방법 논문

패치 클램프 후 단일 셀 다중 반전 녹음 방송 연쇄 반응

DOI:

10.3791/57627

⸱

2018년 6월 20일

 ,  ,  , 
1UPMC Univ Paris 06, INSERM, CNRS, Neuroscience Paris Seine - Institut de Biologie Paris Seine (NPS - IBPS), Sorbonne Université

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜에는 중요 한 단계 및 패치 클램프 후 단일 셀 다중 반전 녹음 방송 연쇄 반응 하는 데 필요한 조치 설명 합니다. 이 기술은 패치 클램프 기록 특징 하나의 세포에서 유전자의 미리 결정 된 집합 식 프로 파일을 분석 하는 간단 하 고 효과적인 방법입니다.

초록

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대뇌 피 질은 수많은 종류의 세포 다양 한 형태, 생리, 및 분자 기능을 전시로 구성. 이 다양성에는 쉽게 식별 하 고 이러한 세포 유형, 그들의 특정 기능을 공부 하는 전제의 지장을 초래할 수 있습니다. 이 문서에서는 다중 단일 셀 반전 녹음 방송 중 합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR) 프로토콜을, 패치 클램프 조각, 기록 후 허용 하는 단일 셀에 유전자의 수만의 표현을 동시에 감지 하는 설명 합니다. 이 간단한 방법 형태학 상 특성을 구현할 수 있다 고 널리 혈관 주변 등 다양 한 세포 유형 및 그들의 특정 세포 환경 phenotypic 특성 결정에 적용 됩니다. 이 프로토콜의 원리 기록 하 패치 클램프 기술 수확 및 역방향 셀의 세포질 내용 녹음 이며 질적으로 감지 하 여 유전자의 미리 정의 된 집합의 표현 다중 PCR. PCR 뇌관 및 RT-PCR과 호환 세포내 패치 클램프 솔루션의 설계를 필요합니다. 선택적이 고 신뢰할 수 있는 증명서를 위해 탐지,이 기술은 또한 증폭 단계에 수확 하는 세포질에서 적절 한 컨트롤을 필요 합니다. 여기서 설명 하는 조치를 엄격 하 게 따라야 합니다, 하지만 거의 모든 electrophysiological 실험실 다중 단일 셀 RT-PCR 기법을 사용할 수 있습니다.

서론

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대뇌 피 질에는 다양 한 생리 적 프로세스에 관련 된 수많은 셀 형식을 구성 되어 있습니다. 그들의 식별 및 특성화, 그들의 특정 기능에 대 한 이해를 전제 조건 매우 도전 수 대뇌 피 질의 세포 유형1 특징 큰 형태, 생리, 및 분자 다양성 부여 2,,34.

단일 셀 다중 RT-PCR 패치 클램프와 RT-PCR 기술의 결합을 기반으로 합니다. 그것은 동시에 electrophysiologically 확인 된 셀5에서 30 개 이상의 미리 정의 된 유전자의 표정을 프로브 수 있습니다. 기록 피 펫 추가에 신경 추적 프로그램의 포함 허용 조직화 학적인 계시6,7,,89, 후 기록 된 세포의 형태학 특성 10. 그것은 그들의 phenotypic 특성5,,910,11,12의 복수 변수 분석에 따라 신경 유형의 분류에 대 한 매우 유용한 기술입니다 ,,1314. 단일 셀 멀티플렉스 RT-PCR은 또한 이다15,,1617, 같은 비 신경 세포의 특성에 적합 하 고 거의 모든 뇌 구조18에 적용 될 수 있습니다. 19,20,21,22,23 및 셀 유형, 가정 그들은 전체 셀 구성에 기록 될 수 있습니다.

이 기술은 세포 소스의 식별 및 전송 시스템7,8,15,,1620,21, 목표에 대 한 매우 편리 하다 24,25,26,,2728, 특정 항 체 부족 하는 경우에 특히. 그것은 시각적으로 식별 된 셀29, 패치 클램프 기록에 의존 하며 따라서 또한 특정 세포 환경8,,1516셀을 대상으로 수 있습니다. 또한 뇌 조직의 cytoarchitecture 두뇌 분할 영역에 유지 됩니다, 이후이 방법은 또한 수 있습니다 신경 및 비 신경 요소7,8 특징이 세포의 해부학 적 관계의 연구를 , 18.

이 기술은 수확된 세포질의 크기와 RT의 효율에 의해 제한 된 있기 때문에, 낮은 복사 번호에서 표현 하는 mRNA의 검출은 어려울 수 있습니다. RNaseq 기술에 따라 다른 접근 분석 하는 단 세포3,4,,3031, 전체 transcriptome 있게 비록 그들은 반드시 높은 처리량 비싼 시퀀서 필요 모든 실험실을 사용할 수 있습니다. 단일 셀 다중 실시간 PCR 기술을 사용 하므로 끝점 PCR, 그것만 널리 thermocyclers를 요구 한다. 그것은 실험실을 갖춘 electrophysiological 설정에서 쉽게 개발 될 수 있다 하 고 비싼 장비가 필요 하지 않습니다. 그것은 제공할 수 있습니다, 어느 날, 내 유전자의 미리 정의 된 집합의 식에 대 한 질적 분석. 따라서,이 방법은 신속한 방식으로 단일 세포의 분자 특성에 대 한 쉬운 액세스를 제공합니다.

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프로토콜

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동물을 사용 하 여 모든 실험 절차 프랑스 규정 (코드 농촌 R214/87 R214/130)에 따라에서 수행 했다 및 유럽 경제 공동체 (86/609/EEC) 및 프랑스 국가 헌장의 윤리 지침을 준수 동물 실험의 윤리. 모든 프로토콜 찰스 다윈 윤리 위원회에 의해 승인 하 고 교육 및 연구 (승인 2015 061011367540)의 프랑스 정부에 제출 했다. IBPS 동물 시설 (A75-05-24) 프랑스 당국에 의해 공인 됩니다.

1. 예비 고려 사항

참고: 오염을 방지 하려면 패치 클램프 후 사업 단일 셀 RT-PCR 하기 전에 다음 권장 사항을 따릅니다.

  1. 그들은 오염의 실험실의 유전자를 포함 하는 플라스 미드를 사용 하지 마십시오.
  2. 젤 전기 이동 법 방 PCRs 준비에서 실험실 벤치를 보유 합니다.
  3. 펫 및에 어로 졸 방지 필터 팁 1 ng / µ L 보다 낮은 농도에서 DNA와 RNA를 조작의 집합을 칩니다. PCR 제품 분석을이 사용 하지 마십시오.
  4. 항상 RNase DNase 무료 제품을 사용 하 고 장갑을 착용.
  5. 내부 패치 클램프 솔루션을 준비 하기 위한 전용된 화학 물질을 사용 합니다. 주걱을 사용 하지 않습니다 하지만 오히려 종이 분말 무게를 무게.
  6. 전용된 pH 전극 및 pH 표준 솔루션을 사용 하 여로 그들은 (예를 들어, RNase) 오염의 원천이 될 수 있습니다.
  7. 스토어 붕 규 산 유리 모 세관; 20 µ L, 괜 찮 아 요 길고 유연한 팁; 20 µ L micropipette; 집에서 만든 착 유기 (패치 클램프 피 펫 홀더 10 mL 주사기에 부착 된); 500 µ L PCR 튜브; 10 µ L에 어로 졸 방지 필터 팁; 그리고 전용된 상자 (그림 1)에서 영구 마커를 얇은.

2. 뇌관 디자인

참고: 다중 RT-PCR 증폭의 두 단계에 의존합니다. 첫 번째 PCR 동안 관심의 모든 유전자는 모든 PCR 뇌관을 함께 혼합 하 여 공동 증폭 된다. 안정적으로 단일 세포에서 성적 검색, 효율적이 고 선택적 PCR 뇌관 디자인 필수적 이다. PCR의 두 번째 라운드에 대 한 중첩 된 (내부) 프라이 머를 사용 하 여 특이성 및 증폭의 효율을 향상 시킵니다.

  1. NCBI 참고 순서 데이터베이스32 의 유전자로 그들의 관련된 가족 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/)의 그의 큐레이터 mRNA 시퀀스를 검색 합니다.
    1. 쿼리는 gene(s)와 관심의 종의 이름을 입력 하 고 검색된 관련 시퀀스를 클릭 하십시오.
    2. 코딩 시퀀스는 gene(s)의 분석을 제한 하려면 (오른쪽 상단), 보내기 를 클릭 하 고 형식으로 코딩 시퀀스 및 FASTA 뉴클레오티드 를 선택 합니다. 다음 파일 만들기 를 클릭 하 고 ".nt" 파일 확장명을 사용 하 여 FASTA 시퀀스를 저장.
  2. 잉 꼬 소프트웨어33 (여러 맞춤 건설 및 분석 워크 벤치) 또는 다른 여러 맞춤 소프트웨어를 사용 하 여 상 동 영역을 결정 하.
    1. 파일을 클릭 | 새 프로젝트... 고 DNA 시퀀스 유형을 선택 합니다. 유전자 시퀀스를 가져오려면 시퀀스를 선택 하십시오 | 가져올 시퀀스... 고 ".nt" 파일을 로드 합니다. 모든 관련된 시퀀스에 대 한 절차를 반복 합니다.
    2. 클릭 하 고 전체 시퀀스를 선택 하 구조 창에서 모든 시퀀스를 드래그.
    3. 상 동 지역 맞춤을 선택 하 여 검색 | 블록에 대 한 검색... (CTRL + S)입니다. 검색 방법에 세그먼트 쌍 중복 을 선택 합니다. Pairwise 점수 구분을 상대적으로 높은 값 (예:1000) 조정 및 정렬 하 고 시작클릭 시퀀스의 총 수를 블록 당 분 seqs. .
    4. 나타나는 검색 결과 창에서 가장 높은 MP 점수 결과 선택 하 고 링크를 클릭 하십시오. 결과가 없으면 감소 Pairwise 점수 구분 및 블록 당 분 seqs..
    5. 동종 지역의 시각화를 촉진 하기 위하여 맞춤 선택 | 음영 | 점수를 의미.
    6. 시퀀스의 연결 되지 않은 부품을 선택 하 고 잠재적으로 낮은 MP 점수와 상 동의 다른 영역을 결정 하는 단계 2.2.3–2.2.4 반복.
    7. 가장 구체적인 뇌관을 얻기 위해 최소한 순서 상 동 영역을 선택 합니다.
  3. 모든 결합 이체의 시퀀스를 가져올 고 2.2.1–2.2.6 단계를 반복 합니다. 전반적인 탐지에 대 한 그들의 일반적인 영역을 선택 합니다. 전용된 스플라이스 변종 분석20,,3435,36대체 카세트를 고려 하십시오.
  4. (Https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 유전자의 intron exon 구조를 결정 하 폭발37 게놈 (기본적인 현지 줄 맞춤 검색 도구)를 사용 하 여 동물 모델 게놈에 mRNA 순서를 정렬 합니다.
    1. 마우스 를 클릭 하 여 폭발 마우스 게놈을 선택 하 고 쿼리 시퀀스 입력 섹션에서 검색된 FASTA 시퀀스를 업로드. 프로그램 선택에서 선택 에 대 한 최적화 매우 비슷한 시퀀스 (megablast), 클릭 폭발 버튼.
    2. 설명 섹션에서 가장 높은 Id와 맞춤 선택 (최대 100%까지). 정렬 섹션의 기능 에서 그것은 관심사의 유전자에 해당 한다는 것을 확인 하십시오.
    3. 쿼리 시작 위치 같은 섹션 코딩 시퀀스의 exons 승계를 의해 정렬을 정렬 합니다. 쿼리 순서 (그림 2A)에 introns의 위치에 해당 약 모든 안타의 시작 및 끝 위치 note
  5. 크기 기준 (그림 2)에 따라 게놈 DNA (gDNA) 증폭에서 cDNA를 쉽게 차별화 하는 의미와 antisense 뇌관에 대 한 두 개의 다른 exons를 선택 합니다.
    참고: gDNA 증폭 발생할 수 있습니다 낮은 주파수에서 핵 세포질과 수확 이다. 따라서, intron 뇌관 쌍 (그림 2A) overspanning 디자인에 필수적 이다. Intron 없는 유전자의 경우 핵의 컬렉션은 문제가 잠재적으로 결과 혼동으로 이어질 수 있습니다. 이 문제를 해결 하려면 증폭 intronic 시퀀스 gDNA25의 존재에 대 한 조사를 목적으로 하는 뇌관의 집합을 포함 합니다. 게놈 제어 긍정적인 경우에, 모든 intron 없는 유전자에 대 한 결과 무시 해야 합니다.
  6. 효율적인 증폭을 달성, 뇌관 200 그리고 400의 기본적인 쌍 (그림 2) 사이의 이상적으로 구성 된 길이 amplicons 생성을 선택 합니다.
  7. 멀티플렉스 PCR 단계에서 동시에 다양 한 cDNAs를 증폭, 55와 60 ° C 사이 18의 그리고 24 뉴클레오티드와 녹는 온도 (Tm) 사이의 길이가 뇌관 디자인
  8. 증폭 수확량 감소, 2 차 구조 형성을 최소화와 최소한의 머리 핀과 이중 길이 (그림 2B)와 반대로 감각 뇌관을 선택 합니다.
  9. 동일한 기준 (2.5-2.8 단계)를 사용 하 여 내부 뇌관 디자인.
  10. 뉴클레오티드 폭발을 사용 하 여 관심사의 유기 체의 참조 RNA 시퀀스 데이터베이스에 뇌관을 정렬 하 여 PCR 뇌관의 특이성을 확인 합니다.
    1. 폭발 (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)에서 뉴클레오티드 폭발에클릭 합니다. 입력 쿼리 시퀀스에 뇌관의 순서를 붙여 넣습니다.
    2. 선택 검색 설정 섹션에서 클릭 다른 사람 (nr 등), 데이터베이스 옵션에서 참조 RNA 시퀀스 (refseq_rna)를 선택 하 고 유기 체 (예, 생쥐 (taxid:10090) 지정 )를 원하는 종에 분석을 제한.
    3. 프로그램 선택 에 대 한 최적화 다소 비슷한 시퀀스 (blastn)을선택 합니다. 알고리즘 매개 변수 섹션에서 7 안타를 얻을 수 있는 기회를 증가 하기 위하여 아래로 단어 크기 를 줄입니다.
  11. 선택적 뇌관 디자인, 그 시퀀스는 가능 하면 원치 않는 cDNAs 적어도 3 불일치 들만 계속 합니다.
  12. 모든 외부 뇌관 수 1 µ M의 최종 농도에 함께 혼합 될 수 있도록 상대적으로 높은 농도 (예를 들어, 200 µ M)에서 desalted 뇌관을 주문.

3입니다. RT 시 약의 준비

  1. 5 실시간 믹스 x: RT 믹스 솔루션 (5 배) 25 µ M에서 임의의 뇌관 및 dNTPs 2.5 m m에서 포함 된 일의 400 µ L RNase 무료 물에 준비. 이 작업 혼합 500 µ L 튜브에서 20 µ L aliquots로 저장 합니다.
  2. 20 x Dithiothreitol (DTT): 물 0.2 M RNase 무료 DTT의 1 mL를 준비 하 고 50 µ L aliquots로 저장.
  3. RNase 억제제 (40 U / µ L)의 2500 U 및 역전사 (RTase, 200 U / µ L)의 10000 U 5 µ L aliquots로 저장 합니다.
  4. RT 시 약의 최적의 품질을 보장 하려면 저장-80 ° c.에 aliquots 최대 10 셀과 1 일에만 사용 합니다.

4. PCR 유효성 검사

  1. 관심의 구조에서 상대적으로 많은 양의 총 RNA (일반적으로 1 µ g) 추출38 에 반전 녹음 방송 함으로써 cDNAs를 준비 합니다.
    1. 이러한 예비 단계에 대 한 셀 RT-PCR을 단일 하지만 RNase 무료 펫을 사용 하 여 전용된 펫을 사용 하지 마십시오. 1 µ g / µ L까지 총 RNA를 희석.
    2. 500 µ L PCR 튜브에 희석된 총 RNA의 1 µ L과 RNase 무료 물 8 µ L를 추가 합니다. 1 분 동안 95 ° C에서 변성 하 고 얼음에 튜브 아래로 냉각.
    3. 제조업체에서 제공 하는 실시간 5 x 버퍼의 4 µ L, RT 믹스 솔루션의 4 µ L, RTase의 1 µ L, 1 µ L의 RNase 억제제, 200mm DTT의 1 µ L 추가 (섹션 3 참조).
    4. 튜브 영화, 스핀, 그리고 37 ° c.에서 밤새 품 어
    5. 몇 년까지-80 ° C에서 cDNAs를 저장 합니다. 총 RNAs 등가물의 µ 1 ng/L 희석 cDNAs의 약 수를 준비 합니다.
  2. 혼합 및 단일 셀 RT-PCR 전용 펫으로 1 µ M에서 각 뇌관 쌍을 희석. 각 뇌관 믹스의 20 µ L를 사용 하 여 100 µ L PCRs에.
  3. 얼음, 준비 뇌관 쌍 각 포함 하는 프리 믹스: 물 (q.s., 80 µ L), 버퍼, 100 x dNTPs (50 µ M 각), 500-1, 000의 cDNA의 pg 1 ng / µ L에서 희석 1 µ L 및 Taq 중 합 효소의 0.5 µ L (2.5 U, 5 U / µ L) X 10의 10 µ L.
  4. PCR 기계는 최적의 온도 제어에 대 한의 우물을 밀접 하 게 맞는 PCR 튜브를 사용 합니다. 벽 또는 PCR 튜브의 뚜껑을 건드리지 않고 미네랄 오일은 섞은 2 방울 (~ 100 µ L)을 추가 합니다.
  5. 뇌관 이합체의 형성을 최소화 하기 위해 미리 95 ° c.에가 열 thermocycler에 PCR 튜브를 배치 하 여 뜨거운 시작 수행 30 후 s, 신속 하 게 기름 위에 뇌관 믹스의 20 µ L를 추방.
  6. 95 ° C에서 3 분, 후 40 주기 실행 (95 ° C, 30 s; 60 ° C, 30 s; 72 ° C, 35 s) 5 분 동안 72 ° C에서 최종 신장 단계 뒤.
  7. Agarose 젤 전기 이동 법 (2%, 무게/볼륨)3910 µ L 각 PCR 제품의 분석. 일부 PCR 제품에는 예상 되는 크기가 없다면 다시 다른 뇌관 (섹션 2 참조) 디자인.
    주의: Ethidium 평범한 사람은 DNA 변이 일으킬 수 있는 intercalating 화학. 그것을 사용 하기 전에 현지 안전 사무실을 참조 하십시오. 그것을 조작 하는 경우 항상 장갑을 착용 하십시오. 파우더 대신 ethidium 평범한 사람 (10mg/mL) 솔루션의 상용 솔루션을 사용 하 여 흡입의 위험을 최소화 하기 위해. 마찬가지로, UV 빛 해로울 수 있다, 그래서 UV 보호 안전 안경이 나 마스크를 확인. 더럽혀진된 젤, 팁, 장갑, 그리고 버퍼 브로민 폐기물 전용 용기에 철회.
  8. 일단 모든 뇌관 쌍 개별적으로 검증 된, 다중 프로토콜 (그림 3)를 테스트 합니다.
    1. 혼합 하 고 1 µ M.가 게에서 몇 주까지-20 ° C에서 멀티플렉스 뇌관 혼합 함께 모든 외부 뇌관을 희석.
    2. 얼음, 포함 하는 프리 믹스 준비: 물 (q.s., 80 µ L), 버퍼, 100 x dNTPs (각 50 µ M)의 1 µ L, 500-1000 1 ng / µ L, 및 0.5 µ L (2.5 U, 5 U / µ L) Taq 중 합 효소의 희석 cDNAs의 X 10의 10 µ L.
    3. PCR 튜브 영화, 스핀, 고 미네랄 오일 두 방울 (~ 100 µ L)를 추가 합니다.
    4. 멀티플렉스 뇌관 혼합의 20 µ L와 4.5 단계에서 설명한 대로 뜨거운 시작을 수행 합니다. 95 ° C에서 3 분, 후 20 PCR 주기 단계 4.6의 동일을 실행 합니다.
    5. PCR 튜브를 분석 하는 유전자의 번호와 동일한 번호를 준비 합니다. 준비 단계 4.8.2, 하지만 첫 번째 PCR 제품 유전자 당 1 µ L를 사용 하 여 서식 파일로 같이 섞은. 유전자를 분석 하 고 여분의 볼륨의 10%를 사용 하 여 pipetting 오류에 대 한 보상의 수에 따라 모든 볼륨을 조정 합니다.
    6. 부드럽게 흔들어 하, 튜브를 회전, 각 PCR 튜브에 프리 믹스의 80 µ L를 파견 하 고 벽 또는 튜브의 뚜껑을 건드리지 않고 튜브 당 미네랄 오일 두 방울 (~ 100 µ L)를 추가 합니다.
    7. 뜨거운 수행 (단계 4.5 참조) 시작 내부 뇌관 믹스의 추방 20 µ L에 의해 단계 4.2에서에서 준비. 35 PCR 주기 단계 4.6 동일을 실행 합니다.
    8. Agarose 젤 전기 이동 법에 의해 두 번째 PCR 제품을 분석. 모든 두 번째 PCR의 예상된 크기는 amplicon 생성 되었는지 확인 합니다. 비효율적 이거나 일반적인 확대의 경우 다시 새로운 뇌관 (단계 2.5-2.12) 디자인과 (4.2-4.8 단계) 확인.

5. 준비 및 세포내 패치 클램프 솔루션의 유효성 검사

참고: 다음 프로토콜 설명 준비 K+/gluconate의 유효성 검사를 기반으로 내부 솔루션, 하지만 거의 모든 유형의 패치 클램프 솔루션으로 RT-PCR의 효율을 방해 하지 않습니다 사용할 수 있습니다. 장갑을 끼고 RNase 무료 내부 솔루션을 얻기 위해 필수입니다.

  1. 내부 패치 클램프 기록 솔루션의 60 ml, 0.1 M 코의 임기 10 mL를 준비 합니다.
  2. 0.9 ml의 0.1 M 코 EGTA (최종 0.5 m m)의 11.4 mg을 디졸브.
  3. RNase 무료 40 mL 물 더하고 2.02 g K-글 루 콘 산 (144 m m 최종), HEPES (최종 10 mM)의 143 mg와 1 M MgCl2 (최종 3 m m)의 180 µ L의 분해.
  4. 0.1 M 코의 ~ 6 mL을 추가 하 여 7.2에 pH를 조정 합니다.
  5. RNase 무료 물 ~ 13 mL와 295 mOsm osmolarity를 조정 합니다.
  6. 내부 솔루션은 또한 반전 녹음 방송에 대 한 버퍼 사용 됩니다, 신중 하 게 Mg2 + 농도 제어 합니다. MgCl2 RT 반응에서 2 mM의 최종 농도 도달 하는 나중에 추가 하 여 내부 솔루션에서 낮은 Mg2 + 농도 대 한 보상.
  7. 패치 클램프 기록 후 수확된 셀을, 2-5 mg/mL의 RNase 무료 biocytin (단계 5.1-5.5) 위에서 설명한 내부 솔루션을 추가 합니다.
  8. 및 필터링 (0.22 μ m 기 공 크기) 내부 솔루션으로 100-250 µ L aliquots-80 ° C에서 그것을 저장 합니다.
  9. 단일 셀 RT-PCR를 위한 내부 솔루션을 사용 하 여 유효성을 검사 하려면 패치 클램프 솔루션의 6 µ L 1 ng / µ L에 희석 총 RNAs의 0.5 µ L을 추가 하 고 약 30 분 동안 벤치에 두고.
  10. 2 µ L micropipette 추가 실시간 믹스, 20 x DDT의 0.5 µ L, 0.5 µ L RNase 억제제, 및 0.5 µ L x 5의 2 µ L RTase, 37 ° c.에서 밤새 품 어 고
  11. 튜브를 회전 합니다. 얼음에서 물 (q.s., 80 µ L), 버퍼, X 10의 10 µ L 및 Taq 중 합 효소의 0.5 µ L (2.5 U, 5 U / µ L)를 추가 합니다.
  12. 유효성이 검사 된 뇌관 (단계 4.4-4.6)의 집합을 사용 하 여 PCR의 40 주기 수행 합니다.
  13. Agarose 젤 전기 이동 법으로 PCR 제품 분석 (단계 4.7 참조) 들은 예상된 크기를 확인 합니다.
    참고: 총 RNA의 0.5 µ L를 생략 하 고 0.5 µ L RNase 무료 물으로 교체 내부 솔루션은 무료로 RNA 또는 DNA 오염 하는 것을 보증할 것 이다.

6. 급성 슬라이스 준비

참고:이 프로토콜 (즉, 보다 적은 28 산 후 일) 청소년에 대 한 조각화 절차 설명 남성 및 여성 쥐. 자당 기반 인공 뇌 척추 액체 (실제) 같은 다른 절단 솔루션을 사용할 수40있습니다.

  1. 2 L 125 NaCl, 2.5 (mM)에 포함 된 실제의 준비 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 1.25 NaH2포4, 26 NaHCO3, 10 포도 당 및 자당 15. 조각 준비 하는 동안 glutamatergic 활동을 줄이기 위해, kynurenic 산의 1 mM를 추가 하 여 절단 솔루션을 준비 합니다.
  2. 슬 라이 싱, 전에 수술가 위, 괜 찮 아 요 아이리스가 위, 2 개의 주걱, 집게, 종이 필터, cyanoacrylate 접착제의 디스크를 포함 하는 해 부 키트를 준비 합니다.
  3. O2/CO2 (95% / 5%),-20 ° c.에 절단 챔버 다운 멋진 포화 얼음 절단 솔루션을 사용 하 여
  4. 작은 종이 타월 isoflurane 젖 었 마우스를 anesthetize. ~ 2 분 후 마우스는 깊은 마 취 발 핀치에 응답의 부재를 확인 하 여 있는지 확인 합니다.
  5. 신속 하 게 마우스를 목을 벨. 두 피를 제거 하 고 두개골을 엽니다. 신중 하 게 두뇌를 추출 하 고 얼음 추위 (~ 4 ° C) 절단 솔루션 O2/CO2산소 가득한 작은 비 커에 그것을 배치.
  6. -20 ° C 조건에서 절단 챔버를 제거 하 고 종이 타월로 수 분을 제거.
  7. 조심 스럽게 관심 영역 분리, 절단 챔버에 접착제 얼음 절단 솔루션 O2/CO2산소를 추가 하는 두뇌를 해 부.
  8. 300 µ m 두께 슬라이스는 vibratome를 사용 하 여 잘라. 산소 절단 솔루션으로 가득 휴식 실에서 실내 온도에 그들을 전송 하 고 0.5 h 이상에 대 한 복구 하도록 허용.

7. 단일 셀 RT-PCR 패치 클램프 기록 후

  1. 30% H2O2 솔루션의 관류 시스템 ~ 100 mL을 정기적으로 청소 하 고 그것이 RNase 오염 간과 소스 ~ 500 mL 증류수 박테리아 성장을 피하기 위해 광범위 하 게 린스.
  2. 수확 매일 집중된 표 백제로 가득 패치 피 펫으로는 필 라 멘 트 인터네셔널. 작성 패치 피펫으로 하지만 오히려 20 µ L 긴, 괜 찮 아 요, 유연한 팁 1 mL 주사기에 부착 하는 micropipette를 사용 하지 마십시오. 그리고, 광범위 하 게 RNase 무료 물으로 그것을 씻어 가스 살포 건조 합니다.
  3. RT-20 x DTT aliquots과 x 5를 포함 하는 얼음의 작은 상자를 준비 합니다. 벤치탑 쿨러에-20 ° C에서 RTase 및 RNase 억제 물 aliquots를 저장 합니다.
  4. 1-2 mL/min와 산소 실제에 끼얹는다 녹음 실에는 슬라이스를 전송 합니다.
  5. 장갑을 착용 하는 동안 붕 규 산 유리에서 패치 펫 (1-2 µ m 오픈 팁 직경, 3-5 m ω)을 당겨 하 고 내부 솔루션의 8 μ 채워 그들 중 하나. 피 펫 끌어당기는 사람 손잡이 RNase 오염 소스는 명심에서 하십시오.
  6. 새로운 장갑 착용 하 고 손가락으로 필 라 멘 트를 안 만질 동안 피펫으로 피 펫 홀더에 놓습니다.
  7. 긍정적인 압력 패치 피 펫을 접근 하 고 타겟된 셀 (그림 4) 특성에 기록 하는 전체 셀을 수행.
  8. mRNAs를 보존 하기 위해 20 분41. 로 전체 셀 구성에 시간을 제한
  9. 녹음의 끝에, 2 가득 500 µ L PCR 튜브 준비 RT 믹스 x 5의 µ L 20의 0.5 µ L x DTT, 스핀, 그리고 얼음에 저장.
  10. 부드러운 부정적인 압력 (그림 4)을 적용 하 여 셀 세포질을 수확. 시각적으로 컨트롤 셀의 콘텐츠는 단단한 물개를 유지 하면서 피펫으로 안에 온다.
    1. 가능한 경우 일부 intron 없는 유전자로 간주 됩니다 핵을 수집 하지 마십시오. 이런 경우에서 항상 게놈 오염 조사 하 gDNA를 증폭 하기 위한 뇌관의 집합을 포함 합니다.
    2. 핵은 피 펫의 끝 가까이 오고 있다, 부정적인 압력을 놓고 이동 핵에서 피 펫. 단단한 물개 유지 되는 것을 확인 하 고 새로운 피 펫 위치에 세포질 수집 하.
  11. 수확 때 아니 더 많은 자료 및 단단한 물개를 잃기 전에 중지 합니다.
  12. Extracellular 파편 (그림 4)에 의해 오염 제한 하 고 후속 조직화 학적인 분석에 대 한 세포 막의 폐쇄를 선호 하는 외부 아웃 패치를 부드럽게 피 펫을 철회 한다.
  13. 마음에 계속 그 손잡이, micromanipulators, 컴퓨터 키보드, 또는 컴퓨터 마우스 RNase 오염의 잠재적인 소스입니다. 만약 그들이 온전히 기록 하는 동안, 장갑 변경 합니다.
  14. 착 유기를 피펫으로 부착 하 고 긍정적인 압력 (그림 1)을 적용 하 여 PCR 튜브에 자사의 콘텐츠를 추방.
  15. 콘텐츠 컬렉션에 있도록 PCR 튜브에는 피 펫의 끝을 휴식.
  16. 짧게 원심 튜브, RNase 억제제의 0.5 µ L와 0.5 µ L RTase의 추가, 부드럽게 혼합, 다시, 원심 및 37 ° c.에서 밤새 품 어
  17. 튜브를 회전 하 고 PCR 분석까지 몇 개월-80 ° C에서 그것을 저장 합니다.
  18. 물 (q.s., 80 µ L), 10 µ L 10 x 버퍼의 Taq 중 합 효소의 0.5 µ L (2.5 U)를 추가 하 여 실시간 제품의 ~ 10 µ L를 포함 하는 관에서 직접 첫 번째 증폭 단계를 수행 합니다. 그런 다음 단계 4.8.2–4.8.8에 설명 된 지침을 따르십시오.

8. 조직화 학적인 얼룩 기록 된 셀의 (옵션)

  1. Electrophysiological 녹음 따라 axonal 수지상 나무에서 biocytin의 보급 수 있도록 산소 실제에 20 분에 대 한 슬라이스를 유지 합니다.
  2. 24-잘 접시와 수정 그것은 하룻밤 사이 4 %paraformaldehyde 1 mL와 4 ° C에서 0.1 m에서 인산 염 버퍼의 우물에는 슬라이스를 놓습니다.
  3. 씻어 슬라이스 4 번, 각, 5 분 1 mL 인산 Buffered 식 염 수 (PBS)와 함께.
  4. 같은 음, permeabilize 하 고 실 온에서 1 h 동안 냉 수 물고기 피부 (PBS-GT)에서 0.25% 트라이 톤 X-100 및 0.2% 젤라틴으로 보충 하는 PBS의 1 mL는 슬라이스 포화.
  5. 1 희석 붙일 레이블된 avidin와 밤새 품 어/400에 250-500 µ L의 PBS-gt는.
  6. 씻어 5 시간, 5 분 각각 1 mL PBS의 슬라이스를 탑재.

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결과

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멀티플렉스 RT-PCR의 대표 유효성 검사는 그림 3에 표시 됩니다. 프로토콜은 12 다른 유전자의 표현을 동시에 조사 하도록 설계 되었습니다. 기공을 글루타민 산 염 운송업 자 vGluT1 glutamatergic 신경42에 대 한 긍정적인 제어로 찍은. GABA 합성 효소 (GAD65와 갓 67), Neuropeptide Y (NPY), 및 Somatostatin (SOM) GABAergic 수3,,511의 표식으로 사용 되었다. Cyclooxygenase 2 효소 (COX-2) 피라미드 셀 하위 인구3,16

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토론

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단일 셀 다중 RT-PCR 후 패치 클램프 동시에 하 고 확실 하 게 electrophysiologically 확인 된 셀5에서 30 개 이상의 유전자의 표현을 조사할 수 있습니다. 단일 셀 수준에서 유전자 발현을 분석 고효율 PCR 뇌관을 요구 한다. 가장 제한 단계 중 하나를 셀의 내용의 모음입니다. 그것의 효율성은 셀 크기를 일치 하는 동안 가능한 한 크게 해야 패치 피 펫 팁의 직경에 따라 다릅니다. 1-2 µ m 오픈 팁 직경을 가진 펫은 가장 신경 종류에 적합 해야 입증 되었다. 또한 셀룰러 콘텐츠만 수집 되도록 필수적 이다 고 하지 주위 조직. 이 제어 electrophysiologically 수확 동안 단단한 물개를의 보존 하 여 이루어집니다. 피 펫 철수 더 동안 외부 아웃 패치 구성의 형성 세포 파편에서 수확된 세포질을 보호합니다. 멀티플렉스 RT-PCR는 또한 조사 셀 형식의 mRNAs 풍부에 따라 단일 셀의 성공률. 예를 들어, 항복 이다, 상대적으로 낮은 금액

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공개 사항

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저자는 공개 없다.

감사의 글

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원고에 대 한 그의 의견에 감사 박사 알렉산더 Mourot 하 고. 이 작품은 직원 회 드 라 검색 (ANR 2011 MALZ 003 01;에서 교부 금에 의해 지원 되었다 ANR-15-CE16-0010 고 ANR-17-CE37-0010-03), BLG Fondation 부 라 검색 르 츠에서에서 친교에 의해 지원 됩니다. 우리는 IBPS (파리, 프랑스)의 동물 시설 감사.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
프라이머 설계를 위한MACAW v.2.0.5NCBI
디티오트레이톨VWR443852ART
랜덤 프라이머시그마-알드리치(머크)11034731001RT
dNTP,GE 헬스케어, 생명 과학28-4065-52RT 및 PCR
RNasin 리보뉴클레아제 억제제PromegaN2511RT
SuperScript II 역전사 효소Invitrogen18064014RT
Taq DNA 중합 효소Qiagen201205PCR
미네랄 오일Sigma-Aldrich (Merck)M5904-5MLPCR PCR
프라이머Sigma-Aldrich (Merck)PCR / 탈염 및 200 µ에서 희석; M
튜브, 0.5 mL, 플랫 캡ThermoFisher ScientificAB0350RT 및 PCR
BT10 시리즈 - 10 &마이크로; L 필터 팁Neptune ScientificBT10RT 및 PCR
BT20 시리즈 - 20 &마이크로; L 필터 팁Neptune ScientificBT20RT 및 PCR
BT200 시리즈 - 200 & 마이크로; L 필터 팁Neptune ScientificBT200RT 및 PCR
BT1000 시리즈 - 1000 &마이크로; L 필터 팁Neptune ScientificBT1000.96RT 및 PCR
DNA 열 실린더Perkin Elmer CetusPCR
에티듐 브로마이드시그마-알드리치(Merck)E1510-10ML아가로스 젤 전기영동
트리스-붕산염-EDTA 완충액시그마-알드리치(Merck)T4415-1L아가로스 젤 전기영동
UltraPure 아가로스Life Technologies16500-500아가로스 젤 전기영동
Φ X174 DNA-Hae III 다이제NEB (New England BioLabs)N3026S아가로스 젤 전기영동
EDA 290코닥아가로스 젤 전기영
전기영동 전원 공급 장치 EPS 3500Pharmacia Biotech아가로스 젤 전기영동
미디 수평 전기영동 유닛 모델 SHU13시그마-알드리치(머크)아가로스 젤 전기영동
새틴 외관의 매끄러운 종이Fisherbrand1748B패치 클램프 내부 용액
수산화칼시그마-알드리치(Merck)60377패치 클램프 내부 용액
에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N&프라임;,N&프라임-테트라아세트산시그마-알드리치(Merck)E3889패치 클램프 내부 용액
HEPES시그마-알드리치(Merck)H4034패치 클램프 내부 용액
D-글루콘산 칼Sigma-Aldrich (Merck)G4500패치 클램프 내부 용액
마그네슘 용액Sigma-Aldrich (Merck)M1028패치 클램프 내부 용액
5500 증기압 삼투압계Wescor패치 클램프 내부 솔루션
BiocytinSigma-Aldrich (Merck)B4261패치 클램프 내부 용액
설탕시그마-알드리치(Merck)S5016슬라이스 준비
D-(+)-포도당 일수화물시그마-알드리치(Merck)49159슬라이스 준비
염화나트륨시그마-알드리치(Merck)S6191슬라이스 준비
염화칼시그마-알드리치(Merck)60128슬라이스 준비
중탄산 나트륨Sigma-Aldrich (Merck)31437-M슬라이스 준비
인산 나트륨 일 염기성Sigma-Aldrich (Merck)S5011슬라이스 준비
염화 마그네슘 용액Sigma-Aldrich (Merck)63069슬라이스 준비
염화칼슘 용액Sigma-Aldrich (Merck)21115슬라이스 준비
Kynurenic acidSigma-Aldrich (Merck)K3375Slice preparation
IsofluranePiramal Healthcare UKSlice preparation
VT 1000SLeica Biosystems14047235613Slice preparation
과산화수소 용액Sigma-Aldrich (Merck)H1009패치 클램프 셋업 세척
필라멘트가 있는 얇은 벽 유리 모세 혈관World Precision InstrumentsTW150F-4패치 클램프
PP-83Narishige패치 클램프
Eppendorf MicroloaderEppendorf5242956003패치 클램프
BX51WI 정립 현미경올림푸스패치 클램프
XC-ST70/CE CCD B/W 비디오 카메라Sony패치 클램프
Axopatch 200B 증폭기Molecular DevicesPatch Clamp
Digidata 1440Molecular DevicesPatch Clamp
pCLAMP 10 소프트웨어 제품군Molecular DevicesPatch Clamp
10 mL 주사기TerumoSS-10ESExpelling
E Series with Straight Body (holder)Phymep64-0997Expelling
Sodium phosphate dibasic시그마-알드리치(Merck)S7907조직화학적 계시
인산나트륨 일염기성 시그마-알드리치(머크)S8282조직화학적 계시
파라포름알데히드시그마-알드리치(머크)P6148조직화학적 계시
트리톤 X-100시그마-알드리치(머크)X100조직화학적 계시
냉수 생선 피부에서 추출한 젤라틴Sigma-Aldrich (Merck)G7041조직화학적 계시
Streptavidin, Alexa Fluor 488 접합체ThermoFisher ScientificS11223조직화학적 계시
24웰 플레이트Greiner Bio-One662160조직화학적 계시
다중 정렬, , , , 스트 동 륨 륨 염화륨

참고문헌

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