황색 포도상구균 Biofilm에 5-Aminolevulinic 산-중재 Photodynamic 치료의 효과 연구 하는 체 외에서 모델

요약

이 원고는 황색 포도상구균 biofilm에 5-aminolevulinic 산-중재 photodynamic 치료 (PDT ALA)의 항균 효과 연구 하는 프로토콜을 설명 합니다. 미래에 PDT와 박테리아 biofilms의 치료 연구를 생체 외에서 모델을 개발 하는 것이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

초록

황색 포도상구균 (S. 구 균)은 pyogenic 및 조직의 감염을 일으키는 원인이 되는 일반적인 인간 병원 체. S. 구 균 감염은 항생제-저항 하는 긴장의 출현 뿐만 아니라 양식 biofilms 능력 때문이 아니라 근절 어렵다. 최근, photodynamic 치료 (태평양 서머 타임) biofilm 감염을 제어 하기 위한 잠재적인 치료의 하나로 표시 되었습니다 했습니다. 그러나, 더 연구 해야 우리의 지식의 기본 메커니즘 뿐 아니라 박테리아 biofilms에 미치는 영향을 개선 합니다. 이 원고는 5-aminolevulinic 산 (5-ALA), 실제 photosensitizer protoporphyrin IX (PpIX)의 선구자 PDT의 에 체 외 모델을 설명합니다. 간단히, 성숙 미 균 biofilms ALA와 incubated 되었고 그 후 빛에 노출. 그 후, 미 균 biofilm에 PDT ALA의 항균 효과 단위 (CFUs)를 형성 하는 식민지를 계산 하 여 정량 되었고 생존 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 (CLSM) 통해 얼룩이 지기 형광에 의해 시각. 대표 결과 미 균 biofilms에 PDT ALA의 강한 항균 효과 설명 했다. 이 프로토콜은 간단 하 고 PDT ALA와 S. 구 균 biofilms의 치료 연구를 생체 외에서 모델을 개발 하기 위해 사용할 수 있습니다. 미래에, 그것은 또한 최소한의 조정으로 다른 세균성 긴장에 대 한 다른 photosensitizers를 이용 하 여 초 연구에서 참조할 수 수 있습니다.

서론

S. 구 균 은 피부와 점 막의 인간의 호스트 colonizes는 중요 한 그람 양성 병원 체 이다. 양식 biofilms 능력 그것의 병 인¹의 중요 한 측면으로 간주 됩니다. 박테리아 biofilms는 박테리아 세포 외 고분자 물질, 다 당 류, 단백질, DNA 등의 구성 되는 자체 제작된 매트릭스에 포함 된의 커뮤니티입니다. 이 행렬은 인간의 면역 체계와 현재 항균 요법²의 높은 수준에 기여 하는 세균성 감염의 지 속성에 중요 한 역할을 한다. 항생제는 여전히 biofilm 감염에 대 한 주요 치료 biofilms에 항생제의 효과 제한. 그것은 표시 되었습니다 이전 biofilms에 셀 10-1000 배 더 그들의 planktonic 대응³에 비해 항생제에 저항력이 있다. 따라서,이 문제를 정복 하기 위해 대체 전략 필요 합니다.

PDT, 세균 감염에 대 한 대안 치료는 적절 한 파장의 빛을 사용 하 여 photosensitizers를 활성화. 세포 벽을 방해, 효소, 비활성화 및 손상 DNA⁴대상 세포에 치명적인는 반응성 산소 종 (선생님)의 생산을이....

프로토콜

1. Biofilm 형성

1. 96-잘 microplates에 Biofilm 형성
   1. S. 구 균 긴장 USA300 및 3 biofilm 형성 임상 긴장 (C1-C3)-80 ° c.에 저장 된 검색
      참고: 양식에 biofilms 결정 플레이트 분석 결과 의해 결정 되었다 임상 긴장의 능력¹⁵이전 설명.
   2. 5 mL tryptone 콩 국물 (TSB) 매체에 박테리아를 접종 하 고 하룻밤 고정 단계를 37 ° C에서 흔들어와 인큐베이터에서 배양.
   3. 원심 4000 x g 25 ° C에서 10 분에서 하룻밤 세균성 문화 하 고는 상쾌한 다음 삭제. 알 약 2.0 x 10의 최종 농도에 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 resuspend⁹ CFU/mL.
      참고:는 박테리아의 농도 광학 밀도 측정 하 여 예상 되었고 더 판에 의해 결정 수¹⁶을 포함 된 서 스 펜 션의 그 1 OD₆₀₀ 공개 1.5 x 10⁸ CFU/mL.
   4. 1: 200 세균 현 탁 액 희석 (1.0 x 10⁷ CFU/mL)에 TSB 매체....

결과

biofilms에 있는 박테리아의 생존 컨트롤에 비해 PDT ALA 치료 후 감소 했다 (ALA-LED-, ALA + LED-, 그리고 살라-LED +) USA300에 3 개의 임상 변종 (그림 1).

CFU에서 결과 분석 결과 및 관찰 하는 항균 S. 구 균 biofilm에는 제자리에서USA300 biofilms에 PDT ALA의 효과 생존 얼룩과 CLSM으로 시각화 했다. 실용적이 고 죽은 세포는 각각 녹색과 적색 형광으로 얼룩진 했다. 이미지는 biofilms에 있는 박테리아의 대부분 이었던 CFU 분석 결과 (그림 2)의 결과와 일치를 살라-PDT에 의해 사망 했다는 것을 보여주었다.

토론

초 암 치료에 대 한 잘 공부 치료 이후 100 여 년 전 발명 했다¹⁸. 지난 10 년간 초 항균 전략으로 적용 하 고¹²일부 항생제 내성 병원 성 박테리아 대 한 효과 보이고 있다. Planktonic 상태에 비해 박테리아 biofilms biofilms에 PDT ALA의 효과 없습니다 되어 완전히 아직 조사 하는 동안 항생제 치료³, 더 강한 것 처럼.

이 문서에서는, 생체 외에서 PDT ALA 시스템 설명 했다, 그리고 미 균 biofilms에이 모델의 항균 효과 입증 되었다. 두 방법은이 프로토콜에서 미 균 biofilms에 PDT ALA의 효과 테스트 하 사용 되었다. CFU 테스트 실행 가능한 세포 치료 후 계산 하 여 항균 효과 시연 하는 동안 CLSM과 얼룩이 지기 형광 생존 CFU 테스트.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Tryptone Soya Broth (TSB)	OXOID	CM0129B
Tryptone Soya Agar (TSA)	OXOID	CM0131
SYTO9	Thermo Fisher Scientific	L7012	The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits
Propidium iodide (PI)	Thermo Fisher Scientific	L7012	The LIVE/DEAD BacLight 세균 생존 키트
Pancreatin	Sigma-Aldrich	P3292
5-aminolevulinic acid (ALA)	Fudan Zhangjiang Bio-Pharm	3.1
포도상구균 아우레우스 균주 USA300	/	/	The source of USA 300 참고 문헌 " 테노버 FC, 괴링 RV. J 항균 화학체모. 2009 년 9 월; 64(3):441-6"입니다.
황색포도상구균 임상 균주(C1-C3)	/	/	모든 임상 균주는 푸단대학교 안과 및 이비인후과 병원의 만성 비부비동염 환자로부터 분리되었습니다[Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, et al. PLoS One. 2017 Mar; 12(3): e0174627].
96웰 마이크로플레이트	Corning Inc	3599	투명 평면 바닥 폴리스티렌 TC 처리 마이크로플레이트, 개별 포장, 뚜껑 포함, 멸균
Fluorodish	NEST Biotechnology	801001	유리 바닥, 비발열성
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL	Eppendorf	0030120086
Eppendorf microcentrifuge 5417	Eppendorf	Z365998 |  SIGMA
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