감자 루트 Exudates 균 Mycoides 의 Transcriptional 응답을 식물 세균 상호 작용:

요약

여기에 제시 된 프로토콜의 목표 endosphere 절연 균 mycoides 의 감자 루트 exudates에 transcriptomic 반응을 것입니다. 이 메서드는 식물-미생물 상호작용에 관련 된 중요 한 세균 유전자의 식별을 용이 하 게 하 고 원칙적으로 다른 endophytes 및 식물, 사소한 조정에 적용.

초록

유익한 식물 관련 박테리아 성장을 촉진 하 고 식물에 질병을 방지에 중요 한 역할. Biofertilizers 또는 biocontrol 대리인으로 식물 성장을 승진 시키는 rhizobacteria (PGPR)의 응용 프로그램 기존의 비료의 사용에 효과적인 대안이 되 고 저렴 한 비용에 작물 생산성을 높일 수 있습니다. 식물-미생물 상호작용 호스트 공장 분 비 신호 및 그들의 관련 된 박테리아에 의해 hereon 반응에 의존. 그러나 어떻게 유익한 박테리아의 분자 메커니즘 응답 그들의 관련 된 식물 유래 신호는 완전히 이해 되지 않습니다. 루트 exudates 박테리아의 transcriptomic 반응 평가 세균성 유전자 발현 rhizospheric 조건 하에서 규제를 결정 하는 강력한 접근 이다. 이러한 정보는 식물-미생물 상호작용에 관련 된 근본적인 메커니즘을 이해 하는 데 필요한 있습니다. 이 종이 transcriptomic 반응을 B. mycoides EC18, 감자 루트 exudates 감자 endosphere에서 격리 하는 긴장의 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 최근 높은 처리량 시퀀싱 기술의 도움으로,이 프로토콜은 몇 주 및 생산 대규모 데이터 집합에서 수행할 수 있습니다. 먼저, 루트 exudates B. mycoides 문화에 추가 되는 무 균 조건 하에서 수집 합니다. 이러한 문화에서 RNA는 상용 키트와 결합 하 고 자동화 된 전기 악기에 의해 품질 관리 대상이 페 놀/클로 프롬 방법을 사용 하 여 격리 됩니다. 시퀀싱, 데이터 분석 수행 됩니다 웹 기반 T-렉스 파이프라인 차동 표현한 유전자의 그룹을 식별 하는 후에. 이 방법은 세균 유전자 식물-미생물 상호작용에 관련 된 새로운 발견을 촉진 하는 유용한 도구입니다.

서론

식물 exudate rhizosphere¹, 즉, 뿌리 근처 토양의 좁은 영역에 뿌리를 통해 광합성 동안 고정 탄소의 최대 20% 수 있습니다. 더 높은 영양소 여부는 rhizosphere은 식물 성장을 승진 시키는 박테리아를 포함 하 여 다양 한 미생물에 대 한 적당 한 서식 지. 루트 exudates 이온, 무기 산, 산소, 물 같은 무기 화합물의 범위를 포함합니다. 그러나, 대부분의 루트 exudates 화합물 저 분자 무게 화합물 및 고분자 중량으로 분할 될 수 있다 유기 물질에 의해 형성 된다. 저 분자 무게 화합물 아미노산, 유기 산, 설탕, 페 놀 화합물, 지방산 및 2 차 대사 산물의 배열을 포함합니다. 점액과 단백질^2,3높은 분자 무게 화합물에 의하여 이루어져 있다. Rhizosphere 미생물 에너지 원으로 성장 및 개발에 대 한 이러한 화합물 중 일부를 사용할 수 있습니다. 루트 exudates 이후는 exudates에서 공장 생산 화합물 영향을 미칠 수 rhizosphere 관련 된 박테리아의 동작에 영향을 주는 특정 유전자의 표현에 의해 rhizobacterial 커뮤니티 형성에 중요 한 역할을.

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프로토콜

1. 출 감자 멸 균된 조건에서

1. 감자 표면 살 균 물으로 린스. 그리고 5 분 동안 3% 염소에 70% 에탄올에 감자를 목욕. 다시 모든 나머지 염소 제거 살 균 물으로 린스.
2. 출 아 하 고 감자 괴 경; 성장에 필요한 자료를 준비 플라스틱 냄비, engraftment 바구니, 질 석, 소독 하 고 20 분 동안 121 ° C에서 그들 압력가 마로 소독 하 여 물.
   참고: 사용 되는 모든 재료 멸 인지 확인 합니다. 그렇지 않으면, 다른 살 균 방법을 사용 합니다.
3. 표면 살 균 된 감자를 engraftment 바구니에 넣고 젖은 질 석 포함 하는 압력가 마로 소독 냄비에 배치.
4. 3 주 동안 24 ° C에서 기후 챔버에 냄비 유지. 빛 (120 µmol m^-2의-1)와 어둠의 8 h 16 h의 사이클에 그것을 설정 합니다. 미생물 오염을 방지 하려면 냄비를 커버 하는 대형 유리 섬유 상자를 사용 합니다.

2. 감자 루트 Exudates 수집

1. 새싹 새싹, 전송 압력가 이온된 물 150 mL 소독된 비 커에 전체 감자 바구니 가득 때 감자와 함께 물 표면과 뿌리 바로 위에 배치 tubers는 물에 잠긴 (....

결과

식물 관련 미생물 긍정적으로 식물의 성장과 건강에 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나, 식물과 그들의 미생물 symbionts 사이 복잡 한 상호 작용의 메커니즘 완전히 이해 되지 않는다. 루트 exudates rhizobacterial 활동 및 행동 조절에 중요 한 역할 그리고 그것은 일반적으로 가정 하는 뿌리의 미생물 식민지 루트 exudates 미생물의 매력으로 시작. 이 작품의 목표에 감자 루트 exudates B. mycoides rhizobacterial의 transcriptomic 응답을 조사 했다. 이 행, 감자 괴 경 표면 소독 하 고 압력가 vermiculite에 출 아 했다 했다. 다음 그림 1과 같이 루트 exudates 수집 했다. 최대 세균성 성장에 영향을 미치는 루트 exudates의 가능성을 배제 하기 위해 루트 exudates의 15% B. mycoides .......

토론

식물-미생물 상호작용 박테리아와 식물 사이 가늘게 조정된 평형에 의해 결정 될 가설 되어 있다. 이러한 상호 작용은 매우 복잡 하 고 공부 하기 어려운 자연 시스템에는 구성 다양 한 미생물 종, 잠재적으로 컨소시엄의 역할. 이 문서는 잘 제어 된 조건 하에서 루트 exudates에 세균성 응답을 공부 하는 간단한 프로토콜을 설명 합니다. Rhizobacteria, 루트 exudates에 노출 시의 transcriptome 프로필 rhizosphere 틈새에 세균 적응에 자세한 정보를 제공합니다. 이 루트 exudates 컬렉션 프로토콜은 복잡 한 절차와 특수 장비를 필요로 하지 않습니다. 그러나, 엄격 하 게 메 마른 조건 하에서 모든 절차를 실시 해야 합니다 그리고 불 임의 컨트롤 포함 되어야 합니다. 병렬로 여러 감자 괴 경은 성장 하 고 오염 된 것 들을 버리는 것이 좋습니다. 수정 다른 식물 종의 공부 되 고 있다 하는 경우이 프로토콜을 만들 수 있습니다. 그것은 적절 한 메서드를 사용 하 여 공차를 적용 하는 소독 제에.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
차아염소산나트륨	시그마	CAS : 7681-52-9	10-15%  활성 염소
Luria-Bertani (LB) 국물
인큐베이터	New Brunswick Scientific	Innova 4000
분광 광도계	Thermo Fisher Scientific	Genesys 20
액체 질소
유리 구슬	Sigma	G8893	0.5 µ
m 2.0 ml tube with screw cap			RNase free
1.5 ml 및 2.0 ml eppendorf tube			RNase free
비드 밀 균질화기	BioSpec	607	Mini_beadbeater
원심분리기	Eppendorf	5430
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	sigma	CAS: 1609-47-8
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	시그마	CAS: 151-21-3	DEPC 처리된 MQ 물로 제조된 10% 용액
TE 버퍼			10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8
페놀	시그마		RNA 등급
클로로포름-이소아밀 알코올			클로로포름:이소아밀 알코올을 24:1로 준비하여 실온에서 보관
고순도 RNA 분리 키트	Roche	11828665001
RNase 오염 제거 솔루션	Invitrogen	AM9780	RNase-Zap
자동 전기영동 기기	Agilent	2100	Bioanalyzer
Microvolume 분광 광도계	Thermo Fisher Scientific	Nanodrop ND-1000
RNA 품질 분석 키트	Agilent	RNA 6000 나노 키트
RNase 억제제	Thermo Fisher Scientific	RiboLock
방향성 RNA 라이브러리 준비 키트	NEB	Ultra	For Illumina