후보 유전자 다중화 유전형과 질량 분석 임상 코 호트 연구에서 테스트

요약

복잡 한 인간의 질병에 기여 하는 유전 이체의 소설 메커니즘을 식별 수 있습니다. 여기, 후보 유전자 또는 유전자 통로 분석 낮은 비용 범위를 극대화 하 고 코 호트 기반 연구 의무가 멀티플렉스 유전형 접근 방식을 설명 합니다.

초록

복잡 한 질병 종종 질병 민감성에 기여 하는 여러 일반적인 유전자 변종에 의해 underpinned 아 르. 여기, 우리는 질량 분석, 있는 멀티플렉스 유전형 분석 결과 사용 하 여 임상 동료에 있는 유전자 통로 협회 조사 비용 효율적인 태그 단일 염기 다형성 (SNP) 접근을 설명 합니다. 우리는 예를 들어 음식 알레르기 후보 소재 시 Interleukin13 (IL13)를 조사합니다. 이 메서드는 효율적으로 지역 내의 공유 결합 불균형 (LD)을 이용 하 여 범위를 최대화 합니다. 선택 된 LD Snp는 다음에 설계 다중화 분석 결과 40 다른 Snp 동시에 분석할 수 있도록 비용 효율성을 향상. 연쇄 반응 (PCR) 단일 뉴클레오티드 확장명 대상 loci를 증폭 하는 사용 되 고 있는 amplicons 다음 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 시간의 flight(MALDI-TOF) 질량 분석을 사용 하 여 측정 됩니다. 원시 출력 소프트웨어, 엄격한 품질 관리 정 및 컷-오프를 사용 하 여 호출 하는 유전자 형을 분석 하 고 높은 확률 genotypes 되 고 데이터 분석에 대 한 출력.

서론

인간의 복잡 한 질병에 유전 이체 질병 민감성에 기여 하 고 이러한 변형 측정 이해 병 인, 고 위험 환자 그룹, 및 치료 조치를 식별 하는 데 유용 있을 수 있습니다. 실제로, 정밀 의학의 약속은 환자 서브 그룹¹을 식별 하는 게놈 정보를 이용 하 여 의존 합니다. 불행히도, 공간 내에 복잡 한 질병 생물학, 어디 질병 고기 상당한 유전이 성분, 낮은 penetrance, 가변 표현력에 의해 underpinned 아 르, 일대 소설 식별을 게놈 넓은 접근에 대 한 요구 사항 크기 후보 들은 엄청나게 큰^2입니다. 또한, 대상된 후보 유전자 접근 질병 병 인³특정 유전자/경로 대 한 선험적 가설으로 시작합니다. 경로 분석 도구 일반적으로 탐구 될 수많은 후보 경로 생성 한 확인된 대상 loci의 이상 조사 하는 데 사용 됩니다. 여기 다중화 유전형 접근 인간의 코 호트 연구⁴에 적합 한 분석 결과 함께 Snp의 수백 수만의 조사에 대 한 수 있도록 설명 합니다. 이 방식은 상대적으로 높은 통해-넣어, 수백 수 소설 발견 연구에 대 한 genotyped DNA 샘플의 수천 및 특정 경로 조사를 허용 합니다. 여기에 설명 된 메서드는 유용 식별 위험 대립 유전자 및 임상 특성의 그들의 협회에 대 한 상대적으로 신속 하 고 저렴 한 방식으로 합니다. 이 플랫폼은 미생물 감염⁷ 및 인간 유 두 종 바이러스⁸등에 대 한 검사 및 진단 목적^5,6, 최근, 매우 유리한 되었습니다.

이 프로토콜은 조사, 즉유전자의 세트의 선택과 시작., 일반적으로 문학 검색, 또는 질병 과정;에 참여에 대 한 선험적 가설을 통해 결정 대상 지역 또는 아마도 검색 게놈 넓은 협회 (GWA) 연구의 주요한 연결으로 복제에 대 한 선택. 유전자 집합에서 연구원 태그 Snp의 세련 된 목록을 선택 합니다. 즉, 결합 불균형 (LD), 또는 지역에서 변종 사이 상호 관계는 haplotype 이라고 높은 LD에 Snp의 그룹에 대 한 대표 '태그 SNP' 식별 하 데 사용 됩니다. 지역의 높은 LD는 유전형 한 SNP는 haplotype에서 모든 Snp에 변화를 표현 하기 위해 충분 한 Snp는 함께 상속 자주는 것을 의미 합니다. 또는, 많은 지역, 예를 들어에서 Snp의 최종 목록에 다음과 같은 경우., GWA 연구에 대 한 복제,이 프로세스 해야 하지. 멀티플렉스 유전형 분석 결과 다음 설계 되어야 합니다 이러한 목표 주위는 증폭 뇌관 연장 뇌관의 질량 다른의 고 해석할 생산 제품 질량 스펙트럼. 이 매개 변수는 멀티플렉스 유전형 분석 결과 디자인 도구에 의해 쉽게 구현 됩니다. 이 디자인에서 앞으로 역 뇌관 관심의 마커를 대상 하는 SNP를 포함 하는 시퀀스를 증폭에 사용 됩니다. 확장 뇌관은 Snp에 직접 인접 연결 하 고 단일, 대량 수정, '터미네이터' 기반은 SNP에 보완을 추가 됩니다. 터미네이터 자료 추가 DNA의 확장을 방지합니다. 기지의 대량 수정 파편을 질량 분석에 의해 감지 되는 단일 자료에 의해 다른 수 있습니다. 유전형 화학을 포함 하는 접시 측정 질량 분석 플랫폼에 대 한 칩에 적용 됩니다. 시스템에 의해 감지 원시 유전형 호출에 적절 한 품질 제어를 적용 한 후 데이터는 수출 고 연관 질병 고기에 대 한 테스트에 통계 분석을 위해 사용 될 수 있습니다.

프로토콜

여기서 사용 하는 유전 물질은 윤리적으로 사용 하기 위해 승인 사무실 어린이 HREC (인간 연구 윤리 위원회) (CDF/07/492), 인간 서비스 HREC의 부서에 대 한 (10/07)와 로얄 어린이 병원 (RCH) HREC (27047).

1. 설계 다중화 분석 결과

1. 시험 디자인에 대 한 SNP 목록을 준비 합니다.
   1. Haploview (https://www.broadinstitute.org/haploview/downloads)의 늘어진 장식을 붙이는 기능으로 대상 영역을 입력 합니다. 필요한 변형 수가 가장 적은 원하는 영역의 전체 범위를 제공 하는 Snp, 목록을 생성 하는 대상 지역에 걸친 Snp 사이 LD (상관 관계, r²)를 사용 합니다. 사용자 정의 된 임계값 위에 상관 캡처 모든 대립 유전자는 Snp의 목록 생성 (예., r² ≥0.8).
2. 앞으로, 리버스, 및 확장 뇌관에 대 한 적절 한 시퀀스의 식별
   1. 선택의 분석 결과 디자인 도구로 Snp의 생성 된 목록을 입력 합니다.
      참고: 다음 지침은 재료의 테이블에에서 지정 된 대로 대표적인 결과 생성 하는 데 사용 하는 분석 결과 디자인 도구에 적용 됩니다.
   2. 일단 분석 결과 디자인 도구에 착수 했다, 새로운 유전형 디자인을 선택 합니다. 디자인 이름 필드에 시험 디자인에 대 한 이름을 입력 합니다.
   3. 텍스트 입력 편집 지침 rs 또는 FASTA는 버튼의 왼쪽에 표시 된 단추를 클릭 하 여 단계 1.1.1에서에서 생성 된 SNP 리스트를 제공 합니다.
      참고: Snp 참조 (rs) SNP Id 텍스트 목록으로 입력 하거나 수 FASTA 형태로 업로드 하거나 SNP 그룹 파일 형식 도구에서 사용 합니다. 이러한 형식의 파일을 업로드 하려면 파일 업로드 버튼을 선택 합니다. '음,' 불리 한 분석 결과에 디자인할 수 있는 변종의 상한 40 Snp 이다. Snp; 실행을 시작 하기 전에 디자인에 대 한 우선 순위를 지정할 수 이 처음 디자인 될 것 이다. Snp 컨트롤을 지정할 수 있습니다: 예를 들어 성별 샘플 혼합 ups 또는 그 충분 한 서식 파일을 결정 하는 컨트롤을 검색 하는 분석 결과 추가 되었습니다 낮은 또는 가난한 품질 DNA 사용 하는 경우. 그러나, 제어 및 우선 순위 Snp를 사용 하 여 단일으로 잘 디자인할 수 있는 Snp의 수를 줄일 수는 주목 한다.
   4. 프리셋 메뉴에서 높은 멀티플렉싱 iPLEX 사전 설정 옵션을 선택 합니다. 유기 체 메뉴에서 genotyped 수 DNA 파생 되는 유기 체를 선택 합니다. 여기에 제시 하는 대표적인 결과 대 한이 인간 이었다.
      참고: 마우스와 소 유기 체 또한 호환 됩니다 도구. 하나 선택할 수 있습니다 또한 다른 식물 또는 미생물; 같은 다른 유기 체를 사용 하는 경우 그러나, 인접 Snp와 최적의 입문서 분야 찾는 자동화 된 단계 참조 게놈의 부재로 인해 제공 되지 않습니다.
   5. 데이터베이스 메뉴에서 게놈의 최신 빌드 또는 화학 메뉴에서 필요한 경우 다른 빌드를 선택 합니다. IPLEX 를 선택 하 고 다중 수준 필드 입력 다중화의 최고 수준: 40. 자, 실행 시작을 선택 합니다. "1 단계"의 도구 시작 됩니다.
      참고: 1 단계 동안 도구 검색 및 SNP 시퀀스 형식. 여기, 오류가 있는 경우 FASTA 파일 해야 되 고 필요에 따라 포맷 FASTA 파일의 서식을 포함할 수 있습니다. 다른 오류가 있는 경우 rs 번호 새로운 SNP rs 번호를 식별 하는 NCBI dbSNP 같은 SNP 데이터베이스에서 검색 되어야 다른 rs 번호와 병합 된 SNP rs 숫자입니다. SNP 주위 시퀀스 뇌관 디자인을 방해할 수 있는 모든 알려진된 인접 Snp에 대 한 검색 됩니다. 잠재적인 PCR 뇌관 사이트는 일반적인 확대 때문에 게놈에 있는 여러 개의 안타를 피하기 위해 게놈과 비교.
   6. "2 단계" 인접 Snp를 식별 됩니다 디자인 도구의 완성을 기다리고 있습니다.
      참고:이 단계에서 지원 하지 않는 유기 체를 사용 하는 경우이 정보는 사용할 수 있는 경우 IUPAC 주석에서 인접 Snp와 시퀀스 주석을. 이 단계; 오류는 거의 그러나, 잘못 된 참조 유기 체 또는 게놈을 선택 또는 cDNA 순서 게놈 DNA 보다 입력 된 경우 오류가 발생할 수 있습니다. 고급 설정 에서 2 단계 최적화를 Snp 특정 인구 내에서 작동 하는 경우는 인구에 따라 필터링 가능 하다. 또한 그 1% 주파수를 제외 하 여 희귀 한 Snp 밖으로 필터링 수 있습니다. 마지막으로, 유효한 상태 또는 인구 정보를 필요가 없습니다 Snp 원하는 경우 제외 또한 수 있습니다.
   7. "3 단계" 최적의 입문서를 식별 하는 디자인 도구의 영역의 완성을 기다리고 있습니다. 선호 하는 뇌관 위치 확인 되었습니다, 또는 다른 유기 체를 사용 하는 경우 수동으로 입력 뇌관 위치 입력된 시퀀스 (SNP 그룹 파일) 하 여 대문자로 선호 뇌관 지역과 낮은 시퀀스의 나머지와 함께 케이스, 선택 유지 경우 이 단계에 대 한 고급 설정 메뉴에서.
      참고: 단계 2 및 3에 대 한 오류가 포함 될 수 있습니다: (1) A 인접 SNP 솔루션 비템플릿 기반 마스크와 Isonine, 같은 보편적인 자료 올리고 주문 또는, 디자인 하나는 proxim의 대립 유전자의 각각 2 개의 뇌관 되는 뇌관의 디자인을 차단 알 SNP, 또는 일반적인 대립 유전자만을 디자인 한 뇌관. (2) 또 다른 일반적인 오류는 독특한 사이트를 식별 하려면 amplicon 길이 수정 하 고 솔루션 뇌관에 대 한 독특한 사이트를 식별 하기 위해 실패입니다. 이 문서에 사용 되는 도구에서 기본값은 80-120 bp. 이 "3에서 Amplicon 길이 설정 고급 설정 대화에서 60-400 bp에서 변경 될 수 있습니다. 최적의 입문서 영역 확인"및"4 Amplicon 탭의 밑에 또한. 디자인 분석입니다. " 둘 다 변경 됩니다 확인 하십시오. 그러나, 그것은 사용 하 여 DNA를 저하 하는 경우는 amplicon의 길이 늘리는 권장 하지 않습니다 주목 해야한다.
   8. 분석 결과 디자인 단계 ("4 단계" 디자인의 도구)의 완료를 기다리고, 여기 도구 확장 뇌관 및 다중화 디자인에 모든 Snp의 대립 유전자 사이의 최적의 패스 분리를 제공 하는 것을 목표로. 이 단계를 완료 한 후는 oligo 주문 선택의 공급 업체를 통해 쉽게 주문 형식이 올리고 순서 파일을 내보냅니다.
      참고: 확대 뇌관 (앞으로 (F)와 리버스 (R)) 디자인 80 ~ 120의 최적의 amplicon 크기 혈압. 증폭 뇌관 연장 뇌관 및 질량 스펙트럼 및 전반적인 PCR 성능에 대 한 충돌 하는 결과 피하기 위해 제품의 대량 달라 야 합니다. 확장 뇌관 15 ~ 30 뉴클레오티드 긴 (4500-9000 다) 3' 끝은 다형성의 사이트에 직접 인접 연결할 것 이다 있도록 설계 해야 합니다. 이러한 설정은 모두 대표적인 결과 생성 하는 데 사용 하는 도구에서 자동으로 설정 됩니다.
3. 올리고 머 공급자 로부터 선택한 도구와 순서 뇌관에서 디자인 내보내기: PCR 뇌관 (앞으로 역)의 각각의 25 nmol 그리고 100 nmol 확장 뇌관의 각각의. 대표적인 결과 생성 하는 데 사용 하는 뇌관 표 1 을 참조 하십시오.

2. 유전형 (1-2 일)

1. 증폭 뇌관을 준비 합니다.
   1. 동결 건조 된 프라이 머 주문 하는 경우 분자 수준의 물으로 다시 구성 하기. 100 μ M/μ의 농도 사용 하 여 정방향 및 역방향 뇌관 및 확장에 대 한 500 μ/μ.
   2. 수영장 앞으로 및 역방향 뇌관 주식 입문서로 각 멀티플렉스 분석 결과 대 한 혼합, 0.5 m m의 농도에서 각 뇌관을 포함.
      참고: 예를 들어, 400 μ 뇌관 풀 400 반응에 대 한:
      
      100 μ M/μ의 농도에 각 뇌관의 2 μ는 주식 입문서 풀 필요 합니다. 뇌관의 120 μ의 총 60 정방향 및 역방향 뇌관으로 30-플렉스 분석 결과에 대 한 것 (집중된 뇌관 풀) 필요. 280 μ 분자 급 물 것 다음 혼합 뇌관의 400 μ의 최종 볼륨을 추가할 수 있습니다.
2. 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)를 사용 하 여 증폭
   1. 100를 포함 하는 PCR를 위한 마스터 믹스를 만들 입문서 믹스의 nM dNTPs, MgCl₂, 2 mM의 500 μ M와 0.5 U DNA 중 합 효소 효소의 위에서 자세히 설명. 1 U는 26-플렉스 분석 보다 더 필요 합니다. 표 2를 참조 하십시오.
   2. 5-10 ng/μ의 농도에 게놈 DNA의 1 μ 함께 384-잘 PCR 판의 각 우물에이 혼합의 4 μ를 추가 합니다.
      참고: 품질 컨트롤 또한 비-템플릿 컨트롤 등 분석 결과와 이전 (테스트 실행) 하는 동안 수행한 긍정적인 컨트롤 플레이트에 포함 되어야 합니다. 다른 plate(s), 예를 들어에서 여러 DNA 샘플 여러 접시를 실행 하는 경우., 3 중에 간 plate 가변성에 대 한 기술 컨트롤로 실행 해야 합니다.
   3. 모든 액체는 격판덮개 우물의 바닥에 포함 되도록 장소에 접시 커버와 함께 실 온에서 1 분 동안 200 x g에서 격판덮개 원심
   4. 다음 thermocycler 조건으로 PCR을 실행: DNA 중 합 효소;를 활성화 하기 위해 94 ° C에서 4 분 보육 다음의 45 주기 (20 94 ° C에서 변성 s, 30 s 및 1 분에 72 ° C에서 확장을 위한 56 ° C에서 어 닐 링) 및 다음 3 분 참조 표 3에서 PCR 프로그램에 72 ° C에서 최종 확장.
   5. DNA 증폭 성공 되도록 agarose 젤 전기 이동 법을 수행 합니다. Agarose 분말 0.5% 트리 Borate EDTA (TBE) 버퍼를 혼합 하 여 만든 2% (w/v) agarose 젤에 PCR 제품 (로딩 버퍼의 3 µ L)와 1 µ L를 사용 하 고 100 V에서 45 분 동안 실행.
3. 새우 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (SAP) 정화 단계
   참고:이 단계는 합병 되지 않는 뉴클레오티드를 제거 하는 데 사용 됩니다. SAP 효소 앞에 곧 확장 반응 간섭에서 과잉 뇌관 및 합병 되지 않는 dNTPs를 방지 하기 위해 인산 염 그룹.
   1. 새우 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (SAP) 효소의 1.7 단위/μ, 10 x SAP 버퍼를 포함 하는 혼합 및 분자 급 물으로 볼륨을 구성 하는 마스터를 확인 합니다. 표 4를 참조 하십시오.
   2. 추가 2 μ의 SAP를 갓 만든 마스터 이미 PCR 반응에서 5 μ를 포함 하는 접시의 각 잘 혼합. 짧게 원심 그리고 thermocycler 그리고 효소 비활성화에 대 일 분 동안 85 ° C에서 40 분 동안 37 ° C에서 돌아갑니다. 표 5를 참조 하십시오.
4. 뇌관 연장 반응
   참고: 확장 뇌관 믹스에 확장 뇌관의 농도 크기 (선형 뇌관 조정-LPA)에 의해 조정 해야 합니다. 이것은 제품 (질량 스펙트럼)에 피크 강도에 반비례 관계 때문에 질량. 확장 뇌관 농도의 조정 같은 농도의 봉우리를 생산 하기 위해이 관계에 대 한 해결 합니다. 표 6 및 7에결과 제공 하는 대표를 생성 하는 데 사용 하는 뇌관을 조정. 제공 하는 볼륨 확장 뇌관 믹스의 1.5 mL를 생성 하는.
   1. Agena 생명과학 (' 선형 뇌관 조정 '), 질량 및 뇌관, 및 다중화 반응 (참조 에에서 뇌관의 총 수의 농도 대 한 조정에서 사용할 수 있는 그라데이션 알고리즘을 사용 하 여 각 뇌관에 대 한 희석 요인 계산 테이블 6 & 7). 각 뇌관 UEP 질량 선형 뇌관 조정 시트의 UEP_MASS 필드에 입력 합니다.
      참고: 뇌관에 대 한 대량 조정된 농도 산출 될 것 이다 자동으로 셀에 헤더 텍스트로 "대상 반응 농도 (µ M)." 뇌관 뇌관 수영장에 추가의 볼륨 헤더 텍스트 "수영장 (µ L)에 추가 될 볼륨 주식 뇌관." 셀에 출력 됩니다. 계산 된 농도를 만들기 위해 뇌관 풀에 추가할 수 물 볼륨 출력 텍스트 옆 셀에 "수 PCR 학년 RNase 무료 H₂O의 볼륨 추가 뇌관 수영장 (µ L)."
   2. 선형 뇌관 조정 파일에 지정 된 대로 각 뇌관의 볼륨 고 뇌관 풀 구성. 물 희석 뇌관 수영장 단계 2.4.1에서에서 결정 하는 알고리즘에 의해 계산의 볼륨을 추가 합니다.
      참고: 그라데이션 알고리즘 메서드를 사용할 수 없는 경우 또 다른 방법은 낮은 질량 및 높은 질량으로 뇌관을 분할 하 고 두 배 낮은 대량 그룹에 상대적으로 높은 대량 뇌관의 농도 추가 하는. 3 개 또는 4 개의 그룹 높은 플렉스 분석 결과 대 한 필요할 수 있습니다 (즉, 이상 19 Snp). 그러나,이 방법은 그라데이션 알고리즘 방법으로 최적의 통화 요금으로 생성 하지 것입니다.
   3. 확장 마스터 믹스를 조립. 낮은 플렉스 분석 결과 (1-18 플렉스)에 대 한 추가 버퍼의 0.2 μ, 종료 믹스의 0.1 μ, LPA 조정 뇌관 믹스의 0.94 μ (얼음에 준비) 효소의 0.0205 μ. 높은 플렉스 분석 결과 (19-36 플렉스)에 대 한 종료 믹스와 효소 (종료 믹스 0.2 μ와 iPLEX 효소 0.041 μ)의 두 배 농도 추가 합니다. 표 8을 참조 하십시오.
   4. 지금 잘 당 9 μ에 총 볼륨을 데리고 이전 반응에서 접시를 확장 반응 마스터 믹스의 2 μ를 추가 합니다. 짧게 원심과 thermocycler에:는 30 s 초기 보육, 5에 대 한 1 x 94 ° C의 40 주기 위해 94 ° C s 5 x (52 ° C 5에 대 한 s, 80 ° c 5에 대 한 s), 그리고 3 분 표 9를 참조에 대 한 다음 72 ° C.
5. 수 지 정화입니다.
   참고: 초과 소금 지금 수 지의 사용으로 반응에서 제거할 수 있습니다.
   1. 25 μ까지 접시에 볼륨을 데 려 검색 된 격판덮개의 우물에 이온된 수의 16 μ를 추가 합니다.
   2. 수 지, 6mg 일반적으로 보조 개 수 지 플레이트 (별도 구입), 전체 접시를 균등 하 게 적용 됩니다. 실 온에서 20 분의 수 지 보조 개 접시에 반응 판에 적용 하기 전에 건조 수 지를 둡니다. 수 지의 추가, 후 회전 실 온에서 5 분에 대해 직접 또는 저속에서 서 스 펜 션 믹서 (예., 7.5).
      참고: 유전형 칩에 유전형 분석 하기 전에, 샘플 분석 결과 레이아웃 해야 합니다 수 입력 및 소프트웨어 인터페이스에 했다. 이 분석 결과 디자인 도구에서 디자인 요약 파일을 사용 하 여 얻을 수 있습니다.
6. 질량 분석 플랫폼에 측정.
   1. 질량 스펙트럼 칩에 수 지의 적용을 피하기 위해 5 분 동안 3200 x g에서 격판덮개 원심
   2. 플레이트 레이아웃 샘플의 실행에 앞서 시스템의 소프트웨어 인터페이스에 업로드 합니다.
      참고: 단계 2.6.3만 훈련 된 직원에 의해 수행 되어야 한다.
   3. 접시의 유전형 분석 혼합물 유전형 칩 분배 시스템에 적용 됩니다. 다음, 다음 플랫폼의 소프트웨어 인터페이스의 도움으로 해석 될 수 있는 실정이 혼합물에서 질량 스펙트럼을 생성 하기 위해 MALDI TOF 시스템에 칩을 로드 합니다.
      참고: 시스템 각 '패드,' 해당 질량 스펙트럼 칩의 유전형 판의 단일 잘 하에 UV 빛의 짧은 펄스를 감독 하 여 질량 스펙트럼을 생성 합니다. 이 펄스 탈 착 이온화는 분석의 결과. 이러한 이온화 하는 DNA 분자는 빨리 여행 하 고 무거운 이온에서 먼저, 검출기에 도달 가벼운 이온을 분리 높은 전압 정전기 분야에 의해 진공 튜브의 상단에 다음 추진 된다. 이러한 analytes의 "비행의 시간"에서 각 DNA 파편의 질량 결정 될 수 있다 하 고 따라서 뉴클레오티드 베이스는 SNP에 추정 될 수 있다 시스템에 의해 기록 됩니다.

3. 유전형 데이터

참고: 품질 관리와 데이터 해석 되지 않습니다이 방법론 종이의 초점. 그러나, 다음 다룰 것입니다 간략하게 질량 스펙트럼의 해석.

1. 수동 검사 및 질량 스펙트럼의 품질 관리
   참고: 원시 질량 스펙트럼 시스템에 의해 생성 되며 재료의 테이블에에서 나열 된 소프트웨어와 함께 분석 했다. 클러스터링 메서드는 가우스 혼합물이이 출력 확률 유전형 호출에 적용 됩니다.
   1. 분석 소프트웨어를 엽니다. 수 분석기를 선택 합니다. 파일 메뉴에서 파일에서 열기 우물 을 선택 하 고 단계 2.6.3에서에서 생성 된 스펙트럼 데이터와 xml 파일을 선택 합니다. 칩 이름에 대 한 실행 한다 표시, 선택한 384-잘 접시의 "신호등" 창에서 선택 된 Snp의 목록이 표시 됩니다 잘. 여기에서 각 SNP에 대 한 데이터 요소의 scatterplot 보려면 호출 클러스터 플롯 을 선택 합니다.
      참고: 낮은 강도 Snp에 대 한 '전화' 결과 적용 하는 것이 좋습니다. 대표 결과 사용 되는 소프트웨어는 클러스터링 크기 커트 오프 5, 기본 보다는 엄격한 품질 관리에 대 한 제안입니다. 이 설정은 매개 변수 에서 크기 구분 필드 에 게시물 처리 클러스터 창에서 조정할 수 있습니다. Autocluster 클러스터 분석을 실행 하려면 도구 탭에서 선택 합니다.
   2. 게시물 처리 창에서 데카르트 플롯을 검토 하 여 유전자 형 호출의 수동 검사를 수행 합니다. 분석 결과 창에서 관심과 후 처리 클러스터 탭에서 클릭의 SNP를 선택, 유전자 형 클러스터링 클러스터 음모 샘플 Id와 해당 genotypes SNP에 대 한 표시 됩니다.
   3. 유전자 형 전화 클러스터를 검토 하 고 얼마나 잘 각 개별 전화 SNP에 대 한 다른 호출 클러스터 평가. 소프트웨어 지도;에 대 한 각 유전자 형에 대 한 줄거리에 일부 경계 라인을 제공 합니다. IL13 SNP (그림 1)에서 유전자 형 호출 클러스터 플롯의 예를 참조 하십시오. 전화와 밀접 하 게 다른 통화와 클러스터 되지 않는 외부 클러스터, 명확 하 게 앉아 나 매우 낮은 강도는 datapoint 마우스 오른쪽 클릭 하 고 수동으로 없음 전화설정 변경 전화 를 선택 합니다.
   4. 높은 품질 유전형 데이터 스트림 분석을 위해 사용 되도록 Snp 및 QC 임계값, 예를 들면 90% 통화료와 개인 제외. 일단 적절 한 조정을 호출 데이터에 수행 된, 통계 응용 프로그램에 대 한 데이터를 내보냅니다. ( 재료의 테이블에에서 나열 된) 대표적인 결과 생성 하는 데 사용 하는 소프트웨어에서이 접시 데이터 선택 보기 메뉴에서 다른 이름으로 저장을 선택 하 고 이루어집니다.

결과

위에서 설명한 프로토콜, genotyped 우리는 Th2 면역 유전자 IL13 의 음식 알레르기의 경우 및 컨트롤⁹일대에 걸쳐 Snp를 태그. 우리 음식 알레르기 위험을 증가 하는 관심의 영역 내에 유전자 변형 여부를 테스트 하는 조상과 다른 잠재적인 covariates에 대 한 조정 하는 로지스틱 회귀 분석을 적용. 표 10 ⁹ 한 변형 rs1295686 도전 입증 된 음식 알레르기와 관련 된 우리는 동일을 사용 하 여 복제 일대에이 협회 다중화 유전형 접근 확인 보여줍니다. 메타 분석 결과에서 두 동료의 FA (표 11)⁹ IL13 의 협회의 강력한 증거를 제공합니다. 우리는 유전자 유추 하 고 가계는 가계 유익한 SNP 마커 패널 게시 패널

토론

여기, 다중화 된 유전형 질량 분석을 사용 하 여 방법을 설명 합니다. 대표 결과 MALDI TOF 질량 분석⁴ 분석 결과 화학 재료의 표¹³에 나열와 결합 하는 PCR를 사용 하 여 생성 되었다. 이 플랫폼으로 실험실에서 총 1,255 개인 40 h 이내 9 Snp에 대 한 11,295 genotypes 생성 했습니다.

우리는 생성 SNP 후보 유전자 IL13 발견 임상 코 호트 독립 복제와 음식 알레르기에 대 한 phenotyped에 대 한 데이터를 분석 하 여 유전자 가설에 기술의 유용성을 설명 합니다. 플랫폼은 DNA 품질 낮은 상대적으로 강력 하며 최소한의 시작 소재, 10의 입력 ng. 프로토콜의 중요 한 단계는 다음과 같습니다: 조심 최대한 SNP 포함 다중화 분석 실험에서 증폭 PCR, 성공적인 단일 동안 대상 지역의 성공적인 증폭 되...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
게놈 DNA	-	-	1 &뮤; L 농도 5-10 ng/μ L
Primers: 정방향 및 역방향 증폭 및 확장	IDT	-	프라이머 탈이온수 설계에 대한 원고 섹션 1.2.1 참조
	예: Milli-Q 물	-	18.2 M&Omega로 탈이온화됨;. cm 저항성
유전형 분석 시약 키트. iPLEX Gold Chemistry 시약 세트	Agena Bioscience	#10148-2	2.2.1, 2.3.1 및 2.4.2, 칩 및 수지
PCR 플레이트 (384-well)	Abgene	#ABGAB-1384	Abgene의 MassARRAY 시스템 플레이트에는 호환 가능한
Micropipettes			단일 및 8-채널
원심분리기가 있습니다.			384-웰 플레이트와 호환
가능 Thermocycler			2.2.4, 2.3.2 및 2.4.3에 자세히 설명된 PCR 프로그램과 호환됩니다
딤플 레진 플레이트	Agena Bioscience		6mg, 384웰
플레이트 로테이터
MassARRAY 분석기 4 시스템	Agena Biosciences		MALDI-TOF(매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 – 비행 시간) 질량 분석기.
RS1000 나노 디스펜서	Agena Biosciences
분석 디자인 스위트	Agena Biosciences		도구는 다중 유전형 분석 분석을 설계하는 데 사용됩니다
스타트 Taq			DNA 중합효소 효소
수지	Agena Biosciences		iPLEX 키트와 함께 제공