A11-긍정적인 β 아 밀 로이드 올리고 머 준비 및 평가 분석 Blotting 도트를 사용 하 여

Summary

이 프로토콜 분석 blotting 점이 상대적인 양의 Aβ 올리고 머를 평가 하는 합성 펩 티 드에 생체 외에서 에서 Aβ 올리고 준비 하는 방법을 설명 합니다.

Abstract

Β-아 밀 로이드 (Aβ)은 자체 집계로 조립 하는 본질적인 추세를 가진 소수 성 펩 티 드 이다. 다양 한 집계 중 Aβ 올리고 머 최고의 neurotoxin Alzheimer의 질병 (광고)의 진행으로 널리 인정 하 고 광고의 병 인에 중요 한 이벤트로 간주 됩니다. 따라서, Aβ 올리고 머 저 해제 수 neurodegeneration을 방지 하 고 수정 하는 질병으로 발전 될 가능성이 광고의 치료. 그러나, 다른 대형 프로토콜 Aβ 올리고 머의 다른 특성을 가진 올리고 발생할 수 있습니다. 또한, 효과적으로 화면 Aβ_1-42 올리고 머 억제제를 많은 방법이 되지 있다. A11 항 체는 항 병렬 β 장 구조와 독성 Aβ_1-42 올리고 머의 하위 집합으로 반응 수 있습니다. 이 프로토콜에는 합성 Aβ_1-42 펩 티 드에서 에 체 외에서 A11-긍정적인 Aβ_1-42 올리고 머-풍부한 예제를 준비 하 고 도트 blotting에 의해 상대적 양의 샘플에서 A11-긍정적인 Aβ_1-42 올리고 머를 평가 하는 방법 설명 A11 Aβ_1-42를 사용 하 여 분석-특정 6E10 항 체. 이 프로토콜을 사용 하 여, 억제제 A11-긍정적인 Aβ_1-42 올리고 머의 수 또한 상영 반 정량적 실험 결과에서.

Introduction

Alzheimer의 질병 (광고) 노인 전세계¹에 영향을 미치는 가장 중요 한 신경 퇴행 성 질환 중 하나입니다. 그것은 널리 β 아 밀 로이드 (Aβ)의 비정상적인 집계 광고의 주요 병 적인 요인이 될 수 있습니다 허용 됩니다. Aβ 집계 광고 환자의 두뇌에서 생물 학적 마커 중 치 패의 주요 구성 요소는. 또한, Aβ 집계, 특히 올리고 포함 하 여 광고 진행으로 신경 죽음의 원인이 될 수 있습니다 강력한 neurotoxicity 생산. 따라서, Aβ 올리고 머 형성의 저해 되지 않도록 neurodegeneration, 그리고 Aβ 올리고 머 저 해제 수정 하는 질병으로 발전 될 수 있는 광고의 치료. 많은 연구 올리고 시험관을 형성, 형태학 및 인공 Aβ 올리고의 구조를 탐구 하 고 생체 외에서 모델^2,3 를 사용 하 여 Aβ 올리고 머의 억제제를 조사 하는 합성 Aβ 펩 티 드를 사용 ^{, 그러나 4}., Aβ 올리고 머의 형성 프로토콜 다른 시험관에 다른 연구 그룹 사이에서 비교할 수 없는 결과가 발생할 수 있습니다 다른 형태학 상....

Protocol

1. 솔루션 준비

주: 시 소스에 대 한 재료의 표를 참조 하십시오.

1. 이중 증 류 물 100 mL에 BSA의 5 g을 추가 하 여 5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 솔루션을 준비 합니다. Vortexing에 의해 그들을 완전히 혼합 그들. 최대 1 개월 4 ° C에서 솔루션을 저장 합니다.
2. 5 %BSA 솔루션의 10 mL을 항 체 재고 솔루션의 10 µ L을 추가 하 여 올리고 머 방지 항 체 A11 솔루션 (1:1, 000)를 준비 합니다. Vortexing에 의해 그들을 완전히 혼합 그들. 최대 1 개월 4 ° C에서 솔루션을 저장 합니다.
3. 5 %BSA 솔루션의 10 mL을 항 체 재고 솔루션의 10 µ L을 추가 하 여 안티-Aβ 항 체 6E10 솔루션 (1:1, 000)를 준비 합니다. Vortexing에 의해 그들을 완전히 혼합. 최대 1 개월 4 ° C에서 솔루션을 저장 합니다.
4. 5 %BSA 솔루션의 10 mL을 항 체 재고 솔루션의 10 µ L을 추가 하 여 안티 원 올리고 머 항 체 OC 솔루션 (1:1, 000)를 준비 합니다. Vortexing에 의해 그들을 완전히 혼합. 최대 1 개월 4 ° C에서 솔루션을 저장 합니다....

Results

Aβ_1-42 단위체 준비 후 Aβ_1-42 올리고 머를 형성할 수 있습니다 여부를 조사 하기 가장 분석 사용 되었다. 아니 볼 수 집계는 HFIP 해산 Aβ_1-42 단위체 샘플 (그림 1A)에서 관찰 되었다. 또한, 주위의 직경을 가진 주로 구형 집계 10-80 nm에서에서 관찰 되었다 Aβ_1-42 샘플 떨고, 48 h 후 Aβ_1-42 준비 (그림 1B) 후 올리고 형성 제안.

Discussion

이 프로토콜에서 우리 Aβ_1-42 올리고 머를 포함 하는 샘플을 준비 하 고 분석 blotting 점이 A11-긍정적인 Aβ_1-42 올리고 머의 양을 분석 하는 방법을 보고 있다. Aβ_1-42 올리고 머 풍부한 샘플의 준비에 대 한 우리의 방법을 아주 간단 하 고 신뢰할 수 있는, 재현할 수 있지만, 지금도 발견 될 몇 가지 포인트. 첫째, HFIP는 합성 Aβ_1-42 펩 티 드를 분해 하는 데 사용 됩니다. 집계 Aβ_1-42 펩 티 드 HFIP 솔루션에 단위체로 분해 수 있습니다. 그러나, HFIP volatilize, 쉽게 이며 HFIP의 점도 매우 낮습니다. 따라서, Aβ_1-42 펩 티 드 HFIP으로 해산 한다 고 HFIP 솔루션 aliquoted 작업 중 HFIP의 잠재적인 손실을 줄이기 위해 가능한 한 빨리 해야 합니다. 또한,이 절차에서 정확한 pipetting 되도록 피 펫 팁 잘라 되어야 합니다........

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
A11 (ab126892 Rb pAb에서 아밀로이드 올리고머로)	Abcam	GR91739-58
6E10 (베타-아밀로이드 토끼 Ab)	세포  신호 기술	2454S
OC (Anti-Amyloid Fibrils OC 항체)	Millipore	AB2286
Horseradish Peroxidase (HRP) 마커 염소 안티 토끼 IgG (H+L)	Beyotime	A0208
A&베타; 1-42	GL Biochem	52487
1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol	Aladdin	I1523078
Curcumin	Sigma	C1386
Albumin Bovine V	Solarbio	A8020
염화나트륨	Sangon Biotech	D920BA0003
도데실황산나트륨	SCR	30166428
TRIS	Solarbio	T8060
글리신	Solarbio	G8200
디메틸 설폭사이드	Solarbio	D8370
5× 비변성 젤 PAGE 단백질 마커	Beyotime	P0016
Genshare CFAS anyKD PAGE	Genshare	JC-PE022
순수 니트로셀룰로오스 블로팅 멤브레인	Pall Corporation	T50189
메탄올	SCR	10014118
에탄올	SCR	10009218
초저 범위  단백질 마커	Solarbio	PR1300
전사 멤브레인	Immobilon-PSQ	ISEQ00010
BeyoECL Star	Beyotime	P0018A
Commassie Blue 고속 염색 용액	Beyotime	P0017
모두 자동 화학발광 이미징 시스템	Tanon	Tanon 5200
Image J	National 건강
이미지 처리 소프트웨어	Adobe	Photoshop CS6
자기 교반기	Shanghai Huxi