 압력 (IOP), 구조 변경 및 배수 채널 (TM) 내에서 손상 발생할 수 있습니다. 그러나, 관련 된 정확한 분자 메커니즘이 아직도 제대로 이해 하 고. 유전자 표정 분석을 수행 하는 기능 추가 이러한 셀 및 IOP와 녹 내장 개발의 규칙에 있는 그것의 역할의 기능에 대 한 통찰력을 얻기에 중요 한 될 것입니다. 이를 위해, 높은 격리에 대 한 재현 방법 실시간 정량 및 RNA-Seq 필요와 같은 마우스 눈 및 다운스트림 유전자 표정 분석 방법의 냉동된 섹션에서 TM 농축. 여기에 설명 된 메서드는 다운스트림 디지털 PCR 및 microarray 분석에 대 한 마우스 눈에서 높은 순수 TM을 개발 된다. 또한,이 기술은 다른 매우 풍부한 눈 세포 및 마우스 눈에서 분리 하기 어려운 세포 구획의 격리에 대 한 쉽게 적용할 수 있습니다. LCM 및 RNA 분석의 조합을 녹 내장 기본 셀룰러 이벤트의 보다 포괄적인 이해에 기여할 수 있다.

Introduction

녹 내장 질병 광섬유 신경 및 망막 궁극적으로 돌이킬 수 없는 실명^1,2리드 특징의 그룹입니다. 2020 이상에 의해 70 백만 명 세계적으로 살게 될 것입니다 질병^3,,45,,67의 일종으로 추정 된다. 기본 개방 각 녹 내장 (POAG), 녹 내장, 가장 널리 퍼진 유형의 액 (AH) 유출 증가 안구 내부 압력 (IOP)^{8,,910, 선도 저하에 의해 특징입니다. 11,12,13,143,15,,1617,18}. 왼쪽된 치료, 만성 높은 IOP 망막 및 시 신경 머리 방사형 실명^1,2,19를 일으키는 진보적이 고 돌이킬 수 없는 손상으로 이어집니다. Ciliary 바디 아의 생산의 속도 감소 또는 그것의 유출^1,,89, 를 강화 하 여 IOP를 감소에 녹 내장의 진행을 둔화에 대 한 모든 현재 메서드 ^{10 , 11 , 12 , 13 , 14}. 주 아 유출 통로 적극적으로 조절에 중요 한 역할을 담당 하는 배수 채널 (TM)의 부적절 한 함수 이며 고혈압 녹 내장^1,,219에 대 한 원인이 되는 요소. 그러나, TM 부전와 어떻게 그것은 아 배수 조절 관련 분자 메커니즘 아직 완전히 이해 되지 않는다 며 현재 녹 내장 연구^1,2,19, 의 주요 초점 ²⁰. 여러 게놈 넓은 협회 연구 결과 (GWAS)는 녹 내장 및 TM에서 아 유출 시설에 증가 저항 유전자의 수를 연결 하 고, 하는 동안 질병으로 이어질 하지 않은 정확한 분자 메커니즘이 아직 완전히 이해^{21 , 22 , 23 , 24 , 25}.

동물 모델 크게^{3,15,16,26,,2728, (광범위 하 게 검토 하는 녹 내장에 질병 진행의 우리의 현재 지식 향상 29,,3031,,3233}). 몇 가지 선구적인 방법은 TM^34,,3536 연구 개발 되었습니다 고 정상과 병에 걸리는 직물의 우리의 현재 이해를 사전에 이러한 방법을 널리 사용 되었습니다. 하나의 영역을 광범위 하 게 탐험 되지 않은 TM 실패의 분자 메커니즘 연구를 유전자 변형된 마우스 모델의 사용 이다. 유전자 변형 노크에 Myocilin (Myoc)^37,38 등 Cyp1b1³⁹, TM 관련 유전자의 녹아웃 마우스 연구 되었습니다 공부 TM의 분자 메커니즘을 위한 기본 도구 기능입니다. 당연 하 게도, 작은 크기의 마우스에서 TM이이 조직 공부를 시작 하기 위하여 극복 되어야 하는 심각한 장애물이 나타냅니다. 마우스 모델 LCM 기술에서 가장 작고 가장 섬세 한 조직, TM 등의 연구 능력을 필요한 도구를 제공 하는 동안 유전학 및 질병의 분자 메커니즘을 공부를 위한 강력한 도구를 나타냅니다.

이 보고서에는 강력 하 고 재현 방법 후속 RNA 격리 및 다운스트림 식 분석에 대 한 증폭 마우스 눈에서 높은 농축된 TM의 LCM에 대 한 설명 되어 있습니다. 유사한 방법에서에서 사용 된 성공적으로 쥐 눈 조직^{40,41,42,,4344}의 분리, 다른 여기 보고 방법론을 적용할 수 있습니다. RNA, 예측에 관한, DNA, 단백질 공부 하 고 눈의 개별 조직. 중요 한 것은,이 기술은 유전자 변형된 쥐 녹 내장과 눈 질병^{3,,1516,17 TM 장애의 분자 병 인을 이해를 사용할 수 있습니다. ,18,26,31,,4546}. LCM에 의해 마우스 눈의 TM을 능력 추가 여러 눈 질환의 분자 메커니즘에 대 한 통찰력을 얻기에 있는 유용한 기술 될 것입니다.

Protocol

국립 환경 건강 과학 연구소 (NIEHS) 동물 관리 및 사용 위원회 (ACUC) NIEHS 동물 연구 제안 IIDL 05-46에서이 연구의 모든 방법론을 승인 했다.

1. 최적의 조직 컬렉션 레이저 기정에 대 한

1. 2, 3 개월 된 생쥐를 얻을 남성 또는 여성 C57BL/6. 최소 1 분 또는 호흡 정지 했습니다 때까지 CO₂ 를 안락사. 감 금에서 동물을 제거 하 고 자 궁 경관 탈 구, 잘린, 또는 thoracotomy 죽음을 보장.
2. 해 부를 하기 전에 모든 해 부 도구는 깨끗 하 고 소독 확인.
   참고: 눈의 제거를 위한 곡선가 위 및 톱니 모양의 팁으로 겸 (선호 하는 팁 크기: 0.5 x 0.4 m m) 필요 하 게 됩니다.
3. 누워 마우스 옆에 평평한 표면에 눈은 쉽게 접근할 수 있도록. 안구는 소켓에서 쉽게 반입할 수 있습니다 때까지 가이드로 눈 소켓을 사용 하 여 눈 주위를 잘라 눈에서 곡선에 직면 하 고, 곡선된가 위를 사용 하 여 다음 마우스를 안정화 하기 위해 집게와 법 (눈의 모서리)에 파악 (커브를 사용 하 여 하지는 가 위의 팁)입니다.
4. 부드럽게 당겨 그리고, 궤도 소켓에서 눈을 해제 시 신경 절단 곡선된가 위를 사용 하 여. 조심 스럽게 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1에 씻어 고 눈에서 비 눈 조직 제거. 1.3-1.4 contralateral 눈에 대 한 반복 합니다.
5. 포함 하기 전에 모든 습기를 제거 하는 조직 삭제 기능으로 눈을 가릴. 화살 섹션을 얻기 위하여 렌즈와 시 신경은 벤치 탑에 평행 되도록 표본 몰드 (25 x 20 x 5 m m³)로 눈을 놓습니다. 눈에 최적의 절삭 온도 (O.C.T.) 화합물을 포함 하 고 동결을 드라이 아이스에 놓습니다. 즉, 일단 저장-80 ° c.에 블록

2. 냉동된 섹션 준비 레이저 기정

1. 전에 사용 하 여 폴 리 에틸렌 테 레프 탈 산 (애완 동물)를 품 어 막 45 분에 대 한 최대 전력에서 UV cross-linker에 슬라이드.
2. 스프레이 브러시, 집게, 항아리, 커플링 및 척 장착에 RNase 오염 솔루션. 철저 하 게 닦아. Nuclease 무료 물으로 헹 구 고 건조. 100% 에탄올을 교차 오염을 피하기 위해 cryostat 아래로 닦으십시오.
3. -18 ° c cryostat 조정 한 번에 한 냉동된 블록-80 ° C 냉장고에서 제거 하 고 드라이 아이스와 함께 cryostat 제공. 10 분의 최소 cryostat의 온도와 equilibrate 냉동된 블록을 허용 합니다.
4. 장착 덩어리 (그림 1A)에 O.C.T.의 작은 금액을 짜 내 고 형에서 조직 블록을 제거 하 고 신중 하 게 장착 척 (그림 1B)에 블록을 배치. 일단 장착 척에 조직 블록 고체 동결, cryostat (그림 2A)의 견본 홀더에 삽입 합니다.
5. 8 µ m 섹션을 잘라내어 신중 하 게 조직 샘플을 도달 하는 O.C.T. 블록을 통해 섹션 cryostat을 조정 합니다. 일단 조직 관찰 단면 중지 하 고 깨끗 한 면도날을 사용 하 여 모든 면에서 냉동된 블록 트림 한 페인트 브러시 (그림 2B)와 함께 처리 수 있도록 주변 조직 O.C.T.의 3-4 mm를 두고. 새로운 깨끗 한 페인트 브러시를 사용 하 여 샘플 교차 오염을 피하기 위해 각 샘플 변경 사이 롤 접시 대신.
6. 섹션을 신속 하 게 작업 하는 눈을 통해입니다. 빠른 단계 hematoxylin와 오신 (H & E) 슬라이드 범람 하 여 모든 제 3 섹션 60에 대 한 얼룩 얼룩 s, 수돗물으로 씻어, 건조, 개간 에이전트에 분명 공기와 coverslip로 충전된 유리 슬라이드에 탑재. 현미경 아래 보기 및 단면 컷된 섹션에 TM 분명 때까지 계속.
7. 일단 TM 표시를 시작, 2 섹션을 잘라내어 H & E LCM와 절삭에 대 한 지도를 얼룩 루틴에 대 한 청구 유리 슬라이드에 탑재.
   참고: 지도 및 얼룩 세부 사항에 대 한 섹션 3 참조.
8. 후 첫 번째 H & E 슬라이드 지도, 및 줄은 cryostat에 6 직렬 8 µ m 두꺼운 부분을 잘라내어 애완 동물 멤브레인 슬라이드 (그림 3A, B)에 동시에 탑재. 짧게 막의 뒤로 따라 gloved 손가락을 슬라이딩 하 여 조직을 준수 합니다. 장착 후 드라이 아이스에 슬라이드 상자에 애완 동물 멤브레인 슬라이드를 즉시 놓습니다.
   그러나 참고: 적은 부분에 탑재 될 수 있습니다, 그리고, 각 섹션은 실내 온도 공기에 노출 되는 시간의 양을 제한 하 여 RNA 저하를 줄이기 위해 권장은 슬라이드에 여러 섹션을 한 번에 장착.
9. 계속 6 섹션 마다 두 애완 동물 멤브레인 슬라이드 후 눈, 섹션, H & E 염색에 대 한 다른 지도 슬라이드를 만드는 충전된 유리 슬라이드에 두 개의 섹션을 수집 합니다. 단면, 약 100 직렬 8 µ m 두꺼운 부분, TM은 더 이상 표시 될 때까지 계속 합니다. 신속 하 게 충전된 유리 슬라이드 (2.6 참조)에 대 한 섹션을 착 색 하 여 확인 합니다.
10. 나중에 LCM 사용-80 ° C에서 모든 애완 동물 멤브레인 슬라이드를 저장 합니다.

3. H & E 지도 슬라이드 얼룩 프로토콜 및 형태 검토

1. 시각화 하 고 충전된 유리 슬라이드에 지도 슬라이드를 검토, 수정 얼룩 항아리에 즉시 전송 하 여 조직의 가득 급속 한 고정 솔루션의 100 mL 7 미 린스 슬라이드에 그것을 찍기 하 여 증류수 10-20 회 다음 깨끗 한 증류수와 커플링 항아리를 슬라이드를 전송.
2. 물에서 슬라이드를 제거 하 고 조직 닦아 건조 가장자리를 되 리. 피펫은 200 µ L 수정 해리스 되며 각 섹션에 필터링 및 30에 대 한 품 어 실 온에서 s. 조심 스럽게 씻어 물 실행 취소 될 때까지 수돗물을 실행 하는 아래의 슬라이드. 과잉 액체를 제거 하려면 각 단계 (3.2-3.5에서 각 단계 사이 오 점) 사이 조직 삭제 기능으로 슬라이드의 끝을 오 점.
3. 1 x 30에 대 한 실 온에서 PBS에 장소 슬라이드 s. 그럼, 신중 하 게 씻어 30 수돗물 실행 하는 아래의 슬라이드 s.
4. 3-4 회 95% 에탄올 목욕으로 슬라이드를 찍어. 슬라이드에 티슈 커버 15 알을 품을 정도로 오신 Y 염료 솔루션 적용 실 온에서 s.
5. 두 번을 10-20 빠른 딥 각 95% 에타 놀 목욕에서 슬라이드를 씻어. 100% 에탄올 욕실 두 번 10-20 빠른 딥 각에서 슬라이드를 씻어. 그런 다음 슬라이드 두 번에에서 린스 크 실 렌 목욕 (10-20 빠른 딥 각).
6. 수 지 장착 매체 조직에 적용 하 여 탑재, 신중 하 게을 피하기 위해 공기 방울 후드에 하룻밤 말리 coverslip 추가.
7. 시각적으로 또는 디지털 슬라이드 스캐너를 사용 하 여 H & E 슬라이드를 검토 합니다. TM 명확 하 게 표시 하 고 절단에 대 한 접근으로 지도 슬라이드를 식별 합니다. 애완 동물을 사용 하 여 이들 사이 막 슬라이드는 LCM에 대 한 슬라이드를 지도.

4. 폴 리 에틸렌 테 레프 탈 산 (애완 동물) 막 슬라이드 처리 및 얼룩 프로토콜

1. 냉동 고에서 제거 애완 동물 슬라이드 먼저 0.3 g cresyl 바이올렛 아세테이트 75% 에탄올 20 mL에 용 해 하 여 cresyl 바이올렛 재고 솔루션을 준비 하 고에 배치 하기 전에 6 월 보다 2 h. 필터 0.22 μ m 살 균 필터 단위와 4 ° C에서 더 이상 저장소 솔루션에 대 한 셰이 커 ths입니다.
2. 1:4 비율로 신선한 75% 에탄올 오신 Y 알코올 솔루션을 준비 합니다. 얼음에 깨끗 한, nuclease 무료, 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브에 고정 (75% 에탄올) 및 탈수 솔루션 (75%, 95%, 및 100% 에탄올)를 준비 합니다. 각 솔루션에 RNase 억제제를 추가 합니다.
3. -80 ° C 냉동 고에서 언된 조직 단면도 포함 하는 슬라이드 상자를 제거 하 고 드라이 아이스에 배치. 번에 하나의 슬라이드를 처리 합니다. 30에 대 한 차가운 75% 에탄올으로 즉시 슬라이드를 삽입 하 여 슬라이드를 수정 s.
4. 부드럽게 슬라이드에 대 한 10-15 O.C.T. 조직 섹션을 방해 하지 않고 해산 nuclease 무료 물에 담근 다.
5. 신중 하 게 1.5 %cresyl 바이올렛 아세테이트 솔루션 섹션에 직접의 300 µ L 플라스틱 및 45 품 어 실 온에서 s. 다음, 30 미 피 펫 200 µ L 오신 Y 솔루션 섹션에 대 한 75% 에탄올 욕조에 그것을 배치 하 여 한 번 세척 하 고 3-5에 대 한 품 어.
6. 75% 에탄올, 95% 에탄올, 및 마지막으로, 100% 에탄올 30에 이후에 슬라이드를 삽입 하 여 조직을 탈수 s 각. 과잉 액체를 제거 하려면 모든 단계 사이 조직 삭제 기능으로 슬라이드의 끝을 오 점. 슬라이드 어 후드 5 분 동안 완전히 건조 보자. 일단 건조, LCM 즉시 그 후 수행 합니다.
   참고: 것이 좋습니다이 단계에 대 한 크 실 렌의 사용을 피하기 위해, 그것은 inadequately 막 슬라이드에 결합 조직 섹션을 발생할 수 있습니다 조직 캡처의 효율성을 감소 시킨다.

5. 레이저 서 UV 레이저

1. 컴퓨터를 켜고 부팅을 허용. 현미경 흰색 빛 전원 공급 장치를 켭니다. 설정 UV 레이저 키와 노란색 led가 켜 집니다. LCM 소프트웨어를 시작, 그것은 완벽 하 게 로드 하 고 라이브 비디오 표시 됩니다 수 있습니다. 컨트롤러 상자에 레이저 버튼을 누르고 녹색 LED가 켜 집니다.
2. 현미경 단계에 새로운 유리 슬라이드 로드 다음 직접 유리 슬라이드 위에 얼룩진된 조직 면 애완 동물 멤브레인 슬라이드를 장소. 멤브레인 및 유리 슬라이드는 현미경 스테이지에 단단히 짝는 다는 것을 확인 하십시오.
3. 첫 번째 슬라이드 제한을 설정 하 여 LCM을 시작입니다. 최저 4 배속 선택 객관적인 패널 (그림 4)에 확대. 금속와 막 만나는 왼쪽된 상단에 라이브 비디오 피드, 보도 "제한 1" 버튼 빨간색 사각형도로 지도에 표시 됩니다 표시 됩니다 때까지 현미경 xy 스테이지를 이동 하 여 막 슬라이드의 작업 영역을 정의 합니다. 다음, 반대 코너를 xy 스테이지를 이동 하 고 "제한 2" 버튼을 누릅니다. 설정된 한계 사이 조직과 막의 로드맵 이미지를 만드는 "스캔" 버튼을 누릅니다.
4. 더블 클릭 로드맵 내 눈 섹션 중 하나의 TM 근처, TM iridocorneal 각도 (그림 5A)의 꼭대기 근처에 있을 수 있습니다. TM 식별 되 면 10 배와 수동으로 TM 배율을 늘립니다. 20 X 40 X 목적과 함께 반복 합니다. TM 40 X 목표 (그림 5B)와 초점에 있을 때 근처의 빈 영역으로 이동 (초점 약간 조정 해야 합니다), "프리 핸드 그리기 도구"를 선택 하 고 조직의 빈 영역에 긴 줄을 그립니다.
5. "컷" 속도가 34%, "초점"은 58%, 그리고 "파워" 70% (그림 4), "잘라내기" 버튼을 누르면 레이저 매개 변수를 설정 합니다. 조정을 잘 레이저 속도, 포커스, 그리고 파워 매개 변수를 명확 하 고 정밀한 커팅 라인 (참조 그림 5C) 관찰 때까지. 정확한 절단, 절삭 그려진된 라인을 다음과 같이 확인 합니다.
6. 절연 튜브 뚜껑 캡 홀더를 로드 하 고 튜브를 엽니다. 모자-리프트에 뚜껑 홀더를 부착 하 고 튜브 반전 다는 것을 확인. 접착제 모자 소재 원하는 조직을 제대로 캡처 되도록 뚜껑의 끝 넘어 돌출을 확신 합니다.
7. 소프트웨어 패널에서 "수동" 해 부 모드를 선택 합니다. (그림 5B) TM 절연 튜브 바로 아래에 주의 깊게 검토. 화이트 밸런스를 설정 하 고 최적의 이미지 품질 (그림 4)을 취득 하는 밝기를 조정 합니다.
8. 절단을 시작, 수동으로 초점을 조정 및 자유형 도구를 사용 하 여 선 그리기, 컬렉션 모자 아직 막 만지고 위쪽 위치에 남아 해야 합니다. TM sclera (그림 5C), 만나는 근처 그리기 부분 동그라미 누릅니다 "잘라." 첫 번째 컷 일단 뚜껑 아래 위치에 위치에 초점을 다시 조정 그리고 언론 "잘라내기" 그리고 조직 섹션에서 수집 TM, 주위에 동그라미를 완료 하는 두 개의 부분 동그라미를 연결할 오픈 또는 자유 공간에서 두 줄을 그립니다 확인 TM 서 모자 (그림 5 D-F)에 의해 포착 되었다.
9. 위쪽에 다시 모자를 위치 하 고 나머지 부분에 (5.2-5.8)를 반복 합니다. 약간 모든 격리 샘플 뚜껑에 적합 하 고 (그림 5G)를 덮지 캡 위치를 조정 합니다. 일관성을 위해 시간 창 한 슬라이드에 대 일 분 사용 애완 동물 당 적은 부분 슬라이드 모든 섹션에서 TM을 분리 하는 데 더 많은 시간이 필요 하는 경우입니다. 다음 애완 동물 멤브레인에 대 한 새로운 절연 튜브를 삽입 하 고 섹션 5를 반복 합니다.

6입니다. Microdissected TM 조직 세포

1. 갓 LCM 절연 조직 lyse RNA 세포의 용 해 버퍼를 준비 합니다. 세포의 용 해 버퍼의 각 1 mL에 10 µ L β-mercaptoethanol을 추가 합니다. 1 개월 이상에 대 한 실 온에서 β-mercaptoethanol와 세포의 용 해 버퍼를 저장 합니다.
2. 캡 홀더는 서의 시작부터 20 분 이내에서 절연 튜브를 제거 합니다. TM의 캡처 수 있도록 눈으로 뚜껑 표면 시각화.
3. 신중 하 게 세포의 용 해 버퍼 완전히 커버 microdissected TM 보장 컬렉션 튜브의 뚜껑에 10 µ L 세포의 용 해 버퍼 플라스틱. 부드럽게 접착제 뚜껑 닫고 컬렉션 튜브 거꾸로 10 분 동안 실 온에서 품 어. 부 화, 이후 2 분 동안 800 x g에서 원심 하 고 드라이 아이스에 lysate 놓습니다. 이후 정화 및 분석-80 ° C에서 lysates를 저장 합니다.

7. RNA 격리 및 품질 분석

1. 샘플 실 온에서 해 동 하 여 RNA 품질을 분석. 수영장 함께 모든 샘플 한 RNase 무료 1.5 mL microfuge 관으로 단일 마우스에서 고립.
   참고: 예를 들어 각 생물 복제에 대 한 10-12 튜브 microdissected 모자 10 µ L lysate에서 생성 된 그리고 모든 lysates 각 생물 복제 (100-120 µ L lysate)에 대 한 단일 관으로 옮겨 졌다.
2. 각 lysate 솔루션 (RNase 무료 물으로 만든) 갓된 70% 에탄올에의 한 볼륨을 추가 합니다. 그런 다음 RNA 격리 키트 사용자 지침에 따라 총 RNA 정화. 각 RNA 샘플에서 게놈 DNA의 제거를 확인 합니다.
   참고: 게놈 DNA 다운스트림 RNA 분석을 방해할 수 있습니다.
3. 함께 각 마우스에서 샘플 풀링 하 고 (그림 6A) 리보솜 RNA 무결성을 분석 하 여 TM에서 격리 하는 RNA의 품질을 측정 합니다.
   참고: TM의 작은 크기로 인해 ribosomal RNA 봉우리 되지 않을 수 있습니다 관찰 (그림 6B) RNA 품질 프로 파일 ( 그림 6A, C1000-4000 bp 사이 관찰 하는 두 개의 봉우리)에 RNA 무결성 번호 (린) 계산에 사용 되 ⁴⁷.
   1. 막 슬라이드에 더 풍부한 나머지 조직에서 RNA를 분리 하 여 RNA 무결성의 더 정확한 측정을 얻을. 대표 린, pipetting 10 막 슬라이드에 안구 조직에서 격리 RNA를 µ L 세포 하나의 조직 섹션에 버퍼 고 RNA 격리를 수행 합니다. RNA 품질을 분석 하 고 린 (그림 6 c)를 계산 합니다.
4. 다운스트림 RNA에 대 한 응용 프로그램에 대 한 재현를 시퀀싱 및 cDNA 라이브러리 생성을 위한 낮은 입력된 RNA 키트 LCM의 작은 80 섹션에서 결과 사용 하 여 TM 고립.

8입니다. 분석

1. 수집 조직 TM 관련 된 유전자에 농축 사실 확인, microdissected 전체 눈, sclera, 홍 채, 망막, 각 막 및 렌즈 3 별도 마우스에서에서 여러 추가 RNA를 수집 합니다. LCM와 결합에서이 RNA에서 RNA를 수집 사용 고립 TM 및 ciliary 바디 4 별도 마우스에서 수집.
2. Microdissected 샘플에서 RNA는 cDNA cDNA 역방향 전송 키트를 사용 하 여 변환 합니다. LCM 격리 샘플에서 RNA를 증폭 및 낮은 입력 RNA cDNA 키트를 사용 하 여 cDNA를 변환.
3. 배수 채널 유전자, myocilin (MYOC)와 알파 걸 2 (ACTA2), 표현에 대 한 모든 RNA를 분석 하 고 디지털 PCR (그림 7A-B), HSP90a1 내부 관리 유전자를 사용 하 여 정상화.

Results

LCM TM에서 RNA를 수집 및 4 다른 마우스에서 모양 몸은 유전자 발현을 분석 하 고 비교 전체 눈, sclera, 홍 채, 망막, 각 막, 및 렌즈 3 별도 쥐에서 고립에서 그 식 수 절연. TM 유전자 표현, MYOC⁴⁸ 와 ACTA2⁴⁹ 격리 TM 샘플 TM에 농축 실제로 높게 했다 확인 모든 수집 된 조직에서 분석 되었다. LCM 샘플에서 cDNA의 매우 낮은 수량에 따라 디지털 PCR 사용 되었다는 입증 된 더 적은 소재⁵⁰재현할 수 있습니다. MYOC 및 ACTA2 의 식 HSP90a1 내부 관리 유전자를 사용 하 여 정규화 되었는지 다음 각 조직 전체 눈의 비교 되었다. 이러한 결과 MYOC (...

Discussion

TM는 중요 한 역할을 적극적으로 유지 하는 항상성 IOP와 그 장애는 널리 고혈압 녹 내장^1,,219에 대 한 주요 원인이 되는 요소 하실. GWAS 분석에 의해 확인 된 여러 유전자에 있는 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상 수 증가 녹 내장 위험 및 TM;에서 아 유출 시설에 증가 저항에 연결 된 그러나,이 질병을 정확한 분자 메커니즘은 아직 완전히 이해^{21,,2223,,2425}. 유전 마우스 모델 녹 내장의 분자 메커니즘을 공부에 대 한 강력한 도구를 제공할 수 있습니...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ACTA2 ddPCR 프라이머 (dMmuCPE5117282)	BioRad	10031252	FAM
애질런트 2100 바이오분석기	애질런트 테크놀로지	G2946-90004
애질런트 RNA 6000 피코 키트	애질런트 테크놀로지	5067-1513
BioRad QX200 액적 디지털 PCR 시스템	BioRad
소형 페인트 브러시
Charged Glass Microscope Slide	Thermo scientific	4951PLUS-001
Cresyl Violet Acetate	Sigma Aldrich	C5042
곡선 가위
Eosin Y 염료	Thermo scientific	71204
에탄올
집게			및 톱니 모양 팁(권장 팁 크기: 0.5 x 0.4mm)
HemaCen	American MasterTech	STHEM30
고용량 cDNA 역전사 키트	응용 Biosystems	4368814
Hsp90a ddPCR 프라이머(dMmuCPE5097465)	BioRad	10031255
VEX Leica CM1850 Cryostat	Leica
Millex-GS 필터 유닛	EMD Millipore	SLGS033SB	0.22 µ m
MMI CellCut UV 절단 모델	분자 기계 및 산업:		LCM, intrument
, MMI, CellTools, 소프트웨어	, 분자 기계 및 산업	50202	LCM 소프트웨어
샘플 튜브 Microdisssection	ASEE 제품	ST-LMD-M-500	절연 캡 튜브 / 독일의 Microdissect GmBH에서 제조하고 ASEE 제품에 의해 배포
캡처 미세 해부 용 샘플 튜브 (대안)	분자 기계 및 산업
수정 Harris Hematoxylin	Thermo scientific	7211	FAM
MYOC ddPCR 프라이머(dMmuCPE5095712)	BioRad	10031252
PBS
Memebrane Slides, RNase Free	ASEE 제품	FS-LMD-M-50r	폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 멤브레인/독일의 Microdissect GmBH에서 제조하고 ASEE 제품
Memebrane Slides, RNase Free (Alternative)	Molecular Machines & 산업	50102
래피드 픽스	써모 과학	6764212	H& E 염색
RLT 버퍼	Qiagen	79216	LCM 샘플에 사용되는 용해 버퍼
RNAseZap	Sigma	R2020	RNase 오염 제거 솔루션
Protect RNA RNAse 억제제	Sigma Aldrich	R7397
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	RNA 분리 키트
SMART-Seq v4 초저입력 RNA 키트	Takara Clontech		LCM 샘플용 저입력 RNA to cDNA 키트
SuperMix(dUTP 없음)	BioRad	1863023	디지털 PCR 마스터 믹스
Tissue-Tek Cryomold(25mm x 20mm x5mm)	Sakura	4557
Tissue-Tek O.C.T. 컴파운드	Sakura	4583
Stratalinker UV Crosslinker	Stratagene	400075
Xylene	Macron	8668