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방법 논문

현장 양극 다 박테리아를 풍부 하 게 각자 서 있는 전기 설정

7.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57632

⸱

2018년 7월 24일

 ,  ,  , 
1International Center for Materials Nanoarchitectonics, National Institute for Materials Science, 2Department of Earth Sciences, University of Southern California, 3Department of Applied Chemistry, The University of Tokyo

이 논문에서

요약

현장 미생물 농축 또는 제자리에서 재배 기술을 낮은 바이오 매스 geochemically 극단적인 환경에서 특히 어려운 문화 미생물 taxa의 절연 용이 하 게 수 있습니다. 여기, extracellular 전자 전송 (동유럽 표준시) 수 있는 미생물 긴장을 풍부 하 게 하는 외부 전원 공급 장치를 사용 하지 않고 전기 설정을 설명 합니다.

초록

혐 기성 호흡 전자 수송 불용 성 미네랄 (extracellular 전자 전송 [동유럽 표준시] 라고도 함)와 결합 하 여 미생물 에너지 생산 및 많은 표면 환경, 특히 지 속성에 대 한 중요 한 것으로 생각 됩니다. 부족 한 가용 터미널 전자 수락자. 동유럽 표준시 가능한 미생물 성공적으로 다양 한 환경 으로부터 격리 되어, 동유럽 표준시 수 있는 박테리아의 다양성은 아직도 제대로 이해 하 고, 특히 어려운 샘플, 낮은 에너지 또는 많은 표면 같은 극한 환경 생태계입니다. 여기, 우리는 양극을 사용 하 여 호흡기 터미널 전자 수락자로 동유럽 표준시 가능한 박테리아를 풍부 하 게 현장 전기 시스템을 설명 합니다. 이 양극 음극 abiotic 산소 감소 catalyzing의 능력에 연결 된다. 전극 전위를 찾아내지를 potentiostat 사용 하는 electrocultivation 방법으로이 접근을 비교, 2 전극 시스템 외부 전원이 필요 하지 않습니다. 우리는 우리의 사이트 농축 삼목, 북부 캘리포니아에서 지상파 serpentinization 사이트에서 알칼리 연못에 활용의 예 제시. 미네랄 감소 박테리아 배양에 이전 시도 실패 했다, 어떤은이 사이트의 낮은 바이오 매스 자연 또는 금속 미생물 감소의 낮은 상대적 풍요로 움으로 인해 가능성이. 우리의 2 전극 농축을 구현 하기 전에 우리는 용 존된 산소 농도의 수직 프로 파일 측정. 탄소를 우리가이 양극, 백 금 도금 탄소 음극 혐 기성 및 호 기성을 지 원하는 것이 깊이에서 처리 하 고, 각각 느꼈다 느꼈다. 현장 보육, 다음 우리는 또한 실험실에서 양극 전극 농축 하 고 표면 부착에 비해 뚜렷한 미생물 지역 사회 또는 biofilm 지역 사회는 삼목에서 일반적으로 관찰을 확인 합니다. 이후이 농축은 첫 번째 electrogenic 미생물의 분리에는 삼목에서 지도 했다. 현장 미생물 농축의이 방법은 크게 낮은 바이오 매스에서 또는 샘플 서식 하기 어려운 동유럽 표준시 가능한 세균의 분리를 향상 시킬 가능성이 있다.

서론

여러 미네랄 감소 미생물 고체 상 미네랄 터미널 전자 수락자로 이용 하 전자 산화 환 원 효소1통해 세포의 외면에 실시 하는 extracellular 전자 전송 (동유럽 표준시) 프로세스에 의해 표시 되었습니다. 동유럽 표준시는 중요 하다, 뿐만 아니라 미생물-미네랄 프로세스 또한 적용 된 에너지 및 환경 기술, 미생물 연료 전지2, 전극 합성3, bioremediation4등. 새로운 동유럽 표준시 가능한 박테리아는 높게 수요가 많다, 그리고5근본적인 또는 적용 관점 광범위 하 게 연구 되었습니다. 그러나, 우리만이 박테리아의 생태 또는 생물 지구 화학적 중요성에 대 한 통찰력을 제한 했다. 동유럽 표준시 가능한 미생물의 대부분 고립 된 농축 물, 앙금, 또는 혐 기성 digesters 실험실6, 에서 MnO2, Fe2O3 등 태세 전극 고체 전자 수락자를 사용 하 여 다음과 같은 되었습니다. 7 , 그러나 8., 이러한 방법은 종종 비슷한 컨소시엄 생산과 잠재적으로 낮은 에너지 또는 낮은 바이오 매스 시스템, 바이어스 랩 또는 axenic 문화 환경9 에 적응 하는 이러한 미생물의 능력을 지배 수 있습니다 더 민감한 taxa를 그리 워 . 일반적으로 낮은 바이오 매스 환경, 사이트에서 물의 세균성 세포를 집중 필터링 됩니다. 그러나, 동유럽 표준시 가능한 박테리아 종종 전시 혐 기성 물질 대사 및 산소 노출을 더 억제 하거나 그들의 재배 방지 따라서. 산소에 노출 하지 않고 셀을 집중 대체 현장 방법론 동유럽 표준시 가능한 세균의 분리를 용이 하 게 수 있습니다. 여기, 우리는 외부의 파워 소스에 대 한 필요 없이 시간의 긴 기간 동안 동유럽 표준시 가능한 미생물을 풍부 하 게 현장 전기 기술에 대 한 설치 정보를 보고 합니다.

북부 캘리포니아, 삼목10에서 높은 알칼리 온천에서 우리의 electrocultivation 실험을 사용 하 여이 현장 전기 화학 기술을 설명 합니다. 삼목에서 스프링의 지구 화학은 표면에 serpentinization에 의해 영향을. 봄은 매우 감소, 산소 농도 검출이 기능적으로 무산 소 환경11동유럽 표준시 통해 미생물 에너지 생산을 위한 잠재력을 강조 하는 공기 물 인터페이스에서의 제한. 그러나, (16S rRNA 또는 Metagenomic 분석)에 삼목에서 동유럽 표준시 가능한 미생물을 지 원하는 증거가 있다. 비록이 환경 전자 수락자, 터미널 전자 수락자, 베어링 (즉, serpentinization에 기인 하는 미네랄 철 분 등 미네랄을 포함 하 여 불용 성 미네랄을 사용 하 여에 대 한 잠재력으로 특징 되었습니다 자 철 광), 광범위 하 게 조사12되지 않았습니다. 우리는, 따라서, 캠프장 봄, 삼목, 동유럽 표준시 가능한 미생물 (그림1)13풍부 하에 높은 산도 봄에 우리의 전기 화학 시스템 배포.

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프로토콜

1. 환경 부 화에 대 한 2 전극 시스템 구축

  1. 양극 재료의 준비와 처리 탄소 전극 (그림 2)을 느꼈다.
    1. 잘라 원하는 바이오 매스 농축에 따라 동일한 치수를 생각 하는 탄소. 30 분 동안 90% 에탄올에 각 전극을 담가 다음 씻어 8 시간 이상 각 린스 후 1 분 동안 sonicating 이온된 물.
    2. 두 번 최소 각 세척에 대 한 12 h 교 반 1 M HCl에에서 전극 세척.
    3. 6-12 h 또는 액체의 무료 때까지 따뜻한 (37 ° C) 오븐에서 전극 건조.
    4. 소계 접시 (비 스틱 표면)에 제조 업체의 프로토콜 당 흑연 에폭시를 사용 하 여 티타늄 와이어 전극 연결 합니다.
      참고: 우리는 에어로빅 부식 높은 관용 때문에 티타늄 와이어를 사용합니다.
    5. 6 h에 대 한 120 ° C에서 전극에 구 우 십시오.
    6. 티타늄 와이어 사이의 저항 테스트와 탄소는 ohmmeter와 느낌과 와이어와 펠트 전극 사이의 저항 5 ω가 하 인지 확인 합니다.
  2. Electroplation의 탄소에 백 금 전극 음극 재료의 준비에 대 한 느낌
    1. 탄소 펠트 전극, 유리 용기에 12 h의 최소 2 분 코에서에서 준비 단계 1.1에서 잠수함
    2. 전기 청소 또한 참조 (RE) 및 카운터 전극 (CE)을 수용 하는 3-전극 반응 기에서 전극 (우리가) 작업으로 전극 장소. 우리, 연결 재, 그리고 악어 클립으로 potentiostat에 CE. ohmmeter와 모든 연결을 확인 합니다.
      참고: 우리가 사용 하는 Ag/AgCl (포화 KCl) 전극과는 백 금 철사로 다시 및 CE, 각각.
    3. ' 포 이즈 ' 1.0 V vs. 에 전극 Ag/AgCl 600 2 M 코 (전체 전극 잠수함 충분 한 양을 사용 하 여)를 포함 하는 전해질 용액에 s. 전극 (이 유리로 만들어진) 전기 화학 반응 기에서 꺼내 주세요. 린스 이온된 수에 전극 적어도 8 시간, 1 분 동안 각 린스 후 sonicating. 12 h 이상 100 ° C에서 전극 건조.
    4. 도금 솔루션을 준비, 황산 2 분의 1 l 연산 100 g, 황산 나트륨 5 g 및 디 hexachloroplatinate (IV) hexahydrate의 2 세대를 추가 합니다.
    5. 무게 청소 및 단계 1.2.1–1.2.2에서 준비 전극을 건조 하 고 1.2.3 단계에서 준비 후 전극 도금 솔루션에서 커버. 도금 솔루션에 세 번 30 전극 sonicate s 각.
    6. -0.2에서 전극 전위를 찾아내지 여 전극을 전기 도금 460에 대 한 V 대 Ag/AgCl 도금 솔루션에서 s. 전극 이온된 수에 두 번 헹 구 고 백 금 낭비를 삭제.
    7. 린스 전극 이온된 수에 3 번 이상 20 sonicating 각 린스 후 s. 쥡니다 적어도 3 번 이상 없이 린스.
    8. 100 ° C 이상 12 헤 무게 계량 느꼈다 탄소 전극에 전기 백 금 전극에서 전극 건조.

2. 건설 및 2 전극 시스템의 설치

  1. 자연 환경에서 각 전극에 대 한 설치 사이트의 조사.
    1. 용 존된 산소 (DO) 프로브를 사용 하 여 산소 농도 결정 합니다.
    2. 사이트에서의 깊이 프로 파일을 확인 하십시오.
      참고: 양극에 대 한 원하는 환경 조건은 일관 된 수 화 고 anoxia. 원하는 경우, 빛에서 양극을 차폐 하 여 oxygenic 광합성의 영향을 제거 합니다. 음극 배치에 이상적인 조건을 지속적으로 수 화 그리고 근처 oxic 것 바다 표면. 필요한 경우, 음극의 표면 접촉을 유지 하는 수레를 연결 합니다.
  2. 연료 전지 타입 2 전극 외피 시스템의 건설
    1. 원하는 길이의 절연된 와이어 및 티타늄 와이어의 리드 전극 (한 양극과 한 백 금 도금된 음극)에서 두 개의 라인을 복잡 하 게 연결 합니다. 커버 방수 왁 스로 연결 하 고 더 해양 학년 열 수축 튜브를 사용 하 여 보호 합니다.
    2. 알려진 저항 저항으로는 양극와 음극 2 개의 철사를 연결 합니다.
      참고: 생물 학적 시스템, 낮은 저항 (10에서 1, 000 Ω) 귀 착될 더 일관 된 생물 학적 활동. 원하는 경우, 높은 저항 저항 부정적인 제어 생물 학적 활동을 막을 것 이다. 저항 및 리드 사이의 모든 연결의 부식 방지, 우리 열 수축 튜브로 그들을 보호.
  3. 측정 전압 및 시간이 지남에 따라 온도 로깅에 대 한입니다.
    1. 연료 전지 반응에서 현재 생산 추정에 대 한 저항의 끝 사이의 전압을 확인 하십시오.
    2. 양극 및 음극 (제조 업체의 프로토콜 참조) 적절 한 연결 된 데이터 로깅 전압계를 사용 하 여 시간이 지남에 전압 차이 측정 합니다.
      참고: 동시 온도 데이터 로깅 선택 사항 이지만이 정보 변경 반대로 abiotic를 현재 생물 학적 변동에 관련을 도울 수 있다.
  4. 데이터로 거 및 전기 연결 보호
    1. 고정 또는 비닐 봉투를 사용 하 여 비에서로 거 및 모든 전기 연결을 보호 하기 위해.
    2. 비닐 봉투 및 강한 바람에서 보호 하기 위해 긴밀 하 게 케이블을 수정 합니다. 예를 들어 그림 1에 표시 됩니다.

3. 자연 환경에서 전극 샘플의 수집

  1. 양극 샘플의 품질 산소 오염으로 인해 손상 되지 않도록 하려면 혐 기성 조건 하에서 전극을 수집 합니다.
  2. 전극 샘플을 수집 하기 전에 적어도 30 분 혐 기성 위치에 있는 테스트 튜브를 넣어. 예를 들어 넣어 테스트 튜브와 뚜껑 별도로 혐 기성 안에 병을 만들기 위해 연못의 바닥에.
  3. 와이어 커터와 전극에서 티타늄 리드를 잘라, 부드럽게 테스트 튜브에 전극 샘플을 수집 하 고 혐 기성 물 영역에 그것을 봉인. 샘플을 신선한 유지 하려면 샘플 컬렉션 직후 4 ° C에서 샘플을 저장 합니다.
    참고: 또는, 전극 옮겨질 수 있다 무산 소 (N2 제거) 매체에 직접. (스즈키 외 에 의해 설명 된 삼목 매체 사용 11)를 미생물 성장에 대 한 충분 한 영양분을 제공 사이트에서 측정 하 고 개정 수성 지구 화학에서 설계 되었다. 이 미디어는 다른 실험실 실험에 대 한 수정 되었습니다.

4. 현재 생산 및 DNA 분석에 대 한 확인 실험실

  1. 전극에 부착 하는 미생물 컨소시엄의 현재 생산 능력에 대 한 전기 화학 확인.
    1. 샘플링 된 전극, 백 금 철사와 Ag/AgCl (포화 KCl) 전기 화학 반응 기14,15 구성 전극 우리가 세 륨, 그리고 다시, 혐 기성 챔버에 각각. 삼목 매체 포함 하는 수용 성 탄수화물 전자 기증자로 전기 화학 반응 기를 채우십시오.
    2. 0.2에서 전극 전위를 ' 포 이즈 ' V 대 Ag/AgCl 그리고 측정 현재 생산.
  2. 미생물의 DNA를 사용 하 여 전극 샘플에서 DNA 추출 키트 (재료의 표 참조).
    1. 혐 기성 글러브 박스 70% 에탄올으로 내부를 청소 하 고 소독된 접시 알루미늄 호 일에 넣어.
      참고: 혐 기성 챔버 산소 농도 1 ppm 미만 여 유지 팔라듐 촉매의 면 전에 서 산소 청소를 ~ 2-3% 정도에서 수소 분위기를 유지 합니다.
    2. 전기 화학 반응 장갑 상자에, 접시, 샘플 전극 위에 열고 DNA 키트에 사용 되는 튜브에 맞게 크기를 잘라. 제조 업체의 프로토콜 진행.

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결과

현재 생산은 그림 3와 같이 전압 데이터로 거를 사용 하 여 약 3 개월간 성공적으로 측정 되었다. 이 이번 봄, 때문에 강한가 비가 봄을 영향을 미치는 대 한 가장 긴 안정적인 잠복기로 선정 되었다. 짧은 기간 장기간 바이오 매스의 강한 농축을 제공할 수 있지만, 충분 한 수 있습니다. 우리는 전기 부 화 후 2 전극 시스템의 연결을 확인 하 고 시스템에서 부식의 증거가 관찰. 더 높은 현재 생산 부정적인 제어와 100 k ω 저항에 비해 낮은 저항 (1, 000 Ω) 2 전극 시스템에서 관찰 되었다. 첫 달에 점진적 현재 생산 증가 성장, 축적 또는 또 다른 두 달 동안 안정적인 현재 생산에 따라 전극의 표면에 미생물의 숙박 시설을 제안할 수 있습니다. 흥미롭게도, 현재 생산에서 전기 화학 농축의 전체 기간을 통해 약 24 h 주기 oscillated.

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토론

기술된 연구에 우리는 현재 생산 현장에서 함께 연결 된 미생물 컨소시엄의 농축을 보여줍니다. 현재 지원 미생물 활동에이 시스템에 짧고 긴 시간 동안 관찰 된 패턴 확장 됩니다. 기능 2-전극 (연료 전지 타입) 시스템 구축을 위한 중요 한 단계는 식별 이며 안정적인 물 수준 위치와 환경에 있는 산소 농도 활용 하 여. 음극 양극 혐 기성 조건 하에서 유지 되 고 전극 전위차 동유럽 표준시 가능한 박테리아의 혐 기성 호흡을 촉진 하는 동안 공기 물 인터페이스에서 산소에 노출 됩니다.

환경 전기 화학 시스템 실험실 원자로에 매일 현재 진동을 관찰합니다. 이 전류 변동 관찰 되었다 때문에 일광 동안 시간 최대 및 최소 전류 새벽과 황혼에 효과의 사이 관찰 되었다 또는 온도 미생물 현재 생산에서 변화를 설명할 수 있다. 측정 온도, 햇빛 및/또는 다른 환경 변수 수 추가 확장 컨트롤의 이해와 미생물 전자 흐름의 드라이버 환경 시스템에. 또는 블록 햇빛에 요소는 제거 하거...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

우리는 우리에 게는 삼목에 대 한 액세스를 허용 하 고 장기 부 화에 대 한 위치에 대 한 컨설팅에 대 한 로저 Raiche 데이비드 McCrory를 인정 하 고 싶습니다. 우리는 또한 2013-2014 시즌 동안 삼목 필드 승무원 감사: 시노 스즈키 슌이 시이, 그렉 Wanger, 그레이 채 드 윅, 타 램, 매튜 Schechter. 시노 스즈키과 Gijs Kuenen 연구에 대 한 통찰력 배양 지원 추가. 이 작품은 젊은 과학자 A와 B 과학 진흥 (JSP) KAKENHI 그랜트에 대 한 일본 사회에서 번호 17 H 04969와 26810085, 각각, 그리고 일본 기관에 대 한 의료 연구 및 개발 (17gm6010002h0002)는 특정 통해 투자 되었다. 미국 자금 어두운 에너지 생물권 (C-DEBI) (OCE0939564) 사와 NASA 우주 생물학 연구소-생명 지 하 (NAI-루) (NNA13AA92A)에 대 한 미국 사무실의 글로벌 해군 연구 (N62909-17-1-2038), 및 센터에 의해 제공. 이 작품의 일부는 과학의 승진에 대 한 일본 사회의 일환으로 실시 됐다: 아네트 로우 (PE15019) 사누키 하시 모토의 실험실에서 도쿄의 대학에 대 한 단기 박사 친목.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
탄소 펠트 시트n / a/ a양극 및 음극
티타늄 와이어Nilaco CooporationTI-451485연료 전지 시스템
흑연 에폭시전해 lnc를n/a전극
과 Ti 와이어
건조 오븐YamatoDY300전극을 굽습니다
전도성 그래핀 에폭시
디지털 멀티 미터Fluke616-1454를 사용하여 저항의 옴 값
을 확인합니다
용존 산소 프로브Sper Science#  850045산소
농도를 확인합니다. 환경
저항기Sodial연료 전지
시스템을 구성하는 데 사용
전도선Pico81141s연료 전지
시스템을 구성하는 데 사용
전압계 및 데이터 로거T & D corporationVR-71데이터 기록에 사용
헥사클로로플라티네이트(IV) 헥사하이드레이트wako18497-13-7전기
구연산Wako038-06925전기에 사용
황산Wako192-04696전기에 사용
HClWako083-01095전극 세척에 사용
유리 실린더N/AN/A 주문형, 전기화학 반응기로 사용
PTFE 커버 및 베이스N/AN/A주문형, 전기 화학 반응
부틸 고무N/AN/A
의 각 구성 요소 사이에 삽입전기화학 반응
인듐 주석 도핑된 산화물(ITO) 전극GEOMATECNo.0001작동 전극으로 사용, 5Ω/sq
Ag/AgCl KCl 포화 전극HOKUTO DENKOHX-R5기준 전극으로 사용, Φ 0.30mm
백금 와이어Nilaco CooporationPT-351325카운터 전극으로 사용
NaHCO3Wako191-01305Cedars Media(CMS)에 사용
CaCO3Wako030-00385CMS에 사용
NH4ClWako011-03015CMS
에 사용마그네슘<서브>2  &황소; 6H2OWako135-00165CMS NaOH에 사용
 Wako198-13765CMS
Na2SO4Wako194-03355CMS
K2HPO4Wako164-04295CMS
CABSSANTA CRUZSC-285279CMS
인큐베이터TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD.LTI-601SDprecultivation
오토클레이브 기계에TOMY SEIKO CO., LTD.LSX-500전기화학 반응기 및 매체의 살균에 사용됩니다.
클린 벤치SANYOMCV-91BNF전기화학 반응기 및 매체가 다른 미생물로 오염되는 것을 방지하는 데 사용됩니다.
원심분리기분리기 Eppendorf5430R회전 속도가 최대 6000회; g가 필요합니다
질소 가스 발생기Puequ CO., LTD.PNTN-2질소 가스 실린더는 가스 발생기
UV-vis 분광계SHIMADZUUV-1800세포 밀도 최적화에 사용
PotentiostatBioLogicVMP3생물막 형성 및 운동 동위원소 효과 실험에 사용
열 물 순환기1 개TR-1A전기 화학 반응기의 온도 유지 보수에 사용
패러데이 케이지HOKUTO DENKOHS-201S전기 화학 실험에 사용
혐기성 챔버COYTypeB (비닐)혐기성 조건에서 실험 수행
Ultraclean DNA 추출 키트MoBio
n 에 사용 구성하는 데 사용됩니다.을 연결하는 데 사용됩니다. . 수소 치에 사용 기 주문형의 덮개 및 기초로 사용, 전기화학 반응기 Septa GL Science 3007-16101기 의 주입구로 사용 에 사용 사용 대신 사용할 수도 있습니다

참고문헌

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