방법 논문

A11-긍정적인 β 아 밀 로이드 올리고 머 준비 및 평가 분석 Blotting 도트를 사용 하 여

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DOI:

10.3791/57592

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2018년 5월 22일

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1Ningbo Key Laboratory of Behavioral Neuroscience, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Pathophysiology, School of Medicine, Ningbo University, 2Li Dak Sum Yip Yio Chin Kenneth Li Marine Biopharmaceutical Research Center, Ningbo University, 3School of Materials Science and Chemical Engineering, Ningbo University

이 논문에서

요약

이 프로토콜 분석 blotting 점이 상대적인 양의 Aβ 올리고 머를 평가 하는 합성 펩 티 드에 생체 외에서 에서 Aβ 올리고 준비 하는 방법을 설명 합니다.

초록

Β-아 밀 로이드 (Aβ)은 자체 집계로 조립 하는 본질적인 추세를 가진 소수 성 펩 티 드 이다. 다양 한 집계 중 Aβ 올리고 머 최고의 neurotoxin Alzheimer의 질병 (광고)의 진행으로 널리 인정 하 고 광고의 병 인에 중요 한 이벤트로 간주 됩니다. 따라서, Aβ 올리고 머 저 해제 수 neurodegeneration을 방지 하 고 수정 하는 질병으로 발전 될 가능성이 광고의 치료. 그러나, 다른 대형 프로토콜 Aβ 올리고 머의 다른 특성을 가진 올리고 발생할 수 있습니다. 또한, 효과적으로 화면 Aβ1-42 올리고 머 억제제를 많은 방법이 되지 있다. A11 항 체는 항 병렬 β 장 구조와 독성 Aβ1-42 올리고 머의 하위 집합으로 반응 수 있습니다. 이 프로토콜에는 합성 Aβ1-42 펩 티 드에서 에 체 외에서 A11-긍정적인 Aβ1-42 올리고 머-풍부한 예제를 준비 하 고 도트 blotting에 의해 상대적 양의 샘플에서 A11-긍정적인 Aβ1-42 올리고 머를 평가 하는 방법 설명 A11 Aβ1-42를 사용 하 여 분석-특정 6E10 항 체. 이 프로토콜을 사용 하 여, 억제제 A11-긍정적인 Aβ1-42 올리고 머의 수 또한 상영 반 정량적 실험 결과에서.

서론

Alzheimer의 질병 (광고) 노인 전세계1에 영향을 미치는 가장 중요 한 신경 퇴행 성 질환 중 하나입니다. 그것은 널리 β 아 밀 로이드 (Aβ)의 비정상적인 집계 광고의 주요 병 적인 요인이 될 수 있습니다 허용 됩니다. Aβ 집계 광고 환자의 두뇌에서 생물 학적 마커 중 치 패의 주요 구성 요소는. 또한, Aβ 집계, 특히 올리고 포함 하 여 광고 진행으로 신경 죽음의 원인이 될 수 있습니다 강력한 neurotoxicity 생산. 따라서, Aβ 올리고 머 형성의 저해 되지 않도록 neurodegeneration, 그리고 Aβ 올리고 머 저 해제 수정 하는 질병으로 발전 될 수 있는 광고의 치료. 많은 연구 올리고 시험관을 형성, 형태학 및 인공 Aβ 올리고의 구조를 탐구 하 고 생체 외에서 모델2,3 를 사용 하 여 Aβ 올리고 머의 억제제를 조사 하는 합성 Aβ 펩 티 드를 사용 , 그러나 4., Aβ 올리고 머의 형성 프로토콜 다른 시험관에 다른 연구 그룹 사이에서 비교할 수 없는 결과가 발생할 수 있습니다 다른 형태학 상 특성을 가진 올리고 머를 발생할 수 있습니다. 따라서, Aβ 올리고 머에 대 한 표준 형성 프로토콜 절실히 필요 합니다.

지금까지 많은 방법은 직접 검색 Aβ 올리고 보고 되었습니다. 전송 전자 현미경 (TEM), 비 변성 시키기 젤 전기 이동 법, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA), 및 점 분석 blotting 사용할 수 있습니다 금액 또는 Aβ 올리고 머 생체 외에서5, 의 형태를 검사 하 6. 예를 들어 Aβ 올리고 머의 구조와 형태 TEM에서 관찰 될 수 있다. Aβ 집계의 분자 크기 및 상대 금액 비 변성 시키기 젤 전기 이동 법에 의해 측정 될 수 있는. ELISA 혈 청, 플라스마, 및 뇌 조직에서 추출 물에서 Aβ 올리고 머를 결정 하기 위해 사용 될 수 있습니다. 마지막으로, 분석, 검색, 사용 되는 기술 blotting 점 분석 및 단백질, 식별 사용할 수 올리고 머 및 Aβ 관련 항 체의 도움으로 다른 샘플 올리고 머 Aβ의 상대 농도 평가 하. 또한, 분석 결과 더 럽 히는 점이 젤 전기 이동 법 및 젤에 대 한 더 럽 히 절차 필요 하지 않습니다 상당한 시간 절약을 제공 합니다. 따라서,이 분석 결과 화면 잠재적인 Aβ 올리고 머 억제제를 일반적으로 사용 됩니다. 이 프로토콜의 전반적인 목표 분석, blotting 점으로 화면 Aβ 올리고 머를 Aβ1-42 올리고 머의 양을 분석 하는 Aβ1-42 올리고 머 풍부한 샘플 준비 하 비교적 간단 하 고 신뢰할 수 있는, 재현성 메서드를 설명 하는 억제제 반 정량적 실험 결과 사용 하 여입니다.

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프로토콜

1. 솔루션 준비

주: 시 소스에 대 한 재료의 표를 참조 하십시오.

  1. 이중 증 류 물 100 mL에 BSA의 5 g을 추가 하 여 5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 솔루션을 준비 합니다. Vortexing에 의해 그들을 완전히 혼합 그들. 최대 1 개월 4 ° C에서 솔루션을 저장 합니다.
  2. 5 %BSA 솔루션의 10 mL을 항 체 재고 솔루션의 10 µ L을 추가 하 여 올리고 머 방지 항 체 A11 솔루션 (1:1, 000)를 준비 합니다. Vortexing에 의해 그들을 완전히 혼합 그들. 최대 1 개월 4 ° C에서 솔루션을 저장 합니다.
  3. 5 %BSA 솔루션의 10 mL을 항 체 재고 솔루션의 10 µ L을 추가 하 여 안티-Aβ 항 체 6E10 솔루션 (1:1, 000)를 준비 합니다. Vortexing에 의해 그들을 완전히 혼합. 최대 1 개월 4 ° C에서 솔루션을 저장 합니다.
  4. 5 %BSA 솔루션의 10 mL을 항 체 재고 솔루션의 10 µ L을 추가 하 여 안티 원 올리고 머 항 체 OC 솔루션 (1:1, 000)를 준비 합니다. Vortexing에 의해 그들을 완전히 혼합. 최대 1 개월 4 ° C에서 솔루션을 저장 합니다.
  5. 이중 증 류 물 1000 mL에 트리 스 베이스의와 NaCl의 88 g 24 g을 추가 하 여 Tris 버퍼 염 분 (TBS) 재고 솔루션을 준비 합니다. PH 7.4에 조정 합니다. 최대 3 개월까지 4 ° C에서 솔루션을 저장 합니다.
  6. 준비는 Tris 버퍼 식 염 수와 트윈-20 (TBST) 솔루션 TBS의 100 mL에 트윈-20의 1 mL을 추가 하 여 재고 솔루션 및 900 mL 이중 증 류 물.
  7. 과산화 효소 (HRP) 염소-토끼 IgG (H + L) TBST 용액 10 ml와 사비의 추가 10 µ L에 의해 이차 항 체 솔루션을 준비 합니다. Vortexing에 의해 그들을 완전히 혼합 그들. 최대 1 개월 4 ° C에서 솔루션을 저장 합니다.
  8. 3.68 g 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 10 mM curcumin 재고 솔루션의 1 mL에 curcumin의 분해.
  9. 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-프로 판 올 (HFIP) 2.5 mg/mL Aβ 모노 머 솔루션의 2 mL에 합성 Aβ1-42 의 5 mg을 디졸브. 그것은 실내 온도 (25 ° C)에서 20 분 하 게 100 µ L aliquots에 대 한 놓고-20 ° C에서 최대 6 개월까지 저장 합니다.
    참고:이 절차를 가능한 한 빨리 실행 되어야 합니다. 피 펫 팁 정확한 pipetting 되도록 차단 한다.
  10. 1: 1의 볼륨 비율 ECL 액체 A와 B를 혼합 하 여 electrochemiluminescence (ECL) 액체를 준비 합니다. 이 솔루션은 그냥 사용 하기 전에 준비 되어야 한다.

2. 샘플 준비

참고: 분석 blotting 점 전에 2 일 샘플 준비를 수행 합니다.

  1. Aβ1-42 단위체 솔루션;의 튜브에 이중 증 류 물 900 µ L를 추가 Aβ1-42 의 농도 0.25 mg/mL를 될 것입니다. 20 분 동안 실내 온도에 있는 혼합물을 놓습니다.
  2. 볼륨은 약 850 µ L까지 고 순도 질소 가스와 함께 솔루션을 증발. Aβ1-42 솔루션의 농도 0.29 mg/mL에 대 한 것입니다.
    참고: 솔루션 HFIP는 완전히 증발 되도록 때때로 동요 되어야 한다. 일반적으로, 증발의 30 분 후 잔여 솔루션의 볼륨은 약 850 µ L.
  3. Curcumin 재고 솔루션 curcumin 작업 솔루션 (0.2와 2 µ M)을 두 번 증 류 물으로 희석. 믹스 Aβ1-42솔루션, curcumin 볼륨 비율 1: 1의 솔루션을 작동. Curcumin의 최종 농도 0.1 1 µ M를 될 것입니다.
    참고: 잠재적인 올리고 머 저 해제는 Aβ1-42 솔루션 필요한 경우 어떤 비율에서 섞일 수 있다.
  4. 마그네틱 교 반기에 솔루션을 지속적으로 흔들어 ( 재료의 표참조).
    1. 자석 교 반기에 플라스틱 분배기 상자를 수정 합니다. 장소 2 자석 막대 상자 2 코너에서 저 어 고 상자 중심에서 샘플 튜브를 배치.
    2. 48 h에 대 한 실 온 (25 ° C)에서 상자를 흔들어.
      참고: 자석 교 반기 속도 약 60 rpm.
  5. 4 ° C에서 15 분 동안 튜브 원심 및 18000 x g.는 상쾌한을 수집 합니다.

3. 점 Blotting 분석

참고: 모든 외피 수평 통에서 수행 됩니다.

  1. 니트로 막 1 cm 넓은 스트립으로 잘라.
    참고: 니트로 막의 폭 실험 필요에 따라 조정할 수 있습니다.
  2. 2 지구 (지구 1와 2) 0.5 cm에서 각 포인트 간격에 균등 하 게 2 µ L 샘플을 놓습니다.
  3. 밴드에 물방울이 건조 될 때까지 5 분 동안 실내 온도에 스트립을 놓습니다.
  4. 실 온에서 30 분 동안 5 %BSA 솔루션 스트립을 품 어.
  5. 실 온에서 5 분 동안 TBST 솔루션 스트립을 씻어.
  6. TBST 솔루션 발음 실 온에서 1 h, 스트립 1 올리고 머 방지 항 체 A11 솔루션을 품 어 및 안티-Aβ 항 체 6E10 솔루션 2 스트립.
  7. 씻어 TBST 솔루션 스트립 3 시간, 실 온에서 5 분 동안 각 시간.
  8. TBST 솔루션 발음 실 온에서 40 분 이차 항 체 솔루션 스트립을 품 어.
  9. 씻어 TBST 솔루션 스트립 3 시간, 실 온에서 5 분 동안 각 시간.
  10. 스트립의 표면에 혼합된 ECL 액체를 균등 하 게 적용 됩니다. 이미징 시스템 자동 화학에 스트립 노출 ( 재료의 표참조).
    참고: 일반적으로, ECL 액체의 300 µ L 충분 한 막 이다. 막 노출 동안 축축한 유지 되어야 한다. 노출 시간 이미징 시스템에 의해 자동으로 계산 됩니다.
  11. 반 정량적 결과 얻기 위해 ImageJ (국립 보건원) 또는 다른 이미지 처리 소프트웨어를 사용 하 여 회색 음영 분석을 할.

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결과

Aβ1-42 단위체 준비 후 Aβ1-42 올리고 머를 형성할 수 있습니다 여부를 조사 하기 가장 분석 사용 되었다. 아니 볼 수 집계는 HFIP 해산 Aβ1-42 단위체 샘플 (그림 1A)에서 관찰 되었다. 또한, 주위의 직경을 가진 주로 구형 집계 10-80 nm에서에서 관찰 되었다 Aβ1-42 샘플 떨고, 48 h 후 Aβ1-42 준비 (그림 1B) 후 올리고 형성 제안.

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토론

이 프로토콜에서 우리 Aβ1-42 올리고 머를 포함 하는 샘플을 준비 하 고 분석 blotting 점이 A11-긍정적인 Aβ1-42 올리고 머의 양을 분석 하는 방법을 보고 있다. Aβ1-42 올리고 머 풍부한 샘플의 준비에 대 한 우리의 방법을 아주 간단 하 고 신뢰할 수 있는, 재현할 수 있지만, 지금도 발견 될 몇 가지 포인트. 첫째, HFIP는 합성 Aβ1-42 펩 티 드를 분해 하는 데 사용 됩니다. 집계 Aβ1-42 펩 티 드 HFIP 솔루션에 단위체로 분해 수 있습니다. 그러나, HFIP volatilize, 쉽게 이며 HFIP의 점도 매우 낮습니다. 따라서, Aβ1-42 펩 티 드 HFIP으로 해산 한다 고 HFIP 솔루션 aliquoted 작업 중 HFIP의 잠재적인 손실을 줄이기 위해 가능한 한 빨리 해야 합니다. 또한,이 절차에서 정확한 pipetting 되도록 피 펫 팁 잘라 되어야 합니다....

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (U1503223, 81673407, 21475131), 비영리 기술의 강성 (2016 C 37110), 닝 보 국제 과학 및 기술에 적용 하는 연구 프로젝트에서에서 교부 금에 의해 지원 되었다 협력 프로젝트 (2014 D 10019), 생명 과학 및 의료 (2015 C 110026)의 닝 보 시 혁신 팀, 닝 보 과학 및 일반적인 부 (2017 C 50042)에 대 한 기술 프로젝트, 리 투 합 입 어 턱 케네스 리 해양 의약품 개발 기금, 그리고 닝 보 대학에서 K. C. 웡 마그나 기금.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
A11 (ab126892 Rb pAb에서 아밀로이드 올리고머로)AbcamGR91739-58
6E10 (베타-아밀로이드 토끼 Ab)세포  신호 기술2454S
OC (Anti-Amyloid Fibrils OC 항체)MilliporeAB2286
Horseradish Peroxidase (HRP) 마커 염소 안티 토끼 IgG (H+L) BeyotimeA0208
A&베타; 1-42GL Biochem52487
1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanolAladdinI1523078
CurcuminSigmaC1386
Albumin Bovine VSolarbioA8020
염화나트륨Sangon BiotechD920BA0003
도데실황산나트륨SCR30166428
TRISSolarbioT8060
글리신SolarbioG8200
  디메틸 설폭사이드SolarbioD8370
5× 비변성 젤 PAGE 단백질 마커BeyotimeP0016
Genshare CFAS anyKD PAGEGenshareJC-PE022
순수 니트로셀룰로오스 블로팅 멤브레인Pall CorporationT50189
메탄올SCR10014118
에탄올SCR10009218
초저 범위  단백질 마커SolarbioPR1300
전사 멤브레인Immobilon-PSQISEQ00010
BeyoECL StarBeyotimeP0018A
Commassie Blue 고속 염색 용액BeyotimeP0017
모두 자동 화학발광 이미징 시스템TanonTanon 5200
Image JNational 건강
이미지 처리 소프트웨어AdobePhotoshop CS6
자기 교반기Shanghai Huxi
연구소

참고문헌

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  3. Di Scala, C., Chahinian, H., Yahi, N., Garmy, N., Fantini, J. Interaction of Alzheimer's beta-amyloid peptides with cholesterol: mechanistic insights into amyloid pore formation. Biochemistry. 53 (28), 4489-4502 (2014).
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  11. Shiao, Y. J., Su, M. H., Lin, H. C., Wu, C. R. Echinacoside ameliorates the memory impairment and cholinergic deficit induced by amyloid beta peptides via the inhibition of amyloid deposition and toxicology. Food & Function. 8 (6), 2283-2294 (2017).

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재인쇄 및 허가

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