Organotypic 문화 메서드 배아 치킨 조직 개발 연구를

요약

여기, 선물이 배아 치킨 장기 성장 프로토콜을 경작 하는 organotypic 생체 외에서. 이 메서드를 사용 하 여 미 발달 닭 조직 개발 수 수 공부, 문화 환경에 통제의 고차를 유지 하면서.

초록

미 발달 닭 척 추가 개발에 대 한 신뢰할 수 있는 모델 생물으로 주로 사용 됩니다. 접근성 및 짧은 인큐베이션 기간 적합 실험에 대 한 합니다. 현재, 닭 태아에 있는이 발달 경로 연구는 저 해제 및 지역화 된 사이트에서 다양 한 방법 사용 하 여 낮은 농도에서 마약을 적용 하 여 실시 됩니다. 생체 외에서 조직 배양은 조직 호스트 유기 체에서 동시에 전체 배아, 배아의 민감성 등을 작업할 때 현재 물리적 한계의 대부분을 무시 하면서 분리의 연구를 가능 하 게 하는 기술 잠재적으로 치명적인 화학 제품의 높은 복용량. 여기, 우리는 배아 치킨 반 머리 생체 외에서현재 설립된 방법 넘어 개발 프로세스의 시험에 대 한 새로운 기회를 선물 한다 경작을 위한 프로토콜을 경작 하는 organotypic 제시.

서론

배아 닭고기 (갈 루스 갈 루스)는 생물학의 분야에서 일반적으로 사용 되는 우수한 모델 유기 체. 그 잠복기는 대략 21 일 고 많은 계란 수 있습니다 알을 품을 동시에, 신속 하 고 효율적인 실험을 만들기. 아마도 가장 중요 한 것은, 태아는 또한 쉽게 조작, 광범위 한 연구와 유전자와 이러한 프로세스를 구동 하는 단백질의 주요 개발 프로세스의 사용.

미 발달 닭 눈은 개발을 통해 다양 한 다른 조직 비슷한 많은 다른 시체는 시스템의 상호 작용 하는 복잡 한 기관 이다. 이 메서드는 개발의 고급 단계에서 특히이 조직 개발의 연구를 수 있습니다. 예를 들어 다층된 망막 신경 시스템의 개발을 공부 하 고 그에 게 특히 관심이 될 수 있습니다. 와 같은 각 막, vitreal, 렌즈, sclera, 몸과 눈 꺼 풀 연구자에 게 도움이 다른 눈 조직의 연구를 활성화 하는 방법에 대 한 대체. 닭 배아 눈에는 편평한 뼈, intramembranous 뼈 유도 및 척추¹에서 나오고의 연구에 대 한 모델로 사용 될 수 있는 scleral 이소골의 일련을 포함 되어 있습니다.

현재, 배아 발달을 공부 하는 데 사용 하는 방법 수가 있다. 억제 항 체 또는 다른 억제 분자^2,3, microinjections 수술 microbeads 억제 물⁴에 배어 이식 및 electroporation⁵ 는 downregulate 유전자를 사용할 수 있는 모든 방법을 또는 태아의 단백질입니다. 비슷한 메서드는 upregulate 단백질에 사용 됩니다. 이러한 방법을 그들의 제한 없이 되지 않습니다. 예를 들어 화학 물질을 사용 하 여 변경 하는 배아 개발을 태아에 치명적인 영향을 평가 해야 합니다, 그리고 이것의 생존을 보장 하기 위해 충분히 낮은 복용량에서 응용 프로그램의 지역화 된 사이트에 앞서 언급 한 방법의 사용을 제한 합니다 태아입니다.

생체 외에서 조직 배양 연구 개발 생물의 넓은 범위에서 사용 되었습니다 그리고 상기 제한 중 일부를 무시 하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어 femora⁶, 깃털 꽃 봉 오리^7,8및 사지⁹ 닭의 모든 되었습니다 공부 마우스¹⁰ 와 뿌리의 고환 및 식물¹¹의 줄기 조직 배양 방법를 사용 하 여. 이러한 방법을 과학자 제어 온도 변동 양분 가용성을 변경 하는 등 조직 개발의 높은 학위를 부여 합니다. 전체 태아에서 직물의 절연은 또한 높은 농도에서 세계적인 규모에 대 한 조작 연구를 활성화 하는 화학 제품의 치명적인 효과를 훨씬 덜 취약 합니다. 체 외에서 배양 하는 또 다른 주목할 만한 이점은 이다 조직의 셀룰러 환경 보존 조직 배열 다른 조직 유형⁹사이의 상호 작용을 공부 하는 게 가능 하, 상대적으로 변경 되지 않습니다. 따라서, 체 외에서 배양 열립니다 문을 추가 실험 접근 비켜 또는 vivo에서 모델에서 사용할 수 없습니다.

현재, 화학 물질을 사용 하 여 미 발달 닭 눈의 개발을 공부 하 고 특히 도전 이다. Extraembryonic 막 수 커버 태아, 어렵게 적용 microbeads 또는 화학 제품; 태아 그것 수록, 더는 이미 어려운 방법 복잡 계란 내에서 매우 적극적 이기도 합니다. 이 프로토콜에는 눈 및 그 주변 조직, 또한 눈 내 개발 프로세스를 검사 하는 새로운 기회를 제공 하면서이 방 벽을 제거 쉽게 액세스할 수 있습니다. 이 프로토콜은 배아 눈 내 scleral 이소골의 유도 연구 설립 되었다.

프로토콜

참고: 배아 단계에 대 한 햄버거와 해밀턴¹² (HH) 준비 테이블을 사용 합니다.

1. 배아의 부 화

1. 37 ° C ± 1 ° C, 40% 습도에서 살 균, 온도 제어 인큐베이터에서 수정 된 닭 알을 품 어.
2. 계란 1 차례 하루 x HH34을 알을 품을 수 있도록 (8 일 후 수정).

2. 준비 및 재료의 살 균

1. 12 배아, 압력솥 증류수, 0.85% 병아리 염 분, 12 유리 펫, 종이 조직과 24 2.5 c m x 2.5 c m 사각 반 다공성 필터 종이, 강선의 24 2.5 c m x 2.5 c m 사각형의 1 상자 1 L 2 L 메쉬 곡선 아래쪽 가장자리에 대 한. 자료, 소독 압력솥 적어도 15 분 동안 121 ° C에서 그들.
   참고: 재료의 압력가 마로 소독 사전에 할 수 있습니다.
2. 측면, 선반, 및 문을 닦아 하 여 70% 에탄올과 인큐베이터를 소독. 장소 2 플라스틱 용기 포함 압력가 하는 습도 유지 하기 위해 인큐베이터 안에 증류수. 37 ° C ± 1 ° C, 40% 습도에 문화 인큐베이터 prewarm 인큐베이터는 완전히 어두운; 확인 문은 투명, 은박지와 커버.
3. 문화 인큐베이터에 그들을 배치 하 여 영양소 매체의 및 페니실린의 1 mL 100 mL를 prewarm.
4. 종이 수건으로 작업 영역을 커버 하 고 70% 에탄올을 분사 하 여 벤치를 소독. 비슷한 방식으로 소독 집게, 해 부가 위, 면도날, 및 70% 에탄올과 플라스틱 숟가락의 2 쌍.
5. 장소 12 살 균 100 mm 페 트리 접시 그리고 사용에 대 한 벤치에 접시 24 살 균 35 m m. 요리 사용까지 멸 균 가방에 남아 확인 합니다.

3. 배아 준비

참고:이 시점에서 앞으로, 문화를 훼손 하지 않도록 보호 먼지 얼굴 마스크를 착용 하십시오. 세균 이나 곰 팡이 감염 문화를 망칠 것입니다 그리고 그것은 인큐베이터에서 모든 문화에 빠르게 확산의 위험.

1. 균열 계란 열고 100 mm 페 트리 접시 0.85% 병아리 염 분을 포함 하는 배아를 전송 합니다. 해 부 특징에 따라 배아 햄버거와 해밀턴 준비 지침¹² 에서 설명 하 고 태아를 확인 단계는 HH34에서 이다.
2. 목 고 소독된 면도날을 사용 하 여 중간에 태아의 머리를 이등분. 소독 집게를 사용 하 여 두뇌를 제거 합니다. 부리는 그대로 둡니다.

4. 문화 설치

1. 한 100 mm 페 트리 접시 안에 35 mm 페 트리 접시의 장소 2.
2. 각 35 mm 페 트리 접시 안에 강철 와이어 메쉬를 배치 합니다.
3. 집게를 사용 하 여 전송 bisected 머리의 1 2.5 c m x 2.5 c m 반 다공성 필터 종이 위로 향하도록 눈으로. 조직과 보안은 약간 그것을 기울이기로 벗어 버리는 하지 않습니다 확인 합니다.
4. 집게를 사용 하 여 신중 하 게 장소 눈 조직 및 필터 종이 위에 올려진된 무대 위에 눈 조직으로 만드는 35mm 페 트리 요리의 1 강철 와이어 메쉬.
5. 4.3 및 4.4 다른 절반 머리와 단계를 반복 합니다.
6. 필터 종이의 수준에 도달할 때까지 각 35 mm 페 트리 접시에 직접 영양소 매체를 추가 신중 하 게 메 마른 유리 피 펫을 사용 하 여. 영양소 중에 반 머리를 잠수함 하지 마십시오.
7. 각 페 트리 접시에 영양 보통 10000 U/mL 페니실린-스의 50 µ L를 추가 합니다.
8. 작은 광장으로 조직 종이 접어과 100 mm 페 트리 접시 안에 배치. 압력가 증류수와 함께 축 축 하 게.
9. 최대 4 일 동안 37 ° C ± 1 ° C, 40% 습도에서 살 균, 어두운 인큐베이터에 문화 접시를 놓습니다.
10. 각 태아에 대 한 3-4 단계를 반복 합니다.
    참고: 배아의 수 특정 실험;에 따라 달라 집니다 필요 여기, 우리는 12 배아에 대 한 프로토콜을 설명합니다.

5. 문화 유지 보수

1. 하루에 한 번, 신선한, 압력가 증류수와 인큐베이터에서 플라스틱 용기를 가기.
2. 세균 이나 곰 팡이 감염에 대 한 모든 문화는 매일 확인 합니다. 문화는 붕괴 또는 매체 색상을 변경 되었습니다 감염 됩니다. 감염 되는 모든 문화를 삭제 합니다.

6입니다. 고정

1. 인큐베이터에서 모든 요리를 제거 하는 경작, 다음.
2. 부드럽게 집게의 쌍을 사용 하 여, 조직을 찢 어 하지 않도록 주의 복용 필터 종이에서 눈을 제거 합니다.
3. 4 ° C에서 하룻밤 염 인산 염 버퍼 x 1 또는 10% 중립 버퍼링 말린 하룻밤 실 온에서 4 %paraformaldehyde 눈 조직을 수정 했다.
4. 인산 염 버퍼 염 분 x 1에 4 ° C에서 티슈를 저장 합니다.

결과

이 메서드를 사용 하 여 미 발달 닭 눈 수 수 경작 하루 8 개발 (HH34)의 생체 외에서 에서 4 일 동안. 비켜에 개발의 4 일 HH38에 해당 합니다.

이 자란 방법 깃털 싹 눈 주위와 눈 꺼 풀 (그림 1B)에 개발을 지원 합니다. 이러한 깃털 싹 존재 비켜 HH34에서 경작 (그림 1A), 이전 비켜에서¹³ (그림 1C)은 깃털 새싹 개발 자란 기간 시작 됩니다 나타내는 되지 않습니다. 눈 꺼 풀과 nictitating 막 자란 (그림 1B

토론

이 프로토콜 닭 눈 배아 주 8에서에서 (HH34)의 성장을 달성 하기 위해 설립 된 조직 배양 기술을 사용 생체 외에서 4 일 동안. 이 그리드 경작 방법 Trowell¹⁵에 의해 원래 기술 되었다. 우리는 핀 토와 홀의 1991 연구¹⁶ 배아 닭 눈¹⁵의 분리 된 조직 층 사이 유도 신호를 공부 하는 그리드와 반 다공성 멤브레인을 활용 하 여 프로토콜을 최적화. 이 메서드를 사용 하 여, 바퀴벌레 14 일 오래 된 닭의 대 퇴 골⁶교양. 이 방법은 또한 마우스 조직^6,17경작에 효과가 입증 되었습니다. 필터 종이의 사용은 영양분을 받아들이고 매체에서 효과적으로 포화 또는 submersing 조직 없이 조직 도움으로 프로토콜의 성공에 중요...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
35mm 세포 배양 페트리 접시	Corning	353001	쉽게 잡을 수 있는 조직 배양 접시, 폴리스티렌, 비발열성
100mm 세포 배양 페트리 접시	Corning	353003	조직 배양 접시, 폴리스티렌, 발열성
종이 티슈	Kimtech	34155	Kimtech Science 브랜드 작업 와이퍼, 카톤 와이어 메쉬 당 280
	해당	없음	스테인레스 스틸 와이어 메쉬 (그리드 크기 0.7 mm)
일회용 유리 피펫	VWR	14673-010	붕규산 유리 일회용 5 3/4 "
영양 매체	Gibco	12591-038	Fitton-Jackson Modification, [+] L-글루타민 페놀 레드 (BGJB)
페니실린-스트렙토 마이신	시그마-알드리치	P4458	10000 units / mL 페니실린 스트렙토 마이신 용액 안정화
필터 paper	Whatman	1454-090	반다공성 여과지 90mm
수정 닭 달걀	Dalhousie University Agricultural College	해당 사항 없음	농장에서 얻을 수 있습니다
염화나트륨 (NaCl)	EMD	SX0420-3	염화나트륨 결정, 시약 등급
1 L 유리병	VWR	89000-240	1 L 파이렉스 오토클레이브 유리병
에탄올	Fisher Scientific	BP82011	70% 분자 생물학 등급
타파웨어 용기	해당	사항 없음	및 EtOH
일회용 면도날	VWR	55411-050	단일 모서리 산업용 면도날(외과용 탄소강)
플라스틱 스푼	해당 없음		및 EtOH
방진 마스크	3M	해당 없음	3M 8500 컴포트 마스크
파라포름알데히드	Sigma-Aldrich	P6148	파라포름알데히드, 시약 등급, 결정질
중성 완충 포르말린	Fisher Scientific	72210	10% 중성 완충 포르말린
인산염 완충 식염수(PBS)	해당 없음		10X 인산염 완충 식염수 pH 7.4 (137mM NaCl, 2.5mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4)
15 ml 팔콘 튜브	VWR	21008-216	사전 멸균 원심분리기 튜브
펜치	FST	n/a	파인 펜치
식염수	해당 없음	없음	0.85% 염화나트륨
은박지	N/A		해당 없음 매장에서 구매한
종이 타월	해당 사항 없음	해당