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방법 논문

감자 루트 Exudates 균 Mycoides 의 Transcriptional 응답을 식물 세균 상호 작용:

11.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57606

⸱

2018년 7월 2일

 ,  , 
1Department of Molecular Genetics, University of Groningen

이 논문에서

요약

여기에 제시 된 프로토콜의 목표 endosphere 절연 균 mycoides 의 감자 루트 exudates에 transcriptomic 반응을 것입니다. 이 메서드는 식물-미생물 상호작용에 관련 된 중요 한 세균 유전자의 식별을 용이 하 게 하 고 원칙적으로 다른 endophytes 및 식물, 사소한 조정에 적용.

초록

유익한 식물 관련 박테리아 성장을 촉진 하 고 식물에 질병을 방지에 중요 한 역할. Biofertilizers 또는 biocontrol 대리인으로 식물 성장을 승진 시키는 rhizobacteria (PGPR)의 응용 프로그램 기존의 비료의 사용에 효과적인 대안이 되 고 저렴 한 비용에 작물 생산성을 높일 수 있습니다. 식물-미생물 상호작용 호스트 공장 분 비 신호 및 그들의 관련 된 박테리아에 의해 hereon 반응에 의존. 그러나 어떻게 유익한 박테리아의 분자 메커니즘 응답 그들의 관련 된 식물 유래 신호는 완전히 이해 되지 않습니다. 루트 exudates 박테리아의 transcriptomic 반응 평가 세균성 유전자 발현 rhizospheric 조건 하에서 규제를 결정 하는 강력한 접근 이다. 이러한 정보는 식물-미생물 상호작용에 관련 된 근본적인 메커니즘을 이해 하는 데 필요한 있습니다. 이 종이 transcriptomic 반응을 B. mycoides EC18, 감자 루트 exudates 감자 endosphere에서 격리 하는 긴장의 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 최근 높은 처리량 시퀀싱 기술의 도움으로,이 프로토콜은 몇 주 및 생산 대규모 데이터 집합에서 수행할 수 있습니다. 먼저, 루트 exudates B. mycoides 문화에 추가 되는 무 균 조건 하에서 수집 합니다. 이러한 문화에서 RNA는 상용 키트와 결합 하 고 자동화 된 전기 악기에 의해 품질 관리 대상이 페 놀/클로 프롬 방법을 사용 하 여 격리 됩니다. 시퀀싱, 데이터 분석 수행 됩니다 웹 기반 T-렉스 파이프라인 차동 표현한 유전자의 그룹을 식별 하는 후에. 이 방법은 세균 유전자 식물-미생물 상호작용에 관련 된 새로운 발견을 촉진 하는 유용한 도구입니다.

서론

식물 exudate rhizosphere1, 즉, 뿌리 근처 토양의 좁은 영역에 뿌리를 통해 광합성 동안 고정 탄소의 최대 20% 수 있습니다. 더 높은 영양소 여부는 rhizosphere은 식물 성장을 승진 시키는 박테리아를 포함 하 여 다양 한 미생물에 대 한 적당 한 서식 지. 루트 exudates 이온, 무기 산, 산소, 물 같은 무기 화합물의 범위를 포함합니다. 그러나, 대부분의 루트 exudates 화합물 저 분자 무게 화합물 및 고분자 중량으로 분할 될 수 있다 유기 물질에 의해 형성 된다. 저 분자 무게 화합물 아미노산, 유기 산, 설탕, 페 놀 화합물, 지방산 및 2 차 대사 산물의 배열을 포함합니다. 점액과 단백질2,3높은 분자 무게 화합물에 의하여 이루어져 있다. Rhizosphere 미생물 에너지 원으로 성장 및 개발에 대 한 이러한 화합물 중 일부를 사용할 수 있습니다. 루트 exudates 이후는 exudates에서 공장 생산 화합물 영향을 미칠 수 rhizosphere 관련 된 박테리아의 동작에 영향을 주는 특정 유전자의 표현에 의해 rhizobacterial 커뮤니티 형성에 중요 한 역할을.

루트 exudates에 세균성 응답을 이해 해독 식물-미생물 상호작용 메커니즘에서 중요 한 단계입니다. 식물-미생물 상호작용에 세균성 응답 차동 유전자 발현의 제품으로, transcriptome 분석에 의해 공부 될 수 있다. 이 메서드를 사용 하 여 이전 연구 식물-미생물 상호작용에 관련 된 몇 가지 중요 한 유전자를 확인. 녹 농 균, 신진 대사, chemotaxis, 유형 II 분 비에 관여 하는 유전자 사탕 루트 exudates4에 응답을 표시 했다. 팬 외. 5 옥수수 루트 exudates 응답에 B. amyloliquefaciens FZB42의 프로 파일링 transcriptomic 공부. 그들의 결과, 강하게 루트 exudates에 의해 유도 된 유전자의 몇몇 그룹에에서 관련 영양소 사용률, chemotaxis, 운동 성, 및 항균 성 펩 티 드와 polyketides의 비 ribosomal 합성 대사 경로 보여 줍니다.

이러한 연구의 정확도 루트 exudates 컬렉션에 의존합니다. 여러 가지 방법을 서로 다른 목적을 위해 루트 exudates의 컬렉션을 설명 했으며, 비록 그들은 정교한 악기를 요구 하거나 잘 제어 조건6,,78수행 되지 않습니다. 또한, rhizosphere 억제 미생물 수 영향 루트 exudate 구성 식물 세포 막 침투성에 영향을 미치는 미생물9의 컨소시엄의 경우 특히 루트 조직 손상. 루트 exudates에 미생물 반응 조사, 다른 미생물10화합물의 피하기 위하여 잘 정의 된 조건을 사용 하 여 중요 하다. 또한, 높은-품질 RNA가 RNA-seq transcriptome 연구 기반을 위한 필요 합니다. 그러나, 비 모델 세균성 긴장 처리, 표준 프로토콜 또는 상업 키트 보통 있다 알 수 없는 요인 또는 특별 한 성장 특성으로 인해 낮은 효율성.

여기에 설명 된 프로토콜 사용 하 여 B. mycoidesFirmicute 문의 그람 양성, 포자 형성 박테리아를 확인 했습니다. 그것은 다양 한 식물 종의 rhizosphere에 유비 쿼터 스입니다. 여러 식물 성장 촉진 특성 사탕11, 감쇠 떨어져 병원 체의 Pythium 질소로 서 오이12, 억제에에서 체계적인 저항 (ISR)의 유도 포함 한이 종에 대 한 보고 해바라기 rhizosphere13에 고정입니다. 그러나, 호스트 플랜트와의 상호 작용의 분자 메커니즘은 잘 공부 하지.

여기에 제시 된 실험의 목적은 감자 루트 exudates에 endosphere 절연 B. mycoides 의 transcriptomic 반응을 것입니다. 즉, 프로토콜은 다음 단계로 구성 됩니다: 첫째, 메 마른 조건 하에서 감자 루트 exudates 수집. 그런 다음, 루트 exudates 치료 세균 세포에서 높은-품질 RNA를 추출 합니다. 마지막 단계는 T-렉스 웹 기반 파이프라인14를 사용 하 여 데이터 분석. 이 프로토콜 루트 exudates와 접촉 시 식 수준에 변화를 표시 하 고 따라서 식물-미생물 상호작용에 중요 한 역할을 재생 있습니다 B. mycoides 유전자를 식별 하기 위해 사용 되었다.

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프로토콜

1. 출 감자 멸 균된 조건에서

  1. 감자 표면 살 균 물으로 린스. 그리고 5 분 동안 3% 염소에 70% 에탄올에 감자를 목욕. 다시 모든 나머지 염소 제거 살 균 물으로 린스.
  2. 출 아 하 고 감자 괴 경; 성장에 필요한 자료를 준비 플라스틱 냄비, engraftment 바구니, 질 석, 소독 하 고 20 분 동안 121 ° C에서 그들 압력가 마로 소독 하 여 물.
    참고: 사용 되는 모든 재료 멸 인지 확인 합니다. 그렇지 않으면, 다른 살 균 방법을 사용 합니다.
  3. 표면 살 균 된 감자를 engraftment 바구니에 넣고 젖은 질 석 포함 하는 압력가 마로 소독 냄비에 배치.
  4. 3 주 동안 24 ° C에서 기후 챔버에 냄비 유지. 빛 (120 µmol m-2의-1)와 어둠의 8 h 16 h의 사이클에 그것을 설정 합니다. 미생물 오염을 방지 하려면 냄비를 커버 하는 대형 유리 섬유 상자를 사용 합니다.

2. 감자 루트 Exudates 수집

  1. 새싹 새싹, 전송 압력가 이온된 물 150 mL 소독된 비 커에 전체 감자 바구니 가득 때 감자와 함께 물 표면과 뿌리 바로 위에 배치 tubers는 물에 잠긴 ( 그림 1참조). 기후 챔버에는 종묘를 유지 하 고 동일한 설정을 사용 하기 전에 [24 ° C, 16 h 빛 (120 µmol m-2의-1), 8h 어둠의의].
  2. 두 번째 날부터 exudates를 포함 하는 물을 수집 하 고 살 균 이온을 제거 된 물으로 비 커를 리필. 샘플링을 수행 매일 묘 종 전송 후 7 일까지.
  3. 4 ° c.에서 별도로 각 샘플 저장 각 샘플에 대 한 확산에 Luria Bertani 100 µ L (파운드, 1 %tryptone, 0.5% 효 모 추출 물, 0.5 %NaCl) 천 배지 미생물 오염에 대 한 확인. 오염 된 샘플을 삭제 합니다.
  4. 1 종묘의 수집 된 샘플을 결합 하 고-40 ° C ~ 150 mL의 최종 볼륨에서 그들을 freeze-drying에 의해 그들을 집중.

3. 성장 하는 박테리아

  1. B. mycoides 스트레인 파운드 한 천 격판덮개에-80 ° C 글리세롤 재고에서 행진 하 고 하룻밤 30 ° C에서 접시를 품 어.
  2. 접시에서 단일 식민지와 파운드 액체 매체를 접종 하 고 하룻밤 30 ° c.에서 200 rpm에서 떨고 인큐베이터에서 문화를 성장

4. 치료 및 박테리아의 샘플링

  1. 루트 exudates 부정적인 제어를 치료 하는 박테리아의 성장 곡선 비교를 파운드 액체 매체의 50 mL를 포함 하는 플라스 크의 시리즈를 준비 합니다. 모든 플라스 크에 하룻밤 세균성 문화의 0.5 mL을 추가 하 고 중간, 0%, 5%, 10% 또는 15% (v/v) 루트 exudate 또는 살 균 이온된 수를 각각 추가.
  2. 루트 exudates 대신 이온 물 문화를 사용 하 여 컨트롤. 600에서 광학 밀도 측정 nm (OD600) 마다 1 시간 이후에. 시간 대 세600 값을 그려서 성장 곡선을 생성 합니다.
    참고: 우리는 루트 exudates의 10% B. mycoides 의 성장에는 영향을 미치지 않았다 보았다 ( 그림 2참조). 이 비율은 RNA-seq 실험을 위해 사용 되었다.
  3. 희석의 초기 세600 미리 따뜻하게 파운드 매체의 90 mL와 함께 하룻밤 B. mycoides 문화 ~ 300 mL 플라스 크에 0.05. 문화에 루트 exudates의 10 mL를 추가 하 고 1 시간에 30 ° C에서 품 어.
  4. 10 mL 살 균 이온된 수 치료를 사용 하 여 컨트롤. 4 ° c.에 2 분 동안 9000 x g에서 원심 분리 하 여 문화에서 세포를 수집 상쾌한, 삭제 즉시 액체 질소에는 펠 릿을 동결 다음 사용까지-80 ° C에서 그것을 저장 합니다.

5. RNA 격리

참고: 시작 하기 전에 격리, 작업 대, 선반, 및 펫 정리 하 여 준비 그들 RNase 오염 제거 솔루션 ( 재료의 표참조). 모든 시간에 장갑을 착용 하 고 모든 튜브, 팁 및 솔루션은 RNase 무료 다는 것을 확인 한다. 가능 하면 얼음에 샘플 항상 유지.

  1. 초순 수 (100 µ L DEPC의 100 mL 해결책 당)에 diethyl pyrocarbonate (DEPC)의 0.1% (v/v)을 추가 하 고 잘 섞어 하룻밤 실 온에서 보관. 압력솥 혼합물 하룻밤 치료 후는 DEPC를 비활성화. 이 DEPC 처리 초순 준비 테 버퍼를 사용 하 여 [10 mM Tris HCl (pH = 8), 1 mM EDTA] 10 %SDS (w/v) 솔루션.
  2. 얼음에 셀 펠 릿을 녹여 고 테 (DEPC) 버퍼의 400 µ L에서 각각 일시 중단. 2 mL 스크류 캡 튜브에 정지를 전송 합니다.
  3. 5 분 동안 서 서 혼합물을 허용 그리고 섞은 300 µ L의 클로 프롬 isoamyl 알콜 (24:1 v/v) 및 (산 페 놀, RNA 등급), 페 놀의 300 µ L Resuspended 셀에 추가 하려면 유기 상위 단계의 500 µ L를 가져가 라. 튜브에 10 %SDS와 유리 구슬 (0.5 µ m)의 0.5 g 50 µ L를 추가 합니다.
  4. 모자를 단단히 닫고 비드 밀 균질 화기에 튜브를 배치 ( 재료의 표참조). 얼음에 1 분 간격으로 3 × 45의 펄스 균질 화를 수행 합니다.
  5. 샘플 11000 x g (4 ° C)에서 10 분 원심 하 고 새 튜브를 위 단계를 전송.
  6. 5.5 단계에서 상위 단계로 클로 프롬 isoamyl 알콜 (24:1)의 500 µ L을 추가 하 고 11000 x g (4 ° C)에서 5 분을 위한 혼합물을 원심.
    참고: 다음 단계는 상업적인 유리 섬유 필터 기반 RNA 격리의 제조 업체의 지시에서 수정 된 키트 ( 재료의 표참조).
  7. 신선한 튜브를 상위 단계의 500 µ L을 전송 세포/바인딩 버퍼의 2 권 (1 mL)을 추가 하 고 아래로 pipetting으로 혼합.
  8. (에서 RNA 격리 kit) 필터 및 컬렉션 튜브를 결합 하 고 필터 튜브를 단계 5.7에서에서 혼합물을 플라스틱. 원심 튜브 15 g와 흐름을 통해 삭제 x 8000에서 s.
  9. 100 µ L DNase 버퍼, DNase의 10 µ L의 microcentrifuge 튜브 1.5 mL를 준비, 그리고 5 µ L의 RNase 억제제 ( 재료의 표참조). 필터 튜브의 필터에 준비 솔루션 믹스를 추가 하 고 15-25 ° c.에 20-30 분 동안 품 어
  10. 제조업체의 지시에 따라 세척 단계를 수행 합니다. 차입 버퍼의 50 µ L를 사용 하 여 RNA elute.
  11. -80 ° C에서 eluted RNA를 저장 하 고 그것의 주위에 플라스틱 파라핀 영화를 넣어. 동시에 품질 검사를 수행 하는 1.5 mL microcentrifuge 튜브 샘플의 약간 microliters 전송.

6. RNA 품질 확인 및 시퀀싱

  1. Microvolume 분 광 광도 계와 RNA를 확인 하십시오.
    참고: 260/280에서 흡 광도 비율 1.8 이상 이어야 합니다 그리고 비율 260/230에서 적어도 1.8, 2.0 이상 선호 이상 이어야 합니다.
  2. 실행 권장 RNA 분석을 사용 하 여 자동화 된 전기 이동 법 악기에서 정화 RNA 키트 ( 재료의 표참조); RNA 무결성 번호 (린) 진행 7 위 이상 이어야 합니다.
  3. 샘플 당 RNA의 3 µ g의 총 금액을 사용 하 여 RNA-Seq 라이브러리 준비 라이브러리 생성 키트 ( 재료의 표참조) 제조 업체의 권장 사항에 따라.
    참고: 라이브러리 준비는 높은 처리량 시퀀싱 플랫폼에서 시퀀싱 했다 고 쌍 간 읽기 생성 했다.

7. 데이터 분석 웹 기반 파이프라인 T-렉스를 사용 하 여

  1. 버전 0.0.13 FASTX-도구 키트를 사용 하 여 필터링 품질 (> 20 Phred 품질 평가 점수). Trimmomatic 도구 어댑터 시퀀스에서 원시 RNA-Seq 읽기 트림.
    참고: 모든 다운스트림 분석은 고품질을 가진 깨끗 한 데이터에 근거 했다.
  2. B. mycoides ATCC 6462 NCBI 게놈 데이터베이스 다운로드 (NCBI 승인 번호: CP009692.1) 및 Bowtie2/2.2.3를 사용 하 여 깨끗 한 읽기를 매핑하기 위한 참조 게놈으로 그것을 사용.
  3. 읽기 숫자 계산을 사용 하 여 HTSeq v0.6.1 각 유전자에 매핑되고 각 유전자의 백만 매핑된 읽기 (RPKM) 당 대 본의 kilobase 당 읽기가이 유전자에 매핑된 유전자와 읽기의 길이에 따라.
  4. T-렉스 파이프라인에 의해 데이터의 분석을 위해 입력, 뿐만 아니라 3 개의 설명 파일 RPKM 테이블 사용: (i) (ii) 어떤 요소가 차동 유전자 발현에 대 한 비교를 정의 하기 위해 대조 파일 요인에 실험을 설명 하기 위해 요인 파일 그리고 (iii) 관심사의 유전자의 그룹을 설명 하는 클래스 파일.
    참고: 설명 파일은 in.txt 형식입니다. 예는 T-렉스 (http://genome2d.molgenrug.nl/)의 웹 페이지에서 찾을 수 있습니다. T-렉스를 사용 하 여 데이터 분석에 대 한 자세한 지침 드 종 외. 여 이전 간행물에서 찾을 수 있습니다. 14.

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결과

식물 관련 미생물 긍정적으로 식물의 성장과 건강에 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나, 식물과 그들의 미생물 symbionts 사이 복잡 한 상호 작용의 메커니즘 완전히 이해 되지 않는다. 루트 exudates rhizobacterial 활동 및 행동 조절에 중요 한 역할 그리고 그것은 일반적으로 가정 하는 뿌리의 미생물 식민지 루트 exudates 미생물의 매력으로 시작. 이 작품의 목표에 감자 루트 exudates B. mycoides rhizobacterial의 transcriptomic 응답을 조사 했다. 이 행, 감자 괴 경 표면 소독 하 고 압력가 vermiculite에 출 아 했다 했다. 다음 그림 1과 같이 루트 exudates 수집 했다. 최대 세균성 성장에 영향을 미치는 루트 exudates의 가능성을 배제 하기 위해 루트 exudates의 15% B. mycoides ...

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토론

식물-미생물 상호작용 박테리아와 식물 사이 가늘게 조정된 평형에 의해 결정 될 가설 되어 있다. 이러한 상호 작용은 매우 복잡 하 고 공부 하기 어려운 자연 시스템에는 구성 다양 한 미생물 종, 잠재적으로 컨소시엄의 역할. 이 문서는 잘 제어 된 조건 하에서 루트 exudates에 세균성 응답을 공부 하는 간단한 프로토콜을 설명 합니다. Rhizobacteria, 루트 exudates에 노출 시의 transcriptome 프로필 rhizosphere 틈새에 세균 적응에 자세한 정보를 제공합니다. 이 루트 exudates 컬렉션 프로토콜은 복잡 한 절차와 특수 장비를 필요로 하지 않습니다. 그러나, 엄격 하 게 메 마른 조건 하에서 모든 절차를 실시 해야 합니다 그리고 불 임의 컨트롤 포함 되어야 합니다. 병렬로 여러 감자 괴 경은 성장 하 고 오염 된 것 들을 버리는 것이 좋습니다. 수정 다른 식물 종의 공부 되 고 있다 하는 경우이 프로토콜을 만들 수 있습니다. 그것은 적절 한 메서드를 사용 하 여 공차를 적용 하는 소독 제에...

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공개 사항

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

감사의 글

우리는 그의 도움이 의견 및 제안에 대 한 제이콥 재를 감사합니다. 우리는 또한 생물 정보학 분석에 그의 도움에 대 한 앤 데 종 감사합니다. Yanglei 이순신 Zhibo Li 중국 장학금 위원회 (CSC)에 의해 지원 됩니다. 우리 감사 NWO TTW Perspectief 전문 직원 Back2Roots (TKI-AF-15510) OPK에 그들의 재정 지원에 대 한.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
차아염소산나트륨시그마  CAS : 7681-52-9 10-15%  활성 염소
Luria-Bertani (LB) 국물
인큐베이터New Brunswick ScientificInnova 4000
분광 광도계Thermo Fisher ScientificGenesys 20
액체 질소
유리 구슬SigmaG88930.5 µ
m 2.0 ml tube with screw capRNase free
1.5 ml 및 2.0 ml eppendorf tubeRNase free
비드 밀 균질화기BioSpec607Mini_beadbeater
원심분리기Eppendorf5430
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)sigmaCAS: 1609-47-8
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)시그마CAS: 151-21-3 DEPC 처리된 MQ 물로 제조된 10% 용액
TE 버퍼10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8
페놀시그마RNA 등급
클로로포름-이소아밀 알코올 클로로포름:이소아밀 알코올을 24:1로 준비하여 실온에서 보관
고순도 RNA 분리 키트Roche11828665001
RNase 오염 제거 솔루션InvitrogenAM9780RNase-Zap
자동 전기영동 기기Agilent2100Bioanalyzer
Microvolume 분광 광도계Thermo Fisher ScientificNanodrop ND-1000
RNA 품질 분석 키트AgilentRNA 6000 나노 키트 
RNase 억제제Thermo Fisher ScientificRiboLock
방향성 RNA 라이브러리 준비 키트NEBUltraFor Illumina

참고문헌

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  15. Yi, Y., de Jong, A., Frenzel, E., Kuipers, O. P. Comparative transcriptomics of Bacillus mycoides strains in response to potato-root exudates reveals different genetic adaptation of endophytic and soil isolates. Frontiers in Microbiology. 8, 1487(2017).
  16. Nwokeoji, A. O., Kilby, P. M., Portwood, D. E., Dickman, M. J. RNASwift: a rapid, versatile RNA extraction method free from phenol and chloroform. Analytical Biochemistry. 512, 36-46 (2016).
  17. Ramirez-Gonzalez, R. H., Bonnal, R., Caccamo, M., MacLean, D. Bio-samtools: Ruby bindings for SAMtools, a library for accessing BAM files containing high-throughput sequence alignments. Source Code for Biology and Medicine. 7 (1), 6(2012).
  18. Quinlan, A. R. BEDTools: the Swiss-army tool for genome feature analysis. Current Protocols in Bioinformatics. , (2014).
  19. Boria, I., Boatti, L., Pesole, G., Mignone, F. NGS-trex: next generation sequencing transcriptome profile explorer. BMC Bioinformatics. 14 (7), S10(2013).

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