방법 논문

황색 포도상구균 Biofilm에 5-Aminolevulinic 산-중재 Photodynamic 치료의 효과 연구 하는 체 외에서 모델

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DOI:

10.3791/57604

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2018년 4월 16일

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1Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Eye & ENT Hospital, Shanghai Key Clinical Disciplines of otorhinolaryngology, Fudan University, 2Key Laboratory of Medical Molecular Virology of Ministries of Education and Health, Department of Medical Microbiology and Parasitology, School of Basic Medical Science, Shanghai Medical College of Fudan University, 3Department of Dermatology, Huashan Hospital, Fudan University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 원고는 황색 포도상구균 biofilm에 5-aminolevulinic 산-중재 photodynamic 치료 (PDT ALA)의 항균 효과 연구 하는 프로토콜을 설명 합니다. 미래에 PDT와 박테리아 biofilms의 치료 연구를 생체 외에서 모델을 개발 하는 것이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

초록

황색 포도상구균 (S. 구 균)은 pyogenic 및 조직의 감염을 일으키는 원인이 되는 일반적인 인간 병원 체. S. 구 균 감염은 항생제-저항 하는 긴장의 출현 뿐만 아니라 양식 biofilms 능력 때문이 아니라 근절 어렵다. 최근, photodynamic 치료 (태평양 서머 타임) biofilm 감염을 제어 하기 위한 잠재적인 치료의 하나로 표시 되었습니다 했습니다. 그러나, 더 연구 해야 우리의 지식의 기본 메커니즘 뿐 아니라 박테리아 biofilms에 미치는 영향을 개선 합니다. 이 원고는 5-aminolevulinic 산 (5-ALA), 실제 photosensitizer protoporphyrin IX (PpIX)의 선구자 PDT의 에 체 외 모델을 설명합니다. 간단히, 성숙 미 균 biofilms ALA와 incubated 되었고 그 후 빛에 노출. 그 후, 미 균 biofilm에 PDT ALA의 항균 효과 단위 (CFUs)를 형성 하는 식민지를 계산 하 여 정량 되었고 생존 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 (CLSM) 통해 얼룩이 지기 형광에 의해 시각. 대표 결과 미 균 biofilms에 PDT ALA의 강한 항균 효과 설명 했다. 이 프로토콜은 간단 하 고 PDT ALA와 S. 구 균 biofilms의 치료 연구를 생체 외에서 모델을 개발 하기 위해 사용할 수 있습니다. 미래에, 그것은 또한 최소한의 조정으로 다른 세균성 긴장에 대 한 다른 photosensitizers를 이용 하 여 초 연구에서 참조할 수 수 있습니다.

서론

S. 구 균 은 피부와 점 막의 인간의 호스트 colonizes는 중요 한 그람 양성 병원 체 이다. 양식 biofilms 능력 그것의 병 인1의 중요 한 측면으로 간주 됩니다. 박테리아 biofilms는 박테리아 세포 외 고분자 물질, 다 당 류, 단백질, DNA 등의 구성 되는 자체 제작된 매트릭스에 포함 된의 커뮤니티입니다. 이 행렬은 인간의 면역 체계와 현재 항균 요법2의 높은 수준에 기여 하는 세균성 감염의 지 속성에 중요 한 역할을 한다. 항생제는 여전히 biofilm 감염에 대 한 주요 치료 biofilms에 항생제의 효과 제한. 그것은 표시 되었습니다 이전 biofilms에 셀 10-1000 배 더 그들의 planktonic 대응3에 비해 항생제에 저항력이 있다. 따라서,이 문제를 정복 하기 위해 대체 전략 필요 합니다.

PDT, 세균 감염에 대 한 대안 치료는 적절 한 파장의 빛을 사용 하 여 photosensitizers를 활성화. 세포 벽을 방해, 효소, 비활성화 및 손상 DNA4대상 세포에 치명적인는 반응성 산소 종 (선생님)의 생산을이 끈다. 이 다중 대상 특성 PDT 치료에 저항을 개발 하는 박테리아에 대 한 어려운 있습니다.

이전 보고서5,6,에서에서 공부 하고있다 톨루이 블루 등 여러 photosensitizers와 세균과 곰 팡이 biofilms, 말라 카이트 그린, 메 틸 렌 블루, 염소 e6 및 porphyrins, PDT의 항균 효과 7,,89,10,11,,1213. 5-ALA, 실제 photosensitizer PpIX, prodrug 작은 분자량 및 신속한 허가12,14에 의해 특징입니다. 이러한 장점은 치료 응용 프로그램으로 PDT ALA 주요 잠재력을 제공합니다. Planktonic 박테리아에 PDT ALA의 효과 많은 그룹12공부 하고있다, 비록 박테리아 biofilms에 PDT ALA의 항균 효과 하지 아직 고 해명 했습니다. 한편, 이전 연구 사이 결과 비교 하기가 어렵습니다. 이유 중 하나는 다양 한 그룹에서 다른 프로토콜을 사용 하는. 따라서,이 프로토콜 이전 작업15에 따라 PDT ALA 시스템의 생체 외에서 모델을 설명 합니다. 이 모델의 효과 CFU 계산 및 생존 CLSM과 얼룩에 의해 확인 되었다.

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프로토콜

1. Biofilm 형성

  1. 96-잘 microplates에 Biofilm 형성
    1. S. 구 균 긴장 USA300 및 3 biofilm 형성 임상 긴장 (C1-C3)-80 ° c.에 저장 된 검색
      참고: 양식에 biofilms 결정 플레이트 분석 결과 의해 결정 되었다 임상 긴장의 능력15이전 설명.
    2. 5 mL tryptone 콩 국물 (TSB) 매체에 박테리아를 접종 하 고 하룻밤 고정 단계를 37 ° C에서 흔들어와 인큐베이터에서 배양.
    3. 원심 4000 x g 25 ° C에서 10 분에서 하룻밤 세균성 문화 하 고는 상쾌한 다음 삭제. 알 약 2.0 x 10의 최종 농도에 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 resuspend9 CFU/mL.
      참고:는 박테리아의 농도 광학 밀도 측정 하 여 예상 되었고 더 판에 의해 결정 수16을 포함 된 서 스 펜 션의 그 1 OD600 공개 1.5 x 108 CFU/mL.
    4. 1: 200 세균 현 탁 액 희석 (1.0 x 107 CFU/mL)에 TSB 매체 0.5% 포도 당을 포함 하. 셀 문화 취급 하는 폴리스 티 렌 96 잘 microplate의 각 음에 세균 현 탁 액의 200 µ L을 접종.
    5. 잘 산소 환경에서 24 h 동안 37 ° C에서 정적 microplate 품 어.
      참고: 성숙한 biofilm 형성을 위한 보육 시간 따라 달라질 수 있습니다 다른 세균성 긴장; 이 PDT15실험 하기 전에 결정 되어야 합니다.
    6. 우물에서 미디어를 삭제 하 고 PBS와 부드럽게 microplate 우물 세 번 세척 하 고는 상쾌한 다음 삭제.
      참고: 단계 실행 되어야 한다 밖으로 매우 부드럽게 형성된 된 biofilm을 방해 하지 않으려면.
  2. 요리에 Biofilm 형성
    1. TSB 매체의 5 mL로 S. 구 균 긴장 USA300를 inoculate 하 고 고정 단계로 하룻밤 37 ° C에서 흔들어와 인큐베이터에서 배양.
    2. 원심 4000 x g 25 ° C에서 10 분에서 하룻밤 세균성 문화 하 고는 상쾌한 다음 삭제. 2.0 x 10의 최종 농도에 PBS에 산 탄을 resuspend9 CFU/mL. 다음, 1: 200 세균 현 탁 액 희석 (1.0 x 107 CFU/mL)에 TSB 매체 0.5% 포도 당을 포함 하. 35 m m 광학 품질 유리 아래 셀 문화 접시에, 세균 현 탁 액 2 mL를 접종 하 고 정적으로 24 시간 동안 37 ° C에서 품 어.
      참고:는 박테리아의 농도 광학 밀도 측정 하 여 추정 되었다.
    3. 피 펫와 함께 미디어를 발음 하 고 린스는 biofilms에 부드럽게 PBS 가진 접시 3 번 후, 신중 하 게는 상쾌한을 삭제.
      참고: 접시의 바닥에 피 펫 팁을 만지지 마십시오. 2.2 단계 형성된 된 biofilm의 건조를 방지 하기 위해이 단계 후에 즉시 수행 되어야 한다.

2. 가벼운 방사선 조사

  1. 4 ° C 냉장고에 5-ALA를 저장 합니다. 실험을 하기 전에 10 m m PBS 가진 5-ALA 희석.
    참고: 5-ALA 솔루션 준비 되어야 한다 갓 실험 전에.
  2. 실험적인 그룹에 미 판 또는 문화 접시 2 mL의 각 음에 10mm ALA의 200 µ L를 추가 합니다. 커버 플레이트/접시 알루미늄 호 일, 그리고 1 시간에 품 어. 다음, 1 h 633 ± 10 nm17의 주요 파장에서 360 J/c m2 의 가벼운 복용량을 달성 하기 위한 100 mW/cm2 의 빛 강도 발광 다이오드 (LED)와 플레이트/접시를 비추는.
    참고: 웰 스/요리의 모든 biofilm에 동등 하 게 효과적으로 배달할 빛 에너지를 하자, 6.0 cm에서 잘/요리 하는 광원의 절정에서 거리를 해결 하 고 중앙 조사 면적 (10 cm x 8을 실험 지역 제한 cm). 하려면 결과 재현성 실험 같은 실내 온도에서 수행 되어야 한다.
    LED 조사 단계에서 접시의 햇빛, 실내 조명 등 등불, 다른 광원에 직접 노출을 피하기 위해 LED는 방사선 조사 영역에 접시/접시를 이동 하기 전에 돌아서 빛 충분히 밝은 작업을 마무리 했다.
  3. 제어 그룹 (3 개의 제어 그룹 설치 되었다 우리의 실험)을 설정 합니다.
    1. 첫 번째 컨트롤에 대 한 그룹 (-LED-ALA)는 미 판 또는 문화 접시 2 mL 각 우물에 PBS의 200 µ L를 추가 합니다. 커버 플레이트/접시 알루미늄 호 일, 그리고 2 시간을 위해 그것을 품 어.
    2. 두 번째 컨트롤 그룹에 대 한 (ALA + LED-), 각 잘은 미 판 또는 문화 접시 2 mL에 10 mM ALA의 200 µ L를 추가. 커버 플레이트/접시 알루미늄 호 일, 그리고 2 시간을 위해 그것을 품 어.
    3. 세 번째 컨트롤 그룹에 대 한 (ALA-LED +), 각 잘은 미 판 또는 문화 접시 2 mL PBS의 200 µ L 추가. 커버 플레이트/접시 알루미늄 호 일, 그리고 1 시간에 품 어. 다음 접시 360 J/c m2 빛 주요 파장에서의 방사선 633 ± 10 nm17와 LED 노출 합니다.
      참고: LED 조사 단계에서 접시의 햇빛, 실내 조명, 등불 등 다른 광원에 직접 노출을 하지 마십시오.

3. PDT 치료의 효과의 결정

참고: S. 구 균 biofilms에 PDT ALA의 효과 확인 하려면 또는 PDT ALA 없이 세포의 생존 생존 얼룩 뿐만 아니라 CFU 계산 하 여 평가 되었습니다.

  1. 나머지 실행 가능한 박테리아 세포의 결정
    1. PDT ALA 치료 후 우물에서 미디어를 삭제 하 고 모두 실험에 대 한 모든 비 부착 한 세포를 제거 하 여 그룹 제어 PBS와 웰 스 세 번을 씻어.
      참고:이 단계가 수행 되어야 합니다 밖으로 아주 부드럽게.
    2. 피 펫 팁 우물에서 부착 박테리아 세포를 철저 하 게 긁 고 원뿔 튜브에 세포를 수집 합니다.
    3. 4 ° C에서 10 분 동안 4000 x g에서 세균 현 탁 액을 원심 다음 삭제는 상쾌한.
    4. PBS에서 0.25 %pancreatin 효소의 1 mL에 박테리아 resuspend와 1.5 h 37 ° C에서 품 어.
    5. 10 분;에 대 한 4000 x g에서 원심 상쾌한, 삭제 후 PBS의 200 µ L에 펠 릿을 resuspend.
    6. 확인 1시 10분; PBS와 셀 솔루션의 직렬 희석 그런 다음, 5 µ L tryptone 콩 agar (TSA) 접시에 각 직렬 희석 샘플의 추가. 16 h; 37 ° C에서 TSA 격판덮개를 품 어 그런 다음, 수를 셀 (맨 눈)에 의해 세균성 식민지 (CFU/mL)의.
  2. CLSM으로 S. 구 균 biofilms의 관찰
    1. 가벼운 방사선 조사 후 PBS로 문화 접시에 있는 biofilms 세 번 씻어.
      참고:이 단계가 수행 되어야 합니다 밖으로 아주 부드럽게.
    2. 1 µ M 녹색 형광 핵은 prokaryotic 세포 막 (예, SYTO9) 하 고 1 µ M propidium 요오드 화물 (PI) 죽은 세포 뿐 아니라 biofilm 얼룩을 20 분의 1 mL 침투성 이다 염색체 얼룩의 1 mL를 추가 합니다.
    3. 관찰 가능한 셀 (녹색 형광, 전 / Em 485 nm/530 nm) 및 죽은 세포 (빨간 형광, 전 / Em 485 nm/630nm)는 63 X 1.4 나 기름 침수 렌즈와 CLSM 아래.
    4. 현미경 소프트웨어를 사용 하 여 이미지를 생성 합니다.

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결과

biofilms에 있는 박테리아의 생존 컨트롤에 비해 PDT ALA 치료 후 감소 했다 (ALA-LED-, ALA + LED-, 그리고 살라-LED +) USA300에 3 개의 임상 변종 (그림 1).

CFU에서 결과 분석 결과 및 관찰 하는 항균 S. 구 균 biofilm에는 제자리에서USA300 biofilms에 PDT ALA의 효과 생존 얼룩과 CLSM으로 시각화 했다. 실용적이 고 죽은 세포는 각각 녹색과 적색 형광으로 얼룩진 했다. 이미지는 biofilms에 있는 박테리아의 대부분 이었던 CFU 분석 결과 (그림 2)의 결과와 일치를 살라-PDT에 의해 사망 했다는 것을 보여주었다.

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토론

초 암 치료에 대 한 잘 공부 치료 이후 100 여 년 전 발명 했다18. 지난 10 년간 초 항균 전략으로 적용 하 고12일부 항생제 내성 병원 성 박테리아 대 한 효과 보이고 있다. Planktonic 상태에 비해 박테리아 biofilms biofilms에 PDT ALA의 효과 없습니다 되어 완전히 아직 조사 하는 동안 항생제 치료3, 더 강한 것 처럼.

이 문서에서는, 생체 외에서 PDT ALA 시스템 설명 했다, 그리고 미 균 biofilms에이 모델의 항균 효과 입증 되었다. 두 방법은이 프로토콜에서 미 균 biofilms에 PDT ALA의 효과 테스트 하 사용 되었다. CFU 테스트 실행 가능한 세포 치료 후 계산 하 여 항균 효과 시연 하는 동안 CLSM과 얼룩이 지기 형광 생존 CFU 테스트...

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공개 사항

저자 공개할 게 없다

감사의 글

이 작품은 젊은 학자 (No. 81300810), 상하이 젊은 의사 훈련 프로그램 (No. 20141057), 및 자연 과학 재단의 중국 국가 (81671982, 81271791 및 81571955)에 대 한 자연 과학 재단의 중국 국가 의해 투자 되었다. 우리는이 원고 준비 기간 동안 언어 지원을 제공 하기 위한 LetPub (www.letpub.com)를 감사 하 고 싶습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Tryptone Soya Broth (TSB)OXOIDCM0129B
Tryptone Soya Agar (TSA)OXOIDCM0131
SYTO9Thermo Fisher ScientificL7012The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits 
Propidium iodide (PI)Thermo Fisher ScientificL7012The LIVE/DEAD BacLight 세균 생존 키트 
PancreatinSigma-AldrichP3292
5-aminolevulinic acid (ALA)Fudan Zhangjiang Bio-Pharm3.1
포도상구균 아우레우스 균주 USA300//The source of USA 300 참고 문헌 " 테노버 FC, 괴링 RV. J 항균 화학체모. 2009 년 9 월; 64(3):441-6"입니다.
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96웰 마이크로플레이트Corning Inc3599투명 평면 바닥 폴리스티렌 TC 처리 마이크로플레이트, 개별 포장, 뚜껑 포함, 멸균
FluorodishNEST Biotechnology801001유리 바닥, 비발열성
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mLEppendorf0030120086
Eppendorf microcentrifuge 5417EppendorfZ365998 |  SIGMA
인큐베이터Thermo Fisher ScientificSHKE4000MaxQ 4000 벤치탑 오비탈 쉐이커
발광 다이오드(LED)Wuhan Yage, 광학 및 전자 기술, COLED-IB
Leica TCS SP8, 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경Leica Microsystems
Leica LAS AF 소프트웨어Leica Microsystems
IMARIS 소프트웨어Bitplane
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참고문헌

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