비 계, 3 차원 인슐린 표현 Pancreatoids 마우스 췌 장 창시자에 체 외에서 의 세대

정상적인 개발 및 생리의 메커니즘을 묘사 하는 것은 질병 병 인을 이해 하 고 궁극적으로 치료 방법을 육성에 답해야 합니다. 배양 및 분화 줄기 세포 개발의 신속 하 고 높은 처리량 분석을 수 있습니다, 그것은 기존의 신체의 세포 운명 조절 메커니즘에 관한 지식에 의해 제한 됩니다 고 인위적으로 개발에이 상대적으로 균질 성, 2 차원 상태^1,2. 뿐만 아니라 vivo에서 개발 틈새와 환경에서 서로 다른 세포 유형으로 외부 영향에 의해 영향을 받는 paracrine 신호 및 조직 지원 organogenesis, 가이드를 제공 하는 있지만 이러한 세포의 기능에 의존 하 고 또한 그들의 주변 지도^3,,45. 이러한 외부 단서의 중요성, vivo에서 마우스 모델의 힘 드는 자연과 분화 프로토콜의 한계를 감안할 때, 새로운 시스템 기본 개발 프로세스 및 생리학을 실험적으로 조사 필요 합니다.

Organogenesis, 생리학, 약물 효능 및 심지어 pathogenesis. 을 편리 하 고 적합 한 시스템을 제공 하는 3 차원, 복잡 한 organoids를 생성 하는 프로토콜의 출현 대 위⁶ 과 대 장⁷ 다른 시스템 organogenesis에 대 한 우리의 이해를 확장 했다 murine organoids를 설립, 연구 개발 복잡성 vivo에서 보다 적게 제한 하는 도구를 제공 하 그리고 생체 외에서 모델입니다. Murine organoid이 진보 때문 형성과 인간 만능의 출현 줄기 세포, 인간의 장⁸, 망막⁹, 신장^10,11, 그리고 대뇌¹² organoids 생산 되어,이 레 퍼 토리만 개발 메커니즘에 관한 기존의 지식에 의해 제한 됩니다.

질병의 무수 한 재앙 다른 췌 장 세포 유형, 외 분 비 췌 장 불충분¹³,¹⁴, 췌 장 염 포상 세포에에서 포상 세포와 덕트를 포함 한 췌 장 organoids의 생성은 특별 한 관심의 고 ¹⁵당뇨병 베타 세포입니다. 이러한 서로 다른 세포 유형의 개발에 관한 지식을 얻고 고 또한, 맞춤된 약물 검사 또는 이식에 대 한 플랫폼 역할을 할 수, 있습니다. 그들의 병 리를 이해에 도움이 수 있습니다. 이전, Greggio 외. 만들 murine 췌 장 organoids morphogenesis vivo에서 정리 하 고 모든 주요 췌 장 상피 세포의 구성 하는 조직, 3 차원, 복잡 한 구조를 개발 하는 방법 개발 유형^16,17. 이것은 췌 장 분야에서 앞으로 중요 한 단계 이다, 특히 만드는 세포에 생체 외에서 베타 세포 개발의 생물 학적 조사를 설정할 수 있습니다. 그러나, 내 분 비 세포의 부족은 organoids 조직, 틈새 상호 작용 수 및 교육용 신호¹⁷제공으로 이식 했다 하지 않는 한이 프로토콜에서 형성 했다. 틈새 시장, 무 겁 게 내 분 비 박 등 차별화^{3,4, 후기에 organogenesis의 초기 단계에서 개발 상피를 뒤 덮 었의 가장 큰 부분을 구성 하는 mesenchyme 18}. 개발 췌는 mesenchyme의 상호작용은 아직 외부 신호 및 생체 내에서 세포 복잡성을 유지의 중요성 organogenesis 연구의 또 다른 예.

여기, 우리는 3 차원 췌 장 organoids, pancreatoids, 해리 e10.5 murine 췌 장 창시자에서 불리를 생성 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 pancreatoids 네이티브 mesenchyme 유지, 부동성 조건에서 자기 조립 및 내 분 비 하는 베타 세포¹⁹의 강력한 수를 포함 한 모든 주요 췌 장 세포 종류를 생성. 이 방법은 이전 프로토콜 강력한 내 분 비 차별화 부족으로 내 분 비 발달의 분석을 위해 가장 적합 하다. 그러나, 췌 장 organoids에 대 한 프로토콜을 사용 하 여 Greggio 외. 췌 장의 상피 분기 및 morphogenesis의 분석에 대 한 더 적합에 의해 설명 된 대로 분기로 더 제한 됩니다 pancreatoids.

이 방법에 설명 된 모든 동물 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 베일 러 대학의 약에 의해 승인 되었다.

1. 마우스 배아 일 10.5 췌 장 창시자의 준비

그러나 참고:이 프로토콜 않습니다 필요가 없습니다 2 단계까지 무 균 조건 하에서 지켜질 해 부 도구를 소독 하 고 사용 하기 전에 70% 에탄올 스프레이에 최적입니다.

1. 해 부에 대 한 설정, 얼음 양동이 얼음에 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 컨테이너를 놓습니다. 두 개의 뾰족한 집게 및 해 부가 위 70% 에탄올으로 청소. 컨테이너를 3 개 이상 붕 모 세관 튜브, 입 피 펫, 라이터와 1000 µ L 피 펫 팁을 필터링 해 부 지역 근처 설정.
   1. 1.25 mg/mL 찬 dispase에 얼음에 12 잘 플레이트의 두 번째 잘 소독된 물에 희석의 적어도 1 mL를 준비 합니다. 첫 번째, 세 번째 및 네 번째에서 PBS를 넣어 12의 우물 잘 접시. 0.05%의 장소 1 mL Trypsin 1.5 ml에서 튜브 얼음에. 미리 따뜻하게 37 ^oc.에 떨고 인큐베이터
2. E10.5 타임-임신 쥐 IACUC 지침에 따라 안락사 복 부 지역 V 자형 절 개를 성 기 영역에서의 위와 집게를 사용 하 여 마우스를 하기 전에 청소 하 고 횡 경 막까지 계속 70% 에탄올 스프레이.
   참고:이 프로토콜에 질 플러그의 모양을 하루 0.5를 나타냅니다. 5-6 주 오래 된 마우스를 사용 하 여 이상의 2 g의 체중 증가 성공적인 임신의 보조 수단으로 역할을 합니다.
   1. 조심 스럽게 반대편에 반복 하기 전에 생식 기 지역으로 위쪽으로 마우스, 그리고이 절에 따라 장기를 당겨 자 궁의 맨 측면 부분에 절 개를 함으로써 자 궁을 삭제할. 10 cm 차가운 PBS와 페 트리 접시에에서 놓습니다.
      그러나 참고: 그것은 e10.5 pancreatoids와 달리이 organoids 특징 되지 않습니다 및 따라서 모든 세 가지 주요 췌 장 혈통으로 분화 하는 능력을 유지 하지 않을 수 있습니다 e11.5 해리 셀에서 organoids를 얻을 수 있습니다.
3. 가벼운 해 부 현미경 페 트리 접시를 놓고 하 고 신중 하 게 각 태아 사이 두 집게 배치 하 노른자위 낭에서 조직을 박 리 하 여 자 궁 조직을 엽니다. 집게와 10cm 신선한, 페 트리 접시에서 부드럽게 노른자위 sac를 파악 하 여 배아를 전송 차가운 PBS. 얼음에 페 트리 접시를 놓습니다.
   참고: 그것은 heedfully 강력한 제거 탯, 태아의 조직 고 구조적 무결성을 손상 시 키 지를 뽑을 수 선호 노른자위 낭 내에서 유지 하는 배아를 제거 하는 것이 중요.
4. 10 cm 배양 접시 뚜껑에 여러 PBS 방울을 배치 합니다. 이 방울을 사용 하 여 extraembryonic 조직 가시성을 보장 하기 위해 제거는 해 부 동안 배아를 전송. PBS 드롭 배아를 전송 하 고 나머지 배아 얼음 (그림 1A)에 PBS에 체류 하는 동안 집게를 사용 하 여 노 른 자 골목에서 부드럽게 제거 합니다. 가볍게 푸 하지 손상 조직 (그림 1B), 태아를 집게를 사용 하 여 새로운 PBS 드롭 배아를 이동 하기 전에 머리를 제거 합니다.
   참고: 조직 액체의 불투명도 따라 여기서 설명한 것 보다 신선한 PBS 방울을 더 자주 전송 되도록 해야 합니다.
   1. 새로운 PBS 드롭 forelimb 싹 집게 (그림 1B)를 사용 하 여 제거 합니다. 사지 새싹은 현재 오프닝으로 집게를 배치 하 고 부드럽게 anteriorly 가장 외부 조직만을 찢 어 (그림 1B). 배아를 회전 하 고 hindlimb 새싹에서 후부 방향으로 반복 합니다. 이 시점에서, 위장 표시 (그림 1B) 해야 합니다.
   2. 위장의 후부 지역의 약간의 굴곡 (그림 1 층) 있다. 위장과 체 벽의 척추 지역 사이이 벤드 뒤에 집게를 삽입 합니다. 위장, 가장 앞쪽 영역 심장 지역 (그림 1B-E)를 연결 하는 곳에 도달할 때까지 천천히 위쪽으로 작업을 분리 합니다.
      선택 사항: 원시 심장과 간 싹에서에서 제거만 연속 직감 튜브를 떠나 위 장관의 복 부 지역. 이 프로토콜을 수행 하는 처음 몇 번 그것은 두고 심장과 간 위장와 등 쪽 췌 장 새싹의 형태까지 복 부 랜드마크는 더 쉬울 수도 있습니다 (그림 1C 와 D 익숙한 ).
   3. 신선한 PBS 물방울에 위장을 전송.
   4. 집게를가지고 부드럽게 돌출 버드와 소장 아래 조직을 꼬 집 고 약간 들어올립니다 (그림 1D-F)을 외부 조직.
      참고: 등 쪽 췌 장 새싹은 위장과 소장 (그림 1C G) 사이 있습니다. 아래 췌 장 새싹 라운드, 혹 구조 (그림 1G) 처럼 보이게 한다.
   5. 꽃 봉 오리 핀치 위로 새싹 (그림 1G)을 완화 하 고 소장에 연결 집게에 놓습니다. 얼음에 차가운 PBS에 12 잘 플레이트의 첫 번째 우물에 꽃 봉 오리를 전송 하기 전에 새로운 PBS 거품에 한 번 씻어. 모든 새싹 및 배아에서 수집한 12 잘 플레이트의 첫 번째 우물에 배치 될 때까지 반복 합니다.
5. 가벼운 해 부 현미경 아래 12 잘 접시를 놓습니다. 성공적으로 나중에 분할 비율을 계산 해 부 췌 장 새싹의 수를 계산 합니다.
   1. 장소는 모 세관 튜브 입 피 펫에 필터링 된 1000 µ L 피 펫 팁 첨부. 화 염 모 세관 튜브를 소독 하 고 사용의 용이성에 대 한 튜브에 벤드를 만듭니다. 모 세관을 사용 하 여 깨끗 한 PBS (그림 1G)와 세 번째 우물을 전송 하기 전에 2 분 동안 두 번째 잘 포함 하 찬 dispase 솔루션에 싹을 전송.
      참고: 꽃 봉 오리를 dispase에서 PBS를 전송 하는 동안 조직 모 세관 튜브의 팁을 만지지 마십시오. 조직 관의 끝에 걸리면, 위쪽 및 아래쪽 플라스틱 또는 느슨하게 때까지 깨끗 한 PBS 솔루션에 흔들.
   2. 꽃 봉 오리를 아래로, 플라스틱 그리고 깨끗 한 PBS 가진 4 잘 전송. 마지막으로, 0.05%는 1.5 mL 튜브에 새싹 모 세관 장치 전송 사용 하 여 트립 신. 미리 데워 진된 37 ^oC 셰이 커에 튜브를 놓고 4 분 1500 rpm에서 흔들어.
   3. 약 10 소용돌이 s 다음 즉시 튜브에 배치는 원심 분리기와 200에서 5 분 동안 스핀 g. centrifuged 세포 (그림 1G)을 방해 하지로 조심 스럽게 솔루션의 모든 하지만 약 50 µ L를 제거.

2. 경작 Pancreatoids를 형성 하기 위하여 해리 창시자

참고: 다음는 표준 살 균 절차를 사용 하 여 표준 조직 문화 후드에 메 마른 분위기에서 수행 합니다.

1. 수집 된 모든 새싹, centrifuged 셀 400 µ L organogenesis 미디어^16,17 (표 1)를 추가 합니다. 펄스 소용돌이 세 번 하 고 플레이트 100 µ L 당 낮은 첨부 파일 96의 잘 잘 플레이트, 싹 (그림 1G) 1:4 비율로 분할.
2. 시각화를 해리 셀 (그림 1H)를 자유롭게 떠 현미경 아래에서 확인 하십시오. 중간 속도에서 로커에 5% CO₂ 와 37 ^oC 인큐베이터에서 문화 접시를 놓습니다.
3. 매일 pancreatoids의 진행 상황을 모니터링 합니다. 신선한 미디어 3 일 마다 미세한 제어 후드 우물에서 pancreatoid를 떠나 있는 동안 제거에 신중 하 게 pipetting 미디어의 100 µ L를 바꿉니다. 또는 신선한 100 µ L 미디어의 입 피 펫 및 1000 µ L에 연결 된 붕 규 산 세관 피 펫 팁 필터링 새로운 잘 사용 하 여 전송 하는 pancreatoid에 추가할 수 있습니다.

3. 처리 Pancreatoids Immunofluorescent 이미징

1. Immunofluorescent 이미지 pancreatoids를 처리 하려면 먼저 4 %paraformaldehyde / PBS, pH7.4 (PFA) 솔루션 준비 합니다. 4%의 장소 50 µ L PFA는 96의 우물에 잘 플레이트.
   1. Pancreatoids 4% 신선한 잘으로 가능한 작은 미디어를 복용 하는 문화 매체에서 전송 1000 µ L 필터링 된 피 펫 팁 붕 규 산 모 세관 튜브 및 입 피 펫을 사용 하 여, PFA. 15 분 동안 실내 온도에 로커에 설정 합니다.
   2. 4%에서 pancreatoids 전송 3 신선한 PBS 세척의 총에 대 한 5-10 분 반복에 대 한 상 온에서 신선한 PBS의 100 µ L로 잘으로 PFA 바위.
      참고: 프로토콜 수 수 일시 중지, 여기 4 ^oC에서 PBS의 100 µ L에 최대 1 주일까지 저장 하는 pancreatoids와.
2. Wholemount 이미징 (경우 항 체는 섹션 3.3에에서 적합 한 대체 접근 권장. 그리고 3.4에서 현미경 검사 법.), PBS에서 블록을 0.1% 비 세제 (PBST)로 1 x PBS에서 50 µ L 5% 당나귀 혈 청으로 전송. 4 ^oC에서 하룻밤 바위 또는 양자 택일로 실 온에서 4 시간.
   1. 1 혈 청 5% 당나귀의 50 µ L에 희석 하는 주 항 체를 포함 하는 새로운 우물을 pancreatoids 전송 x PBST. 4 ^oC에서 24 시간 (36 h까지 하지만 적어도 12 h)에 대 한 최적의 바위.
      참고: 항 체 Chga (1: 100), DBA (1:400), Vim (1:400), 및 Pdx1에 대 한 재료의 테이블에 에서 나열 된 (1: 100) wholemount 얼룩;에 적합 다른 항 체 최적화가 필요할 수 있습니다.
   2. Pancreatoids 신선한 PBST 세척 하 고 실 온에서 30 분 동안 바위의 100 µ L를 포함 하는 잘 전송. 3 신선한 PBST 세척의 총에 대 한이 단계를 반복 합니다.
   3. 1 혈 청 5% 당나귀의 50 µ L에 희석 2 차 항 체를 포함 하는 새로운 우물을 pancreatoids 전송 x PBST. 빛에서 접시를 보호 하 고 4 ^oC, 락을 최적으로 24 시간 (36 h까지 하지만 적어도 12 h)에.
      참고: 테이블의 재료 와 DAPI 핵 counterstain에 나열 된 모든 이차 항 체는 wholemount 얼룩 적합 합니다.
   4. Pancreatoids x PBST와 바위 1에 3 개의 세척의 총 30 분 반복에 대 한 실 온에서 1의 100 µ L를 포함 하는 새로운 잘 전송 x PBST. 제 3의 그리고 마지막 세척에 추가 300 nM DAPI.
   5. 마지막으로, 깨끗 한 PBS의 저장소 4 ^oC 최상의 결과 즉시 얼룩 후 영상에서 온 confocal 현미경 검사 법에 의해 이미징 하기 전에 주일에 대 한 빛에서 보호에서 100 µ L을 넣으십시오. 이미징 동안 pancreatoids의 움직임을 방지 하지만 밖으로 건조 방지, PBS의 20 µ L 방울에 각 pancreatoid를 놓습니다. Pancreatoids 아직도 남아 있지, PBS 볼륨을 줄일 수 있습니다.
3. 냉동된 섹션에 대 한 pancreatoids에서에서 전송할 PBS 30% 자당 해결책 하룻밤에 4 ^o3.
   1. 해 부 현미경 거품에서 포함 미디어를 추가 합니다. 미세한 제어 집게를 사용 하 여 부드럽게 밀어 포함 미디어를 통해 여러 번 냉동 포함 미디어 조직 블록을 전송 하기 전에 잔여 자당을 제거 하 여 pancreatoids를 담근 다.
   2. 8 µ m에서 cryostat에 고정 될 때까지 드라이 아이스에 조직 블록 및 섹션을 놓습니다.
      참고: 섹션 저장할 수 있습니다-80 ^oC 또는 immunostained에 즉시.
   3. 섹션-80 ^oC 건조까지 약 5 분 동안 실 온에서 해 동 하실 수 있습니다. 소수 성 장벽을 조직과 5% 당나귀 혈 청 1에서 희석을 사용 하 여 블록 주위 소수 pap 펜을 사용 하 여 그리는 실 온에서 30 분 동안 x PBST.
   4. 미디어를 제거 하 고 기본 항 체 5% 당나귀 혈 청 1 x PBST에서 4 ^o3. 하룻밤에 희석에 희석 즉시 바꿉니다
   5. 기본 솔루션을 제거 하 고 씻어 조직 세 번 1 10 분 x PBST. 이것 다음, 이차 항 체 솔루션 5% 당나귀 혈 청 1에서 희석에 희석 추가 실 온에서 1 h x PBST 빛에서 슬라이드를 보호 하 고.
   6. 보조 솔루션을 제거 하 고 1에 슬라이드 세 번 씻고 10 분 x PBST. 마지막 세척에 추가 300 nM DAPI.
   7. 미디어를 제거 하 고 설치 미디어와는 coverslip 추가. 스토어 이미지 준비까지 멀리 빛 4 ^oC에에서 슬라이드.

4. 대 본 분석에 대 한 Pancreatoids에서 RNA의 격리

1. Pancreatoids 1.5 mL 튜브에 산 guanidinium 안산 클로 페 놀 프롬-솔루션의 500 µ L로 불 임 및 장소에 대 한 필터링 된 1000 µ L 피 펫 팁 입 피 펫에 연결 된 붕 규 산 모 세관을 사용 하 여 수집 합니다. -80 ^oC에 저장 하거나 즉시 RNA 격리를 진행.
2. RNA 격리에 대 한 필요한 경우 얼음 샘플을 해 동 하 고 클로 프롬의 100 µ L를 추가 합니다. 4 ^oC 15 분에 대 한 장소와 소용돌이 잘 미리 냉각 4 ^oc. 원심 분리기
   1. 장소 튜브 원심 분리기 및 스핀 4 ^oc.에서 12000 g에서 20 분
   2. 조심 스럽게 튜브 레이어 분리를 방해 하지 않는를 제거. 200 µ L 피 펫을 사용 하 여, 명확한 수성 해결책을 수집 하 고 흰색 단백질 층 및 분홍색 DNA 층에서 버퍼에 작은 금액을 뒤에 남겨두고 새로운 1.5 mL 튜브에 배치. 이 과정에서 아무것도 피 펫의 끝을 만지지 마십시오 하 고 1.5 mL 튜브의 벽을 만지지 마십시오.
   3. 수성 층과 소용돌이 포함 하는 새 튜브를 100% 소 프로 파 놀의 500 µ L를 추가 합니다. 앉게 실 온에서 20 분, 얼음, 더 이상 또는 최대 강수량 하룻밤 사이에 두고-20 ^oc.
   4. 4 ^oC를 작은 RNA에서 15 분 동안 12000 g에서 원심. 펠 릿을 방해 하지 않고는 소 프로 파 놀을 제거 합니다.
      참고: pancreatoids는 작은, 그것은 가능성이 펠 릿 표시 되지 것입니다.
   5. 감기, 75% 에탄올을 추가 하 고 여러 번 튜브를 반전. 원심 분리기에 놓고 에탄올과 9000 x g에서 2 분 동안 회전 4 ^oC. 제거에서 10 분 동안 9000 x g에서 회전 합니다.
   6. 200 µ L 피 펫을 사용 하 여 지역에 거주 하는 펠 릿 하지 않고 튜브에 어떤 나머지 에탄올을 제거. 잔여 에탄올의 증발 되도록 실 온에서 5 ~ 10 분에 대 한 튜브에 뚜껑 열어 둡니다.
   7. 깨끗 한, nuclease 무료 물 20 µ L에서 vortexing에 의해에 펠 릿을 resuspend.
      선택 사항: 열 RNA 65 ^oC 3 분 하 고 즉시 얼음에 반환 합니다. RNA-80 ^oC에 저장 하거나 즉시 반전 녹음 방송 및 정량에 사용 될 수 있습니다.

마우스 배아 자 궁 경적에서 e10.5에서의 주의 해 부 추가 해 부 (그림 1A)에 대 한 PBS에 손상 되지 않은 배아 항복 한다. 위장은 배아 (그림 1B), 내장 및 위 (그림 1C F)의 교차점에서 등 쪽 췌 장 새싹의 분별을 허용에서 효율적으로 제거할 수 있습니다. E10.5 췌 장 새싹 이전 특징 되었습니다; 창시자는 Pdx1, Sox9, Ptf1a, 및 Hes120,21,,2223을 표현 한다. 조직 처리 단계에 따라 천연된 췌 장 단일 세포 또는 세포의 작은 그룹 가벼운 현미경 검사 법 (그림 1G H)에 의해 구상 될 수 있다.

Organogenesis 미디어에서 이러한 부동성, 비 계 없는 셀 자체 조립 하 고과 문화 (그림 2A)에서 적어도 10 일 동안 계속 성장 하는 3 차원 pancreatoids로 구성. pancreatoids vivo에서 췌 장, 분기 morphogenesis 발생과 형태학 유사성이 있다. 유전자 변형 쥐를 사용 하 여, 실시간으로 다른 세포 유형 또는 과정을 모니터링할 수 있습니다. 예를 들어 Ins1 eGFP24 마우스를 사용 하 여 내 분 비 하는 베타 세포의 형성을 표시를 pancreatoids 수 수 몇 군데 베타 셀 개발 (그림 2B)을 시각화 하기 위해 매일. 또한, 문화 조건 변경, 추가 작은 분자, 약물, 또는 게놈을 조작, 뿐만 아니라 세포 운명 결정 평가 될 수 있다 그러나 구조 및 형태학에 있는 변화는 또한 조사 수 있습니다. 여기에 우리가 높은 농도에서 키 니 아 제 C 활성 제 단백질 phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA)의 응용 프로그램 표시 (160 nM), 상피 세포를 연결 하 고 분기 증가 pancreatoids, 느슨하게 이어지는 개발의 형태를 변경 19 (그림 2C).

췌 장의 상피 세포와 췌 장 mesenchyme 조직의 협회 평가, immunostaining 각 조직의 표식에 대 한 수행할 수 있습니다. 덕트 마커, DBA25,26, 내 분 비 표식, Chga27및 핵 DAPI에 의해 표시의 Immunostaining pancreatoids (그림 3A)에서 멀티 혈통 형성 공개. Mesenchyme 마커, Vimentin, 공동 췌 장의 조상 표식으로 물 (약 e15.5 e9.0)에서 Pdx1, 보여준다는 mesenchyme pancreatoid (그림 3B) 봉투. Immunostaining는 또한 종류의 세포의 다른 마커 뿐 아니라 Pdx1 공개 분기 구조, 형태를 검사 하 사용할 수 있습니다. 그림 3C, 우리는 상피 마커 Pdx1 및 베타 세포 마커 기능 사용 하 여 정량 분석, 창시자의 녹취 록에 대 한 얼룩 및 세포 분화에 의해 베타 셀 개발을 시각화 한 조상 유전자 등 평가 Pdx1 와 Hes1, 그리고 차별화 된 마커 Prss1, Prss3, Hnf6, Isl1, Nkx6-1, 및 Ins1 (그림 4).

그림 1: 해 부, 분리, 및 pancreatoid 세대에 대 한 e10.5 췌 장 창시자의 도금의 개요. (A) e10.5 배아의 명시 이미지. (B) 왼쪽 상단에서 시작 해 부 절차의 회로도 빨간색, 파선 영역 잘라내기, 녹색 지역은 위장을 나타냅니다. 첫째, 머리 forelimb 새싹의 제거 및 유기 체의 측면의 개통 다음 제거 됩니다. (C) 위장은 신중 하 게 제거, 관의 복 부 지역에서 튀어나와 심장과 간 싹. 복 부, 등 쪽 췌 장 새싹 및 장 수 될 시각, 대물 이미지와 같이. (D) 심장 및 간 새싹의 제거. 회로도 왼쪽에 고 명시 이미지 오른쪽에 있습니다. 등 쪽 췌 장 새싹의 주위 조직 (E) Pinching 버드 해 부에 대 한 노출 회로도 왼쪽에 고 명시 이미지 오른쪽에 있습니다. (F)는 위장 요로 명시 야 현미경 아래 등 쪽 췌 장 새싹으로. 왼쪽에 있는 이미지, 소장에서 벤드는 표시, 척추 지역에서 위장 분리 때 집게를 배치 될 수 있습니다. 오른쪽에 고배율 대물 이미지 모두 등 쪽과 복 부 췌 장 새싹을 보여 줍니다. (G) 등 쪽 췌 장 새싹 및 조직의 분리, organogenesis 미디어 물의 resuspension 전에 처리 및 도금의 제거. (H) 대물 이미지 도금 직후 해리 셀을 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2 : Pancreatoids 시간이 지남에 모니터링. (A) 주 1, 주 2, 및 3 일에서 pancreatoids의 명시 이미지. 바 규모 = 100 um. (B) 췌 장 morphogenesis 조사 문화 조건의 조작. 여기, PMA의 높은 레벨의 추가 하루 1과 2에서 명시 야 현미경 검사 법에 의해 시각으로 불린된 상피 구조와 증가 분기를 지도 한다. 스케일 바 하루 4, 5 일, 6 일, 하루 7, 및 eGFP 녹색에서으로 표시 된 베타 세포의 개발 일 9, 100 µ m. (C) Ins1-eGFP 마우스 pancreatoids =. 바 규모 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3 : Pancreatoids의 Immunostaining. (A) Immunostaining pancreatoid 녹색, 및 핵 DAPI에서 파란색으로 표시 Chga 여 빨간색, 내 분 비 세포에서 DBA에 의해 덕트를 표시 하려면 5 일에. (B) Immunostaining pancreatoid Pdx1 여 녹색에서 빨간색과 췌 장 창시자에 의해 Vimentin mesenchyme 표시 하려면 7 일에. (B) Immunostaining pancreatoid Pdx1 여 녹색에서 빨간색과 췌 장 창시자에 의해 인슐린 베타 세포를 7 일에. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4 : 대 본 분석. 창시자와 차별화 세포의 표식에 대 한 하루 7 pancreatoids의 양이 많은 PCR Vivo에서 murine 조직 비교 Scavuzzo 외 에 표시 됩니다. (2017). 결과 Gapdh으로 정규화 됩니다. N = 2, 스케일 바는 SEM. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

표 1입니다. Organogenesis 미디어입니다.

저자는 공개 없다.