방법 논문

Polysome Leishmania, 인간 세포 및 마우스 고환에서 프로 파일링

DOI:

10.3791/57600

⸱

2018년 4월 8일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Biochemistry, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Department of Biological Sciences, Texas Tech University, 3CISER (Center for the Integration of STEM Education & Research), Texas Tech University

이 논문에서

요약

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Polysome 프로 파일링 기술의 전반적인 목표 단백질 합성 하는 동안 개별 mRNAs 또는 transcriptome mRNAs의 변환 활동의 분석입니다. 방법은 단백질 합성 규제, 번역 활성화 및 건강과 여러 인간의 질병에 억압의 연구에 대 한 중요 합니다.

초록

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적절 한 단백질 식 및 오른쪽 금액에 적절 한 시기에 정상적인 세포 기능 및 빠르게 변화 하는 환경에서 생존의 기초 이다. 오랜 동안에, 유전자 표현 연구 transcriptional 수준에 대 한 연구에 의해 지배 되었다. 그러나, mRNAs의 정상 수준을 잘 단백질 생산, 연관 되지 않습니다 그리고 translatability mRNAs의 조건에 따라 크게 다릅니다. Leishmania, 기생충 같은 몇몇 유기 체에서 단백질 식이 주로 변환 수준에서 통제 된다. 최근 연구는 단백질 번역 dysregulation는 암, 대사, 신경 및 기타 인간의 질병 관련 된 시연 했다. Polysome 프로 파일링 단백질 번역 규칙을 공부 하는 강력한 방법입니다. 그것은 개별 mRNAs의 변환 상태를 측정 하거나 게놈 넓은 규모에 번역을 검토 수 있습니다. 이 기법의 기초 polysomes, 리보솜, 그들의 소 단위 및 자당 그라디언트를 통해 lysate는 세포질의 원심 분리 동안 무료 mRNAs의 분리 이다. 여기, 우리가 현재 보편적인 polysome 프로 파일링 사용 되는 프로토콜에 세 가지 모델-기생충 주요 Leishmania, 경작된 한 인간 세포 및 동물의 조직. Leishmania 셀 서 스 펜 션에서 자유롭게 성장 하 고 마우스 고환 동물 조직 샘플을 나타내는 부착 단층에서 경작된 한 인간 세포 성장. 따라서, 기술은 이러한 소스의 모든 적응 이다. Polysomal 분수의 분석을 위한 프로토콜 개별 mRNA 수준의 실시간 정량 Pcr에 의해 서쪽 오 점 및 전기 이동 법에 의해 리보솜 RNAs의 분석에 의해 단백질의 탐지를 포함 한다. 메서드는 분수의 질량 분광학에 의해 mRNAs 연관 깊은 RNA-seq에 의해 transcriptome 수준에 리보솜의 검사 및 리보솜 관련 단백질의 분석에 의해 더 확장할 수 있다. 메서드는 다른 생물 학적 모델을 쉽게 조정할 수 있습니다.

서론

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세포에 있는 유전자 발현의 규칙 transcriptional, posttranscriptional 및 posttranslational 메커니즘에 의해 제어 됩니다. 깊은 RNA 시퀀싱에서 전례 없는 수준에 게놈 넓은 규모에 정상 mRNA 수준의 연구를 수 있습니다. 그러나, 최근 연구 결과 밝혀 정상 mRNA 수준은 단백질 생산1,2와 항상 연결 되지 않습니다. 개별 성적표의 운명 매우 복잡 하 고 내부/외부 자극, 스트레스 등과같은 많은 요인에 따라 달라 집니다. 단백질 종합 동안에 유전자 발현의 규칙 변화에 신속한 대응에 필요한 식 컨트롤의 또 다른 레이어를 제공 합니다. 프로 파일링, 분리 및 리보솜, 적극적으로 번역의 시각화 polysome (또는 "polyribosome") 단백질 종합의 규칙을 공부 하는 강력한 방법입니다. 비록, 그것의 첫번째 실험적인 응용 프로그램 1960 년대3에 등장, polysome 프로 파일링은 현재 단백질 번역 연구4에서 가장 중요 한 기술 중 하나. 단일 mRNAs는 polysome의 형성을 선도 하는 하나 이상의 리보솜에 의해 번역 될 수 있다.....

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프로토콜

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모든 동물 치료 및 연구에서 얻은 조직의 취급 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 국가 학회에 택 사스 기술 대학 건강 과학 센터에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 수행 했다 건강 동물 복지 지침, 프로토콜 번호 96005입니다. 척 추가 있는 동물을 희생 하 고 지침에 따라 조직 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 준비 하십시오. 이러한 위원회 부족, 건강의 국가 학회 동물 복지 가이드라인을 참조 하십시오. 성인 (> 60 일 이전) C57BL/6 마우스 사용 되었다. 모든 동물 및 조직 기관 동물 관리 및 사용 위원회 건강의 국가 학회 동물 복지 지침에 따라 택 사스 기술 대학 건강 과학 센터에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 얻은 했다. 안락사, 단일 마우스 작은 챔버에 배치 했다 그리고 공중 약 30%로 점차적으로 전치 되었다 이산화탄소는 동물의 고통을 최소화 하 고 anesthetize. 호흡의 정지, 다음 우리는 조직 수확 전에 동물의 죽음을 확인 하 경부 전위를 사용.

주의: 라이브 Leishmania 경작된 한 인간 세포와 모든 작업 biosafety BSL-2 실험실 인증 캐비닛에서 이루어졌다.

1. 준비에서 세포질 Lysates의 Leishmania 주요

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결과

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이 연구에서는 3 개의 서로 다른 소스에 polysomal 프로 파일링 기술의 응용 프로그램 설명: 기생 주요 Leishmania, 경작된 한 인간 세포 및 마우스 고환. Leishmania 세포 현 탁 액에 있는 액체 매체에서 자유롭게 성장, 경작된 한 인간 세포 플레이트에 부착 단층에서 성장 하 고 마우스 고환 조직 샘플을 나타냅니다. 메서드를 사용 하면 다른 종류의 서 스 펜 션, 다양 한 종류의 조직, 또는 다른 유기 체에서 및 배양된 세포의 종류에 자유롭게 성장된 세포를 쉽게 조정할 수 있습니다. 접근 방식 4 개의 주요 단계로 구성 됩니다: lysate 준비, 자당 그라데이션 준비 및 ultracentrifugation 단계, polysome 분류와 샘플 컬렉션 뒤에 분수의 분석. 서로 다른 소스에서 세포는 수집, 세차 고 바늘 또는 Dounce 균질 화기를 통해 통행에 의해 세포의 용 해 버퍼에서 lysed. 원심 분리는 ly.......

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토론

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자당 기온 변화도 의해 polysome 분별 RNA와 결합 및 분수의 단백질 분석은 개별 mRNAs 또는 전체 translatome의 변환 상태 뿐만 아니라 변환 조절 단백질 요인의 역할을 분석 하는 강력한 방법을 정상적인 생리 적 또는 질병 상태 기계입니다. Polysomal 프로 파일링은 Leishmania transcriptional 제어 크게 결 석 하 고 유전자 표현 규제는 주로 발생을 포함 하는 trypanosomatids와 같은 유기 체에 있는 변환 규칙을 공부 하는 특히 적합 한 기법 동안에 번역.

여기, 우리 3 모델에 사용 되는 polysome 분별 프로토콜 설명: Leishmania 기생충, 경작된 한 인간 세포 및 마우스 조직. Polysome 분류 단계는 본질적으로;이 연구에 사용 된 다른 유기 체를 위해 동일 이다 그러나, lysate 준비 몇 가지 차이점이 있다. Leishmania 셀 액체 문화에서 성장.......

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공개 사항

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저자는 공개 없다.

감사의 글

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저자는 오디오 녹음에 대 한 칭이 감사합니다. 연구 택 사스 기술 대학 건강 과학 센터에서 창업 자금에 의해 지원 되었다 및 변환 신경 과학 및 치료제 (CTNT) 우수의 센터에 의해 부여 PN CTNT 2017-05 AKHRJDHW A.L.K.; NIH 교부 금에 의해 부분에서 R01AI099380 K.Z. 제임스 C. 퍼레이드와 순 영 R. Baca CISER (줄기의 통합 교육 및 연구를 위한 센터) 학자 고 프로그램에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Instruments:
Gradient 마스터Biocomp Instruments Inc.108
피스톤 그라디언트 분획기Biocomp Instruments Inc.152
분획 수집기Gilson, Inc.FC203B
NanoDrop OneThermo ScientificNanoDrop One
Nikon 도립 현미경NikonECLIPSE Ts2-FL/TS2
2720 Thermal CyclerApplied Biosystems by Life4359659
CO2 incubatorPanasonic Healthcare Co.MCO-170A1CUV
HERATHERM 인큐베이터Thermo Scientific51028063
생물 안전 작업대, 클래스 II, 유형 A2NuAire Inc.NU-543-400
Revco 냉동고Revco TechnologiesULT1386-5-D35
Beckman L8-M 초원심분리기, Beckman CoulterL8M-70
원심분리기Eppendorf5810R
원심분리기Eppendorf5424
초원심분리기 로터, SW41Beckman Coulter331362
스윙 버켓 로터EppendorfA-4-62
Fixed angle rotorEppendorfF-45-30-11
Quant Studio 12K Flex Real-Time PCR machine 285880228Applied Biosystems by life technologies4470661
TC20 Automated cell counterBio-Rad145-0102
HemacytometerHausser Scientific02-671-51B
<강력한>소프트웨어 
Triax 소프트웨어 Biocomp 악기 Inc.
Materials:
Counting slides, 세포 계수기용 이중 챔버Bio-Rad145-0011
1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브USA Scientific1615-5500
개방형 폴리클리어 원심분리기 튜브, (14 mm x 89 mm)Seton Scientific7030
주사기, 5 mLBD
BD 주사기 3 mL23 게이지 1 인치 니들BD10020439
Nunclon Delta 표면 플레이트, 14 cmThermo Scientific168381
Nunclon Delta 표면 플레이트, 9 cmThermo Scientific172931
Nalgene rapid-flow 90mm 필터 장치, 500 mL, 0.2 aPESThermo Scientific569-0020
BioLite 75 cm3 플라스크Thermo Scientific130193
Nunc 50 mL 코니컬 원심분리기 튜브Thermo Scientific339653
Chemicals:
Trizol LSAmbion by Life Technologies10296028
HEPESFisher ScientificBP310-500
Trizma baseSigmaT1378-5KG
둘베코의 변형 독수리 중고포도당(DMEM)시그마D6429-500ML
소 태아 혈청(FBS)시그마F0926-50ML
페니실린-스트렙토마이신(P/S)시그마P0781-100ML
리포펙타민 2000인비트로겐11668-019
둘베코의 인산염 완충 식염수( DPBS)SigmaD8537-500ML
염화마그네슘 육수화물(MgCl2x6H2O)아크로스 유기물AC413415000
염화칼륨(KCl)시그마P9541-500G
노니뎃 P 40(NP-40)플루카(시그마-알드리치)74385
재조합 나신 리보뉴클레아제 억제제PromegaN2511
헤파린 나트륨 염SigmaH3993-1MU
cOmplete Mini EDTA free 프로테아제 억제제Roche Diagnostics11836170001
GlycogenThermo ScientificR0551
WaterSigmaW4502-1L
CycloheximideSigmaC7698-1G
클로로포름Fisher Scientific194002
디티오트레이톨(DTT)Fisher ScientificBP172-5
에티듐 브로마이드Fisher ScientificBP-1302-10
에틸렌디아민테트라아세트산이나트륨 탈수물(EDTA)Fisher ScientificS316-212
OptimemLife Technologies22600050
퓨로마이신 디하이드로클로시그마P8833-100MG
SucroseFisher ScientificS5-3KG
트립신-EDTA 솔루션SigmaT4049-100ML
Hgh 용량 cDNA 역전사 효소 키트Applied Biosystems by life technologies4368814
Power SYBR Green PCR Master MixApplied Biosystems by life technologies4367659
HClFisher ScientificA144SI-212
이소프로판올Fisher ScientificBP26324
수산화칼륨(KOH)Sigma221473-500G
Anti-RPL11 항체Abcamab79352
리보솜 단백질 S6(C-8) 항체Santa Cruz Biotechnology Inc.sc-74459
1xM199SigmaM0393-10X1L
리튬 클로라이드SigmaL-9650
디메틸 설폭사이드(DMSO)Fisher ScientificD128-500
겔 로딩 버퍼 IIThermo ScientificAM8546G
UltraPure AgaroseThermo Scientific16500-100
트리클로로아세트산(TCA)Fisher ScientificA322-100
SuperSignal West Pico PLUS 화학발광 기질Thermo Scientific34580
포름알데히드Fisher ScientificBP531-500
황산나트륨(SDS)SigmaL5750-1KG
페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF)SigmaP7626-5G
RNeasy Mini kitQiagen74104
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)SigmaA1852-1VL
Cytosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (CTP)SigmaC1506-250MG
Uridine 5'-triphosphate trisodium salt hydrate (UTP)SigmaU6625-100MG
구아노신 5'-트리포스페이트 나트륨 염 수화물(GTP)SigmaG8877-250MG
SP6 RNA 중합효소NEBM0207S
피로포샤타제시그마I1643-500UN
스페르미딘시그마S0266-1G
Technologies , , , , , 309646라이드

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  2. Capewell, P., et al. Regulation of Trypanosoma brucei Total and Polysomal mRNA during Development within Its Mammalian Host.

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