돌출 힘 현미경 검사 법: 셀 돌출에 의해 개발 된 세력을 계량 하는 방법

Summary

여기, 우리 podosomes 지형 이미지의 자동 분석 영화의 준비에서 규격 필름에 적용 되는 돌출 세력을 평가 하는 데 사용 하는 실험 기법을 상세하게.

Abstract

수많은 생물학 문맥에서 동물 세포를 기계적인 힘을 개발 하 여 그들의 환경과 물리적으로 상호 작용 해야 합니다. 이러한 가운데, 견인 힘 잘 성격을 나타낸, 하지만 그들의 기판에 기가 세포에 의해 발휘 된 돌출 힘의 측정을 허용 하는 기술의 부족. 우리는 그들의 기질에 부착 세포에 의해 발휘 된 돌출 힘을 측정 하는 실험 설치 설계. 셀 규격 Formvar 시트에 도금이 기판 변형 하 고 결과 지형 나노미터 스케일에 원자 힘 현미경 (AFM)으로 매핑됩니다. 강제 값 다음 밀어내 세포 구조의 형상에 따라 변형 프로 파일의 분석에서 추출 됩니다. 따라서, 살아있는 세포의 개별 튀어나온 단위에 의해 발휘 된 힘은 시간이 지남에 따라 측정할 수 있습니다. 이 기술은 힘 생성 및 돌출을 포함 하는 많은 세포질 과정에 그것의 규칙의 연구를 수 있게 된다. 여기, 우리 인간의 세포에 의해 형성 하는 podosomes에 의해 생성 된 밀어내 힘을 측정 하는 응용 프로그램을 설명 합니다.

Introduction

동물 세포 매트릭스와 그들의 환경¹을 구성 하는 다른 세포와 물리적으로 상호 작용. 이것이, 시체를 내 면화, 외부 정보를 마이그레이션하거나 차별화 그들을 위해 필요 합니다. 그런 과정에서 셀 기계적인 힘을 생성 해야 합니다 및 힘을 생성 하 고 환경 조사에 셀의 능력 영향 확산 예를 들어 감독의 생물 학적 행동으로 수많은 연구 최근 몇 년 동안, 또는 차별화^2,3. 차례로, 세포의 힘의 측정 힘 세대의 규정을 연구 하 고 셀 행동과 조직의 운명^4,5에 그것의 연루를 이해 주요 원조 이다.

최근 몇 년 동안 셀의 환경⁶에 행사할 수 있는 힘을 측정 하기 위해 수많은 기술의 개발을 목격 했다. 이들의 대부분 공개 견인 힘 세포 그들은 모바일 프로브 또는 변형 기판에 끌어 발휘 하는 수단이 되었습니다. 그러나, 기계적인 힘 extracellular 환경으로 돌출에 관련 된 측정 기술의 부족에서 고통 되며 날짜 잘 특징.

이 제한을 극복 하기 위해 우리는 기가 기판에가 해지는 힘을 측정 하는 방법을 제시. 그것은 도금을 측정 하는 세포에 의해 기판 변형 고 참여 세력을 추론할 수 직교 방향으로 변형 수 얇은 탄성 시트에 살아있는 세포로 구성 되어있습니다. 기판 지형 나노 분해능 원자 힘 현미경 검사 법을 사용 하 여 측정 되 고 밀어내 세포 구조^7,8, 의 기하학의 지식에 의존 하는 변형에서 세력의 평가 ⁹.

여기, 우리는 설치 및 podosomes, 밀어내 접착 구조 3 차원 환경^{10,11, 그들의 엽 마이그레이션에 대 한 대 식 세포에 의해 형성 된에 의해 생성 된 힘을 측정 하는 응용 프로그램 설명 12,13,14,15,,1617}. 우리는이 기술은 힘 생성 및 돌출을 포함 하는 많은 세포질 과정에 그것의 규칙의 이해를 미리 것입니다 믿습니다.

Protocol

1입니다. 격자 Formvar 코팅의 준비

1. 순수한 아세톤과 전자 현미경 격자를 청소 하 고 필터 종이에 그들을 건조. 다음 깨끗 한 순수 에탄올, 현미경 슬라이드 렌즈 종이로 닦 고는 송풍기와 먼지를 제거.
2. 하단 부분에 Formvar의 솔루션을 포함 하는 영화 캐스팅 장치의 퍼 널에 에탄올 청소 유리 슬라이드를 수직으로 놓습니다. 깔때기의 정상을 커버.
3. 수준 슬라이드의 2/3에 도달할 때까지 분무기 전구와 Formvar 솔루션 (에틸렌 dichloride에 0.5%)의 100 mL를 펌프.
4. 1 분 동안 솔루션에 슬라이드를 유지.
5. 꾸준한에 Formvar 솔루션 드레인 장치 밸브를 엽니다. 15 mL/s 10의 유량 30-80 nm의 Formvar 영화를 얻을 것입니다. 영화의 두께 Formvar 용액의 농도 배수 장치 비율에 의해 결정 됩니다.
   참고: 배수 속도는 압력 을 통해 공기를 밖으로 밸브 밸브를 천천히 열어 배기에 의해 제어할 수 있습니다. 빨리 배수, 두꺼운 영화. 실제로, Formvar 유량에서 필름 두께 예측 하기 어렵기 때문에 우리 Formvar 영화의 여러 배치를 준비 하 고 AFM에 의해 그들의 두께 제어 (단계 2 참조).
6. 상공에서 슬라이드를 제거 하 고 섬세 하 게 어떤 액체 Formvar 제거 하려면 필터 종이에 그것을 건조.
7. 면도날으로 Formvar 영화에서 20 m m x 50 m m 사각형으로 잘라.
8. 깨끗 한 증류수로 비 커를 천천히 빠지게 슬라이드 수직으로 영화에서 부동 물: 영화 물 표면에 플 로트 해야 합니다.
9. 영화, 빛나는 장소 건조 아세톤 청소 격자 얼굴.
10. 라운드 유리 coverslip (Ø 12 mm) 격자의 몇 가지에 배치 합니다. 이 coverslip 필름 두께 측정 될 것입니다 (2 단계 참조).
11. 그것에 맞게 크기 조정 흰색 스티커와 현미경 슬라이드를 커버. 전체 영화 슬라이드에 준수 될 때까지 부동 Formvar 영화의 테두리에서 수직으로 슬라이드를 찍어. 필터 종이 슬라이드에서 과잉의 물을 제거 하 고 실 온에서 하룻밤 말리.

2입니다. 두께의 측정

1. 주위는 coverslip Formvar 슬라이드에서 그것을 분리 하는 핀셋으로 잘라.
2. 펜으로는 coverslip 아래의 표에서의 위치를 표시 합니다.
3. coverslip에서 그것을 분리 하는 표시 된 그리드 주위 Formvar 잘라. 있을 것입니다 따라서 구멍 나머지 Formvar 시트, 필름 두께 측정할 수 있게 됩니다. PBS 가진 coverslip 커버 하 고 현미경, 유리 슬라이드에 배치.
4. AFM 유리 블록, 골든 스트라이프 봄의 끝에 의해 포함 되지 않는 다는 것을 확인에 실리콘 나이트 라 이드 캔틸레버를 탑재 합니다.
   참고: 감도 캔틸레버의 스프링 상수 한다은 이전 조정 되었습니다 PBS에.
5. AFM 모듈에 유리 블록을 탑재 하 고 모듈 현미경에 놓습니다.
6. 관측 실에 Formvar 코팅 coverslip 놓고 PBS의 500 µ L로 그것을 커버 합니다.
7. 접촉 모드와 0.5 nN 힘 세트 포인트에서 AFM을 사용 하 여 Formvar 시트에 구멍의 테두리를 검색 합니다.
8. 높이 측정, 유리 coverslip 표면 참조로 사용 하 고 횡단면의 높이 Formvar 두께 평가 (Formvar 배치 당 적어도 10 측정을 수행).

3. 시드 셀 격자에

1. 살 균 후드는 coverslip에 양면 접착 테이프의 스트립 (12 m m x 3 m m)을 넣어.
2. 핀셋으로 Formvar 코팅 그리드 밖으로 잘라내어 (격자의 가장자리에만 테이프에 붙어 있이 필요가) 접착 스트립에 거꾸로 넣어. Formvar 영화는 coverslip 얼굴을 해야 합니다.
3. 문화에이 장치를 잘 넣어.
4. 장소 10⁴ 대 식 세포를 포함 하는 FCS 없이 RPMI의 10 µ L 드롭릿 인간 monocytes¹⁶에서 분화 했다.
   참고: 확인을 Formvar 코팅의 손상을 방지 하기 위해 피 펫 팁 그리드를 건드리지 않도록 주의.
5. 30 분 (37 ° C, 5% CO₂) 셀 준수를 품 어.
6. 10 %FCS 포함 된 RPMI의 2 mL와 잘 작성.
7. AFM 관찰 하기 전에 준수 세포를 37 ° C, 5% CO₂ 에서 2 h에 대 한 장치를 품 어.

4. 지형 변형 Podosome 유도의 측정

1. 유리 바닥 페 트리 접시에 두 배로 양면 접착 테이프의 두 스트립을 스틱.
   주: 2 개의 지구 사이 거리 격자 직경 보다 작은 이어야 한다.
2. 신중 하 게 접착 테이프에서 대 식 세포와 도금 그리드를 분리 합니다.
3. 뒤집어 그리드 셀 유리를 직면 하 고 있기 위하여 그리고 두 접착제 스트립 사이의 눈금 막대기.
4. 수정 2 그리드 새로운 두 배로 양면 접착제의 제거: 그리드 AFM 팁에 액세스할 수는 격자의 중앙 영역을 떠나 두 접착제 스트립 사이 끼여 될 이렇게 것 이다.
   참고: 격자 잘 고정 하지 트위스트; 있는지 확인 그렇지 않으면 AFM 캔틸레버 Formvar 표면 접근 수 되지 않을 수 있습니다.
5. 10 mM HEPES (pH 7.4)와 보충 사전 온수 37 ° C 배양 (RPMI fcs가 10%)의 2 개 mL를 페 트리 접시를 채우십시오.
6. 37 ° C 접시 히터에 문화 접시를 놓습니다.
7. AFM 무대에 접시 히터를 설치 합니다.
8. 37 ° c.에 안정화 시스템
9. 0.5 nN 힘으로 접촉 모드에서 podosomes를 찾을 첫 번째 글로벌 이미지를 만들고 약 20 nm 큰 픽셀 3 Hz에서 Formvar 지형 스캔.
   참고: 격자의 가장자리 주변을 스캔 하지 마십시오.

Results

위의 프로토콜 돌출 세력 대 식 세포 podosomes Formvar 기판에 의해 적용 척도를 실험 설치 하는 방법을 설명 합니다. 이 AFM을 사용 하 여 이루어집니다 하 고 그림 1에 나와 있다.

JPK 데이터 처리 소프트웨어를 사용 하 여 podosomes 아래 부푼 것의 지형 이미지를 분석할 때 3도 다항식 적합 해야 공제 하지 각 스캔 라인에서 독립적으로. Podosome 유도 범프의 최대 높이 이미지 측면 z 색 눈금을 추가 하 여 평가 될 수 있다. TIFF 형식으로 수출 되 고, 후 지형 이미지 전용된 집 만든 ImageJ 매크로 사용할 수 온라인⁸를 사용 하 여 추가 분석 이다. 이 매크로 부푼 것에서 수정된 높이 이미지 및 힘 지도 (

Discussion

물질의 성질

우리의 경우 Formvar, 변형 막에 대 한 재료의 선택은 몇 가지 요구 사항을 충족 해야 합니다. 자료는 가시 광선에 투명 하 고 밝은 분야 및 형광 현미경 관측을 허용 하도록 제한 된 자동 형광을 전시 해야 합니다. 박막의 거칠기 있어야 잘 10 nm 세포 접착에 있는 지형 효과 방지 하 고 AFM 화상 진 찰에 의해 세포 유도 돌출의 명확한 관측을 허용. 마지막으로, 영의 계수 및 재료의 두께에 따라, 막의 강성 해야 podosome 사이트에서 생성 하는 일반적인 스트레스에 대 한 몇 가지 관찰 deformability를 유지 하면서 podosomes의 형성을 유도 하기 위해 충분히 높은 주위는 10-100 kPa. Formvar 소재, 30-80 nm의 박막에 이러한 모든 제약 사이 좋은 타협 이다. 그것은 그 Formvar 막의 두께 조정 하 여 그 강성 조정 될 수 있다 podosomes⁷

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 메쉬 니켈 그리드	전자 현미경 과학	G200-Ni
여과지	Sigma-Aldrich	1001-055
현미경 슬라이드	Fisher Scientific	10235612
흰색 스티커 26 x 70 mm	Avery	DP033-100
배출구에 밸브가 있는 필름 주조 장치	Electron Microscopy Sciences	71305-01
Razorblades	Electron Microscopy Sciences	72000
Ethanol	VWR	1.08543.0250
Acetone	VWR	20066.321
Formvar 0.5% 용액 in ethylene	dichloride Electron Microscopy Sciences	15820
12 mm coverslips	VWR	631-0666
도립 현미경	Carl Zeiss	Axiovert 200
원자력 현미경	JPK Instruments	NanoWizard III
온도 제어 샘플 홀더	JPK Instruments	BioCell
실리콘 질화물 캔틸레버, 공칭 스프링 상수가 0.01 N/m인	Veeco Instruments	MLCT-AUHW
PBS	Gibco	14190-094
양면 접착 테이프	APLI AGIPA	118100
RPMI 1640	Gibco	31870-025
FCS	Sigma-Aldrich	F7524
헤페스	시그마 알드리치	H0887
35mm 유리 바닥 페트리 접시	WPI	FD35-100