개발 및 Murine Tolerogenic 수지상 세포의 기능적 특성

Summary

여기, 선물이 개발 및 특성 tolerogenic 수지상 세포 (TolDCs) 하 고 그들의 immunotherapeutic 유틸리티를 평가 하는 프로토콜.

Abstract

면역 체계는 외국 항 원에 대 한 조정 응답 사이 단단한 균형을 유지 하 여 운영 하 고 공생 생물에서 파생 된 항 원 뿐 아니라 자기 항 원에 대 한 응답 상태를 유지 하. 이 면역 항상성 장애 만성 염증 및 면역의 개발에 발생할 수 있습니다. 모 수석 세포 (DCs) 외국 항 원에 대 한 면역 반응 시작 naïve T 세포 활성화에 관련 된 타고 난 면역 계통의 전문 항 원 제시 세포 이다. 그러나, Dc T 세포 허용을 추진 하 고 유지 하 고 어느 면역 또는 만성 염증의 발전에 기여 하는 효과 기 세포를 억제 하는 TolDCs에 또한 분화 될 수 있습니다. TolDCs의 우리의 이해에 있는 최근 전진 그들의 분화 상태를 변조 하 여 DC 허용 오차를 얻을 수 있습니다 나왔다. 이 현상을 면역 관용에 휴식을 인해 발생 하는 수많은 면역 장애에 대 한 TolDC 요법 개발에 엄청난 성장을 주도하 고 있다. 전 임상 면역 murine 모델에서 성공적인 연구 자가 면역 질환의 치료에 TolDCs의 immunotherapeutic 유틸리티 유효성 검사 추가 있다. 오늘, TolDCs는 보호 면역을 그대로 하면서 병원 성 면역 응답을 대상으로 다양 한 면역 질환에서 면역 관용을 복원에 대 한 클리닉에서 유망한 immunotherapeutic 도구 되고있다. 전략의 배열을 TolDCs를 유도 하기 위해 여러 연구소에 의해 제안 되었습니다, 이러한 세포의 세포 고 기능 형 특성화에 없음 일관성. 이 프로토콜은 골 파생 Dc 큰 숫자, 합성 triterpenoid 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic와 TolDCs로 그들을 차별화 하는 데 사용 되는 독특한 방법의 개발에 대 한 단계별 가이드를 제공 합니다. 산 성-difluoro-틸-아 미드 (CDDO-DFPA), 그리고 TolDCs의 필수 분자 서명의 분석을 포함 하 여 그들의 표현 형을 확인 하는 데 사용 하는 기술. 마지막으로, 우리는 그들의 면역 반응에서 생체 외에서 그리고 vivo에서 다 발성 경화 증의 전 임상 모델에서 테스트 하 여 TolDC 기능을 평가 하는 방법을 보여줍니다.

Introduction

모 수석 세포 (DCs)은 타고 난 면역 시스템의 필수적인 부분 및 처음 발견 되었고 기본 전문 항 원 제시 세포¹로 1973 년에 랄 프 Steinman와 Zanvil Cohn에 의해 특징. Dc 링크 타고 난 및 적응형 면역 시스템²2 차 림프 기관에 T 세포와 B 세포 중요 한 조직 적합성 복합물 (MHC) 통해 처리 항을 제시 하 여 면역 활성화에 중요 한 역할을 재생 표시 되었습니다. 포유류 면역 시스템에서 Dc 골수성 Dc 및 plasmacytoid Dc (Pdc)³설명의 적어도 두 종류 있습니다. 기존의 DCs (cDCs)는 CD11c 표현의 특징이 며 골 조상 세포 또는 말 초 혈액 monocytes 사용 미 숙 Dc (iDCs) 체 외 로 분화 될 수 있다로 알려져 골수성 Dc granulocyte 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF) 고 murine 또는 인간 종에서 각각⁴일 4.

'위험'을 활성화 신호, 병원 체 관련 된 분자 패턴 (PAMP) 또는 손상에 관련 된 분자 패턴 (습기), 다양 한 패턴 인식 수용 체 바인딩를 통해....

Protocol

모든 연구는 케이스 서쪽 예비 대학의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 절차에 따라 수행 했다.

1. 골 수 유래 수지상 세포 (BMDCs) 준비

1. 압력가 마로 소독을 통해 모든 수술 기구를 소독 하 고 클래스 II 생물 안전 캐비닛 적절된 한 안전 절차에에서 실험을 수행 합니다.
2. CO₂ 챔버를 사용 하 여 C57BL/6 쥐 나이의 8-10 주를 안락사. 해 보드에 마우스를 놓고 70% 에탄올으로 씻어. 경골 비 골 및 대 퇴 골 뼈 수술가 위를 사용 하 여 삭제할 및 70% 에탄올 10 cm 배양 접시에 그들을 배치.
3. 외과 블레이드와 집게를 사용 하 여 조직 멀리 해 부 10 cm의 뚜껑에 가능한 만큼 요리 문화와 tibias 및 화관 6 cm 문화 접시에 70% 에탄올을 분리.
4. 외과 블레이드를 사용 하 여 tibias 화관의 양쪽 끝을 잘라. 23 G 바늘 3 ml 주사기에 3 mL PBS를 사용 하 여 12 ml PBS를 포함 하는 원뿔 튜브에 뼈의 한쪽 끝에서 골 수의 내용을 플러시합니다. 뼈의 양 끝에 대 한 3 배가이 단계를 반복 합니다.
5. 5 분 x 300g에 세포 현 탁 액 원심
6. 상쾌한을....

Results

차별화와 BMDCs의 선택:

골 조상 세포는 7 일 (그림 1A)로 iDCs 분화 GM-CSF와 IL-4의 완전 한 RPMI 매체에 경작 했다. 하루에 1, 셀 크기에 작은 되었고 구형 형태를 보였다. 3 일에 신선한 매체의 교체 형태 클러스터 셀을 도움이 CD11c의 인구 증가 하기 전에 PBS로 세척⁺ 세포. 하루에 4, BMDCs 크기에서 확대 됐다 하 고 클러스터 형성을 시작. 준수 세포 또한 변환 하 고 길쭉한 모양으로 접시의 아래쪽에서 관찰 했다. 5 일에 BMDCs의 대형 크기의 클러스터 형성 된다. 6 일에 반 부착 및 부동 BMDCs의 많은 또한 관찰 되었다. BMDCs 제 7 일에 수확 되었고 cytometry murine Dc의 특정 마커로 .......

Discussion

이 문서 사용할 수 있습니다. reproducibly iDCs를 생성 하 고 이후에 TolDCs로 그들을 분화 하는 효율적인 프로토콜을 설명 하 고 우리가 제안 하는이 TolDC를 유도 하기 위해 새로운 분자 대상 에이전트의 용량 평가에 적용할 수 있습니다. 표현 형입니다. 이 보고서에 설명 된 대로 우리는 우리가 먼저 표면 ligands의 TolDC 표현에 의해 분석 cytometry qRT-PCR과 ELISA로 측정 된 DC cytokine 프로필의 평가 다음 순서를 따라. 마지막으로, TolDCs의 immunoregulatory 함수는 그들의 용량을 줄이기 위해 T 세포 확산에서 생체 외에서 그리고 vivo에서, MS의 전 임상 murine EAE 모델을 사용 하 여 면역을 억제 하기 위해 그들의 효능을 입증 함으로써 확인 되었다.

우리의 프로토콜 iDCs 생성 하 고 GM-CSF와 IL-4의 조합으로 murine 골 수 선구자에서 분화 했다. 다른 프로토콜.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CDDO-DFPA (RTA-408)	Reata Pharmaceuticals	in house synthesis	세포 배양
마우스 GM-CSF	Peprotech Inc.	315-03	BMDC 차별화
마우스 IL-4	(주)페프로텍	214-14	BMDC 분화
지질다당류(LPS)	Sigma Aldrich Inc.	L2880	세포 배양
&베타;-메르캅토에탄올	Sigma Aldrich Inc.	516732	세포 배양
백일해 독소 (PTX)	R& D 시스템	3097	EAE 유도
MOG (35– 55) 펩타이드	21세기 사내 생화학	합성	EAE 유도
Trypan blue	Gibco, Life Technologies	15250-061	세포 배양
RPMI-1640 플러스 L-글루타민	ThermoFisher Scientific	11875-093	세포 배양
비필수 아미노산 (100X)	ThermoFisher Scientific	11140050	세포 배양
HEPES	ThermoFisher Scientific	15630080	세포 배양
페니실린/스트렙토마이신	ThermoFisher Scientific	15140122	세포 배양
40 μ m 세포 스트레이너	Corning	352340	세포 분리
PE 결합 CD80	BD Biosciences	557227	유세포 분석
PE 결합 CD86	BD Biosciences	555665	유세포 분석
PE 결합 PD-L1	BioLegend	124307	유세포 분석
APC 결합 MHCII	Miltenyi Biotec Inc.	130-112-388	유세포 분석
APC-conjugated CD11c	BD Biosciences	340544	유세포 분석
동형과 일치하는 PE	Miltenyi Biotec Inc.	130-091-835	유세포 분석
Miltenyi Biotec Inc.	와 일치하는 동형을 확인하십시오	130-091-836	유세포 분석
CFSE	BioLegend	423801	T 세포 증식 분석
팬 수지상 세포 분리 키트	Miltenyi Biotec Inc.	130-100-875	T 세포 증식 분석
FcR 차단 시약	Miltenyi Biotec Inc.	130-100-875	T 세포 증식 분석
팬 수지상 세포 비오틴-항체 칵테일	Miltenyi Biotec Inc.	130-100-875	T 세포 증식 분석
Anti-Biotin MicroBeads	Miltenyi Biotec Inc.	130-100-875	T 세포 증식 분석
CD4+ T 세포 분리 키트	Miltenyi Biotec Inc.	130-104-454	T 세포 증식 분석
CD4 + T 세포 비오틴-항체 칵테일	Miltenyi Biotec Inc.	130-104-454	T 세포 증식 분석
Anti-Biotin MicroBeads	Miltenyi Biotec Inc.	130-104-454	T 세포 증식 분석
ACK 용해 버퍼	ThermoFisher Scientific	A1049201	BMDC 분화
1 ml 주사기	BD Biosciences	309626	T 세포 증식 분석
3 ml 주사기	BD Biosciences	309588	BMDC 분화
25G 바늘	BD Biosciences	309626	T 세포 증식 분석
23G 바늘	BD Biosciences	309588	BMDC 분화
BSA	Sigma Aldrich Inc.	A2058	T 세포 증식 분석
EDTA	ThermoFisher Scientific	15575020	T 세포 증식 분석
LS 컬럼	Miltenyi Biotec Inc.	130-042-401	T 세포 증식 분석
사전 분리 필터	Miltenyi Biotec Inc.	130-095-823	T 세포 증식 분석
콜라겐 분해 효소 D	시그마 Aldrich Inc.	11088858001	T 세포 증식 분석
HBSS	ThermoFisher Scientific	14025076	T 세포 증식 분석
오브알부민 (OVA) 펩타이드 323– 329	시그마 알드리치 Inc.	O1641	T 세포 증식 분석
마우스 IFN-&감마; TaqMan 프로브	ThermoFisher Scientific	Mm01168134_m1	qRT-PCR
마우스 IL-12a TaqMan 프로브	ThermoFisher Scientific	Mm00434165	qRT-PCR
마우스 IL-12 p70 DuoSet ELISA	R& D 시스템	DY419-05	ELISA
마우스 EDN-1 ELISA	RayBiotech	ELM-EDN1-1	ELISA
TNF-&알파; TaqMan 프로브	ThermoFisher Scientific	Mm00443258	qRT-PCR
마우스 TNF-&알파; Quantikine ELISA 키트	R& D 시스템	MTA00B	ELISA
IL-6 TaqMan 프로브	ThermoFisher Scientific	Mm00446190	qRT-PCR
마우스 IL-6 Quantikine ELISA Kit	R& D 시스템	M6000B	ELISA
IL-23a TaqMan 프로브	ThermoFisher Scientific	Mm01160011	qRT-PCR
마우스 IL-23 DuoSet ELISA	R& D 시스템	DY1887-05	ELISA
IL-4 TaqMan 프로브	ThermoFisher Scientific	Mm99999154_m1	qRT-PCR
IL-10 TaqMan 프로브	ThermoFisher Scientific	Mm01288386_m1	qRT-PCR
TGF-β TaqMan 프로브	ThermoFisher Scientific	Mm01178820_m1	qRT-PCR
Anti-Heme Oxygenase 1 항체	Abcam	ab13248	Western blotting
Anti-β-actin 항체	Abcam	ab8226	Western blotting
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad Inc.		qRT-PCR
BD FACS칼리버 세포 분석기	BD Biosciences		유세포 분석