Β-aminopropionitrile-유도 대동맥 동맥 및 해 부의 마우스 모델에서 Aortopathy의 양적 마이크로 CT 분석

Summary

이 문서는 대동맥 동맥 및 해 부의 마우스 모델에 대동맥 직경 정량화에 대 한 murine 맥 관 구조 perfuse를 방사선 불 투과성 리드 기반 실리콘 고무를 사용 하 여 상세한 방법론을 설명 합니다.

Abstract

대동맥 동맥 류 및 해 부 상당한 병 적 상태와 사망률은 인구에 연결 되어 있으며 매우 치명적일 수 있다. 대동맥 질환의 동물 모델 존재는 맥 관 구조의 이미징 vivo에서 제한 되었습니다. 최근 몇 년 동안, 미세 전산화 단층 촬영 (마이크로 CT) 모두 크고 작은 혈관 이미징에 대 한 기본 양식 적임 떠오르고 있다 vivo에서 및 전 비보. 함께 관 주조 방법, 주파수 및 C57/Bl6 마우스 β-aminopropionitrile 치료에 대동맥 병 리의 분포 특성 마이크로-CT를 사용 성공적으로 했습니다. 이 방법의 기술적 한계 가난한 동물 준비, 선박 크기 정량화에 대 한 적절 한 방법론의 응용 프로그램 및 비-이 절차의 생존에 의해 소개 하는 관류의 품질에 변화를 포함 합니다. 이 문서는 동맥 및 해 부의 마우스 모델에서 aortopathy의 양적 특성에 대 한 리드 기반의 방사선 불 투과성 실리콘 고무의 혈관 내 관류에 대 한 방법론을 자세히 설명합니다. 대동맥 병 리를 시각화, 뿐만 아니라 다른 혈관 침대에 vivo에서 또는 혈관 침대 제거 사후 조사이 메서드를 사용할 수 있습니다.

Introduction

대동맥 해 부의 발생률은¹년 당 100000 당 3 경우. 대동맥 해 부 및 aneurysmal 계정 10000 죽음에 대 한 미국에서 매년, 서방 국가²에 있는 모든 죽음의 1-2%. 대동맥 해 부 생리 압력에서 대동맥 벽의 층을 통해 혈액의 전파와 그릇의 내 층에 눈물에 의해 시작 됩니다. 높은 환자 펄스 압력 해 부 및 합병증의 발생률이 증가와 연결 됩니다. 증가 벽 전단 응력 선도 동맥 형성^3,4대동맥 벽 확장 연결 됩니다. 대동맥 해 부의 결과 두뇌, 신장, 대변, 및 사지, 만성 동맥 류, 파열, 또는 죽음^5,,67의 형성을 포함 하 여 먼 장기에 혈액 흐름의 폐색을 포함 합니다.

현재, 개시 및 대동맥 동맥 류 및 해의 진행에 관련 된 생화학과 세포 프로세스 여전히 제대로 이해 하 고. 대동맥 동맥 류 및 해 부 재현 동물 모델은 그들의 병 태 생리학을 이해 하는 열쇠입니다. Β-aminopropionitrile (BAPN)은 lysyl 산화 효소 억제제, 엘라 스 틴과 콜라겐의 교차 연결을 방지 하 고 혈관 벽 세포 외 매트릭스와의 biomechanical 무결성^{6의 구조를 크게 변경 표시 되었습니다, 8}. BAPN로 치료 하는 설치류 대동맥 동맥 및 해 부^9,10의 일반적인 동물 모델 활용 되어 있다.

혈관 이미징 형식 혈관 병 리를 확인 하 고, 선박 patency 확인 평가 기관 관류에 있습니다. 최근, 마이크로 계산 된 단층 촬영 (마이크로 CT)은 쥐와 유사 하 게 치수가 재 진된 동물의 맥 관 구조를 공부 하 이용 되었습니다. Intraluminal 혈액은 본질적으로 비교적 radiolucent 뼈와 달리 단층에 의해 혈관의 축 이미징, 제한 됩니다. 그러나 혈관 내 조 영제와 결합 하면,, 마이크로-CT 수 있습니다 매크로 해부학 혈관 병 리¹¹연구를 위한 동물 vasculatures의 상세한 3 차원 복원을.

선택한 대비 에이전트는 방사선 불 투과성 실리콘 고무 리드 크롬과 리드를 포함 하는 ( 테이블의 자료를 참조). 촉매의 면 전에 서 관류, 시 신속 하 게 견고 하 게 캐스팅 배경 조직 달리 높은 방사선 불 투과성는 맥 관 구조를 만드는 혈관의 매크로 해부학 아키텍처에 최소한의 변경으로 맥 관 구조를 형성 하는 경우 radiographically 검사. 이 대비 에이전트 처리를 쉽게 하 고 조직 저하와 자주 관련 혈관 캐스트 부식 된 파손으로 인해 선박 손실 방지 때문에 유리 하다. 그것은 최소한의 수축¹²치료, 혈관 혈액의 허가 특허 유지 하 고는 동물 매크로-맥 관 구조 비 생존 실험에의 한 정확한 평가 대 한 허용. 이전 작업은 성공적으로 동물 연구의 다양 한 방사선 불 투과성 실리콘 고무-대비를 사용 했다. 특히, 관상, 사, 태 반, 그리고 대뇌 순환^{11,12,13,,1415} 머릿속에 적용 표시 되었습니다. 이 논문에서 우리 세부 양적 마이크로-코네티컷에 의해 마우스 모델에서 대동맥 병 리 BAPN 유도 하 리드 기반의 방사선 불 투과성 실리콘 고무의 혈관 내 관류에 대 한 오픈 왼쪽 심 실 펑크의 방법론

Protocol

처리 하는 동물에 대 한 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 메릴랜드, 볼티모어 (동물 프로토콜 번호 0116024)에 의해 승인 되었고 AAALAC 국제 표준에 따라 실시.

1입니다. 시 약의 준비

1. 헤 파 린
   1. 희석 250 µ L 1000의 U/mL 헤 파 린 황산 50 ml의 인산 염 버퍼 5 U/mL의 최종 농도 수 있도록 염 분.
   2. 따뜻한는 heparinized (5 U/mL) 인산 염 버퍼 식 염 수, 37 ° c 설정 물 욕조에 맥 관 구조에 혈액 대체 하 게 됩니다
   3. 필요한 튜브를 연결 하 여 압력 제어 펌프를 준비 하 고 2 빈 10 mL 주사기, heparinized 염 분 버퍼에 대 한 1 및 대비 에이전트에 대 한 1.
   4. 버퍼링 따뜻한 heparinized 인산 염으로 튜브와 압력 펌프의 배관에서 공기 방울을 제거.
2. 대비 에이전트
   참고: 참조 하십시오 테이블의 자료 를 대비 에이전트 키트 성분.
   1. 희석제 비율 1:6 염료를 달성 하는 희석제와 함께 색소 화합물을 혼합.
   2. 사용 (단계 2.3.12), 직전 200 µ L 희석된 색소 화합물의 약 각 5 mL 수를 경화제와 혼합 그들 잘 볼륨 (4%)를 추가 합니다.
      참고: 제조업체 보고 작업 시간은 40 분입니다. 실리콘 고무 대비 에이전트 시작으로 치료 대리인의 추가 후에 20 분을 유해 하, 그것은 그것의 주입 직전 솔루션을 준비 하는 것이 중요.
3. BAPN 식 수
   1. 3 g/L (문학에서 설명한 프로토콜에서 적응)^9,,1617의 최종 농도 만들려고 식용 수에 있는 β-aminopropionitrile (BAPN)을 분해.
   2. 일단 그들이 마이크로-중부 대 한 관류의 시간까지 나이의 4 주 쥐의 그룹에 포함 하는 BAPN 식 수 관리

2. 수술

1. 동물 준비
   1. 쥐 나이의 3 주에 유아, 12 h 빛/12 h 어두운 주기에, 그들을 유지 하 고 그들을 먹 여 표준 설치류 차 우. BAPN 대우 그룹에 대 한 16-26 주 광고 libitum갓된 BAPN 식 수를 관리 합니다. 표준 음주와 제어 동물 물 광고 libitum제공 합니다.
2. 마 취 기술
   참고: CT 분석, 다음 절차에서는 이전 24 시간 수행 됩니다. 수술 절차는 사후 intracardiac 관류에 대 한 표본 준비를 제정 했다.
   1. 100% O₂ 와 3 %isoflurane 정밀 기화 기를 통해 전달 유도 탱크를 통해 마 취 유도. 마 취 유도 후는 isoflurane 중단 하 고 O₂챔버를 플러시. 2-2.5 %isoflurane 1 L/min 코 콘을 통해 O₂ 의 마 취를 유지 합니다.
   2. 직원을 보호 하기 위해 폐기물 가스 흡착에 대 한 목탄 폐품을 유도 챔버와는 안 면을 첨부 합니다. 유해 자극 (발가락 핀치)에 대 한 응답이 있다는 것을 입증 함으로써 적절 한 마 취 비행기를 확인 합니다.
   3. 수술 트레이 및 필요한 수술 악기의 구성 요원 필드를 준비 합니다.
   4. 동물 수술 필드에 전송 하 고 등 쪽 recumbency에 위치.
3. 수술 기술
   1. 가 위를 사용 하 여, 피부 및 연 조직 overlying 흉 골까지 연장 sternal 노치를 음모 관절 사이에서 피부와 부드러운 조직 통해 중간 절 개를 확인 합니다.
   2. 가 위를 사용 하 여 흉 강 입력 칼 과정에서 격 막에 구멍을 만듭니다.
   3. 가 위를 사용 하 여 양측 복 부 가슴 벽의 격 막 해 부.
   4. 바로 sternal 국경에서 흉 골에서 늑 골을 분리 하는 늑 골 연골을 통해 잘라.
   5. (근처 칼 과정) 흉 골의 끝에 잘 hemostatic 클램프를 적용 하 고 이동 하는 hemostat cranially 마우스의 머리 위에 배치 됩니다. 이 thymus과 심장, 심 혼 및 중대 한 배 추가 조작에 대 한 노출에서 흉 골을 철회 합니다.
   6. 급격히 심장 및 흉 벽 사이 어떤 부착 해 부.
   7. 미리 로드 버퍼 heparinized 인산 염 (5 U/mL)의 10 mL 주사기에 27-게이지 IV 카 테 테 르 바늘을 연결 하 고 압력 펌프의 튜브에서 공기 방울을 제거 하려면 해당 버퍼와 함께 모든 튜빙을 채우기.
   8. 유체 라인에 거품으로 액체를 준비 하는 동안 주의 작은 혈관의 작성을 방해 수 있습니다. 이 최종 영상에 아티팩트를 소개 하 고 완전 충전에 필요한 볼륨을 변경 절단 선박의 누출에 대비 에이전트를 발생할 것입니다 동물 준비 하는 동안 손상 된 혈관의 수를 제한 합니다.
   9. 왼쪽된 심 실 직각 클램프와 안정 27 게이지 바늘으로 찔린 합니다. 우 심 실 또는 헤 파 린 솔루션 및 혈액을 배출 하는 열 등 한 베 나 카바 incise 즉시.
      참고: 헤 파 린은 동물의 죽음 후에 혈관 응고에서 혈액을 방지 하기 위해 항 응고 제로 사용 됩니다.
   10. 2 mL/분 단일 주사기 펌프를 사용 하 여 일정 한 속도로 동물 perfuse Note는 기관의 표시 창백. 정 맥 순환에서 배출 하는 perfusate는 혈액 (약 5-6 mL)의 무료 때까지 관류를 계속 합니다. 펌프를 중지 합니다.
   11. 10 mL 주사기, 좌 심 실에 바늘의 위치를 방해 하지 않도록 주의 복용에서 IV 카 테 테 르 튜브를 분리 합니다.
   12. 즉시 전체 exsanguination 후 5 mL aliquots에 대비 에이전트 솔루션을 분리 하 고이 이번에 경화제를 추가 (단계 1.2 참조). 그들을 잘 섞는다. 10 mL 주사기로 대비 에이전트 믹스의 5 mL을 인출 하 고 그것으로 동물을 perfuse.
   13. 혈관 (동맥 및 정 맥)의 완전 한 작성에 대 한 정 맥 솔루션 종료 볼 수 있다 때 과거 시점 주입을 계속 합니다. 관상 동맥, 폐 동맥, 소장과 간 맥 관 구조에 캐스팅 에이전트의 시각화를 포함 하 여 성공적인 관류의 흔적을 찾고 있습니다.
   14. 대비 에이전트는 실 온에서 약 20 분 후 치료할 것 이다. 치료, 시 필요에 따라 개별 기관, 수확 하 고 10% 중립 버퍼링 된 포 르 말린에 고정. 샘플 마이크로-CT 검사 다음 날에 사용 되지 않는 경우 전체 시체를 수정 합니다. 시체 사용 될 연속적인 일 하는 경우 금속 쟁반에 그들을 놓고 밤새 치료 4 ° C에서 냉장고에 넣어.

3. 마이크로-CT 스캔 및 매개 변수

참고: 특정 이미지 수집 매개 변수 사용에 기계에 의존 될 것입니다.

1. 관류 55 kVp, 150 µ A의 전류, 2.19, 시스템 확대 요인 및 CCD 카메라 픽셀 범주화 요소 2의 x 선 관 전압을 사용 하 여 마이크로 CT 스캐너를 사용 하 여 다음 날 각 마우스의 계산 된 x 선 단층 촬영 이미지를 취득 합니다. 이 29 µ m의 효과적인 픽셀 크기를 생성합니다.
   1. 마이크로-CT 스캐너 테이블에 부정사 마우스 시체를 얻을 정찰 x-선 검사.
   2. 대동맥의 전체 길이 이미지를 몸통에 57.4 m m (축) x 37.1 m m (transaxial)의 보기의 탐지기 분야 초점.
   3. 2도 및 투영 2800 ms의 당 한 번의 회전 증가와 180 이미지 계획을 취득 합니다.
2. 수정 된 Feldkamp 알고리즘;를 사용 하 여 이미지를 재구성 재건된 복 크기는 29 µ m³ x 29 x 29 (슬라이스 두께 = 29 µ m) 여기 사용 하는 소프트웨어에 대 한 복합 3D 시각화 플러그인을 사용 하 여.

4. 후 처리 및 렌더링

1. 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 DICOM 형식으로 CT 데이터를 변환 합니다.
2. 동맥 류 존재 여부를 식별 하기 위해 이미지를 분석 합니다. 하강 하는 흉부 대동맥, 대동맥 아치의 넓은 시점에서 부 축 직경을 측정 하 고 복 부 대동맥 앞¹⁸ (그림 1)에서 설명한.
   참고: 우리의 연구에서 이미지 분석 되었다 2 명의 독립적인 관찰자 (1 눈) 동맥 류 존재 여부를 확인 하는 DICOM 뷰어를 이용 하 여. 부 축 직경 대동맥 아치, 앞에서 설명한¹⁹ (그림 1)으로 흉부 대동맥, 그리고 복 부 대동맥을 내림차순의 가장 넓은 지점에서 측정 되었다. BAPN 치료 쥐의 비 aneurysmal 동맥 세그먼트 설립 나이 일치 하는 컨트롤 값으로 정상적인 혈관 직경을 의미 합니다.
3. 동맥 류는 대동맥 직경 보다 큰 50% 기준 직경의 세그먼트의 지역화 된 또는 확산 팽창으로 정의 됩니다. 위의 측정에 따라이 찾습니다.

Results

이 프로토콜을 평가 하기 위해 20 남성 성인 쥐, 혼합된 배경으로 앞에서 설명한¹⁹ 의 그리고 20-30 주 나이, 또는 BAPN 치료 없이 리드 기반의 방사선 불 투과성 실리콘 고무 끼얹는다 했다 ( 테이블의 자료를 참조 ) 위에 상세한 프로토콜을 사용 하 여. 그들은 수술 다음 날에 마이크로-CT 검사 (그림 1 및 그림 2). 비교 그룹 중 쥐의 년에서 상당한 차이가 있었다.

작은 축 직경 다음이 쥐에 정량 했다. BAPN 치료 쥐에 오름차순 대동맥의 평균 직경은 치료 나이 일치 하는 컨트롤의 그것 보다 훨씬 더 큰 (1.43 ± 0.56 m m ...

Discussion

마이크로-CT 영상 동물 모델에서 혈관 병 리의 매우 상세 하 고 3 차원 개조를 제공 하기 위해 사용할 수 있습니다. 혈관 내 대비 향상 된 미디어의 사용을 통해 향상 된 비 부드러운 조직, 혈관, 루멘 등 그는 강화에서 분화 수 있다. 레이저 도플러, microangiography, 자기 공명 혈관, confocal, 또는 두 광자 현미경으로 조직학 혈관 침대를 평가 하기 위해 사용 될 수 있습니다, 그리고 그들은 일반적으로 연구의 제한 된 영역에 초점 및 2 차원 평가로 제한 됩니다. 마이크로-CT 기본 신생 혈관 생물학의 이해에 도움이 될 수 있습니다 혈관 구조의 상세한 이미지를 얻기의 비용 효율적인 수단을 제공 합니다. 작은 동물을 이미징의 추가 방법에는 vivo에서 마이크로-CT 및 디지털 감산 혈관 포함 됩니다. 마찬가지로 여기서 설명 하는 기술, 마이크로-CT vivo에서 해상도 증가 시킬 exogenous 대비 에이전트에 의존 합니다. Fenestra VC 및 Isovue-370는...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microfil	Flow Tech, Inc	MV-122	우리는 노란색을 사용하며 원하는대로 다른 색상을 주문할 수 있습니다. 키트에는 MV-Compound, MV-Diluent 및 MV-Curing Agent가 포함되어 있습니다.
헤파린(1000 U/mL)	Sagent Pharmaceuticals	25021-400-10
인산염 완충 식염수	Corning	21-031-CV
이소플루란	Vet One, MWI	502017
3-아미노프로피오니트릴 푸마르산염	Sigma-Aldrich	A3134
단일 주사기 펌프	Fisher Scientific	14-831-200
27-게이지 두피 정맥 세트 바늘	Exel Int	26709	27G x 3/4", 12" 튜브
Inveon Micro-CT 스캐너	Siemens Medical Solutions
Osirix MD	Pimxmeo SARL		버전 8.0.2
Inveon Research Workplace	Siemens Medical Solutions		버전 4.2
설치류 차우	Harlan Teklad	2018sx