Method Article

개발 및 Murine Tolerogenic 수지상 세포의 기능적 특성

DOI:

10.3791/57637

⸱

May 18th, 2018

 ,  , 
1Department of Biochemistry, School of Medicine, Case Western Reserve University, 2Department of Pediatrics, Division of Pediatric Hematology/Oncology, Case Western Reserve University, 3Angie Fowler Cancer Institute, Rainbow Babies & Children's Hospital, University Hospitals, Cleveland

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기, 선물이 개발 및 특성 tolerogenic 수지상 세포 (TolDCs) 하 고 그들의 immunotherapeutic 유틸리티를 평가 하는 프로토콜.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

면역 체계는 외국 항 원에 대 한 조정 응답 사이 단단한 균형을 유지 하 여 운영 하 고 공생 생물에서 파생 된 항 원 뿐 아니라 자기 항 원에 대 한 응답 상태를 유지 하. 이 면역 항상성 장애 만성 염증 및 면역의 개발에 발생할 수 있습니다. 모 수석 세포 (DCs) 외국 항 원에 대 한 면역 반응 시작 naïve T 세포 활성화에 관련 된 타고 난 면역 계통의 전문 항 원 제시 세포 이다. 그러나, Dc T 세포 허용을 추진 하 고 유지 하 고 어느 면역 또는 만성 염증의 발전에 기여 하는 효과 기 세포를 억제 하는 TolDCs에 또한 분화 될 수 있습니다. TolDCs의 우리의 이해에 있는 최근 전진 그들의 분화 상태를 변조 하 여 DC 허용 오차를 얻을 수 있습니다 나왔다. 이 현상을 면역 관용에 휴식을 인해 발생 하는 수많은 면역 장애에 대 한 TolDC 요법 개발에 엄청난 성장을 주도하 고 있다. 전 임상 면역 murine 모델에서 성공적인 연구 자가 면역 질환의 치료에 TolDCs의 immunotherapeutic 유틸리티 유효성 검사 추가 있다. 오늘, TolDCs는 보호 면역을 그대로 하면서 병원 성 면역 응답을 대상으로 다양 한 면역 질환에서 면역 관용을 복원에 대 한 클리닉에서 유망한 immunotherapeutic 도구 되고있다. 전략의 배열을 TolDCs를 유도 하기 위해 여러 연구소에 의해 제안 되었습니다, 이러한 세포의 세포 고 기능 형 특성화에 없음 일관성. 이 프로토콜은 골 파생 Dc 큰 숫자, 합성 triterpenoid 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic와 TolDCs로 그들을 차별화 하는 데 사용 되는 독특한 방법의 개발에 대 한 단계별 가이드를 제공 합니다. 산 성-difluoro-틸-아 미드 (CDDO-DFPA), 그리고 TolDCs의 필수 분자 서명의 분석을 포함 하 여 그들의 표현 형을 확인 하는 데 사용 하는 기술. 마지막으로, 우리는 그들의 면역 반응에서 생체 외에서 그리고 vivo에서 다 발성 경화 증의 전 임상 모델에서 테스트 하 여 TolDC 기능을 평가 하는 방법을 보여줍니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모 수석 세포 (DCs)은 타고 난 면역 시스템의 필수적인 부분 및 처음 발견 되었고 기본 전문 항 원 제시 세포1로 1973 년에 랄 프 Steinman와 Zanvil Cohn에 의해 특징. Dc 링크 타고 난 및 적응형 면역 시스템22 차 림프 기관에 T 세포와 B 세포 중요 한 조직 적합성 복합물 (MHC) 통해 처리 항을 제시 하 여 면역 활성화에 중요 한 역할을 재생 표시 되었습니다. 포유류 면역 시스템에서 Dc 골수성 Dc 및 plasmacytoid Dc (Pdc)3설명의 적어도 두 종류 있습니다. 기존의 DCs (cDCs)는 CD11c 표현의 특징이 며 골 조상 세포 또는 말 초 혈액 monocytes 사용 미 숙 Dc (iDCs) 체 외 로 분화 될 수 있다로 알려져 골수성 Dc granulocyte 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF) 고 murine 또는 인간 종에서 각각4일 4.

'위험'을 활성화 신호, 병원 체 관련 된 분자 패턴 (PAMP) 또는 손상에 관련 된 분자 패턴 (습기), 다양 한 패턴 인식 수용 체 바인딩를 통해 성숙한 Dc (mDCs)으로 면역성 Dc 향해 iDCs 성숙 드라이브 것 이다와 같은 DC 표면5. 면역성 Dc 더 프라임 naïve T 세포 확산 및 MHCII2, costimulatory ligands (CD80, CD86, CD40)6, cytokines, 및 다른 수용 성 중재자7의 upregulation 통해 감 별 법. 면역성 Dc에서 프로-염증 성 중재자 생산의 T 세포 중재 하는 cytokine 분화에 대 한 필수적입니다. 예를 들어 IFN-γ와 IL-12은 Th1 차별화8 및 일리노이-1, 필요 일리노이-6, 및 IL-23가 순진한 Th17 세포9으로 T 세포 양극 화 합니다. 성숙한 Dc 외국 항 원에 반응, 비록 자기 항 원에 의해 통제 DC 활성화 수 있습니다 허용 오차 제거 원인과 그 활성화 조직 파괴10 리드 autoreactive T 세포를 생성 하 여 자가 면역 질환의 개발 육성 .

최근 보고서 그들의 능력과 그들의 조직 microenvironment 내에서 다른 큐와 상호 작용 하는 다른 이펙터/억압 DC 하위 집합으로 구분 하 여 exemplified 하는 DC가 소성의 분명 한 증거 제공. 안티-염증 성 중재자, IL-1011, TGF-β12,13 호-1 등 tolerogenic Dc (TolDCs)를 유도 하 여 면역 억제에 중요 한 역할을 재생 표시 되었습니다. 이 TolDCs는 규정 하는 기능을 취득 하 고 T 세포 확산14억제. 또한, DCs에 의해 공동 자극의 부족 TolDCs에서 안티-염증 성 중재자의 생산 모두 규제 T 세포 (Tregs)의 감 응 작용을 하 고도 효과적으로 억제 하는 Th1과 Th17 차별화 및 확장15. 과거 2 년간, TolDCs의 치료 잠재력 보고 되었습니다 여러 수 사관. 이러한 연구에서 전 비보 의 자가 면역 질환16 의 다른 전 임상 모델에서 TolDCs 뿐만 아니라 ameliorated 병 적인 증상을 생성 하지만 환자17 면역 관용의 개발을 ,18. 흥미롭게도, 오늘 TolDCs 치료는 되었습니다 간주 대체 또는 대체 접근 방식으로 자가 면역 질환 등 여러 가지 임상 실험에 타입 1 당뇨병 mellitus19, 류 마티스 관절염20, 21, 다 발성 경화 증 (MS)22,,2324, 그리고 Crohn의 질병25.

다양 한 프로토콜을 TolDCs를 개발 하기 위해 고용 되어 있으며 여러 실험실 생성 및 TolDCs의 phenotypic 특성에 대 한 방법을 보고 있다. Reproducibly 조 혈 창시자에서 생체 외에서 TolDCs 생성 하 고 안정적으로는 tolerogenic 상태 vivo에서26,,2728,29에서 그들을 유지 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다. iDCs 다양 한 immunomodulatory 약리학 대리인 또는 항 염증 성 cytokines에 노출에 의해 TolDCs로 변환할 수 있습니다. 예를 들어 비타민 d 3는 IL-10 생산을 증강 하 고 Dc에서 IL-12 분 비를 억제 하 고 그로 인하여 그들의 면역 기능30높일 수 알려져 유명한 약리 에이전트. 또한, Dc lipopolysaccharides (LPS) 등 강력한 염증 성 자극에 노출 되 면 dexamethasone31, rapamycin32, 코르 티 코 스테로이드33 등 여러 가지 약리 에이전트 표시 되었습니다 유도 하는 CD40, CD80 그리고 CD86, MHCII34의 DC 표면 식 줄여 TolDC 표현 형. IL-10과 TGF-β는 DC 내성35 와 이러한 cytokines의 둘 다에 수 반하는 노출 유도를 대부분 공부 항 염증 성 cytokines Dc36에서 tolerogenic 표현 형을 유도 하기 위해 표시 되었습니다.

DC phenotypic 표식으로 있다 보다는 기능적 특성에 의해 정의 됩니다 tolerogenic 이후 큰 TolDCs의 세포 및 기능 특성에 대 한 일관 된 방법을 개발 해야 합니다. 또한, 엄격 하 고 일관 된 프로토콜을 설정 해야 합니다 일관 된 평가 및 tolerogenic DC 형의 특성에 대 한 만약 우리가 효과적으로 그리고 reproducibly에서 TolDC 표현 형을 유도 하기 위해 새로운 에이전트의 능력을 비교 하는 실험실입니다. 여기 우리가 제공 상세한 프로토콜 단계별 방법 iDCs 마우스의 조 혈 창시자에서 분리 하 고 이후 TolDCs로 iDCs를 변환 하는 그들의 능력에 대 한 평가에서 새로운 에이전트의 효능을 분석 하는 강력한를 제공 하 TolDCs의 기능 그리고 phenotypic 특성 모두 생체 외에서 그리고 vivo에서. 이 설명에는 그들의 표면 ligands, cytokine 단면도, 및 면역 기능에 생체 외에서TolDCs 하는 정교한 메서드가 포함 됩니다. 우리는 또한 MS, 실험적인 자기 면역 뇌 (EAE)의 전 임상 모델에서 이러한 TolDCs의 잠재적인 치료 응용 프로그램을 탐색 하는 방법의 예를 제공 합니다. 이 설립된 프로토콜 조사 TolDCs의 유도 홍보 하기 위해 새로운 에이전트의 용량을 평가 하는 데 도움이 됩니다 그리고 TolDC 치료 개발의 범위를 확대 하기 위해 노력을 촉진 한다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 연구는 케이스 서쪽 예비 대학의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 절차에 따라 수행 했다.

1. 골 수 유래 수지상 세포 (BMDCs) 준비

  1. 압력가 마로 소독을 통해 모든 수술 기구를 소독 하 고 클래스 II 생물 안전 캐비닛 적절된 한 안전 절차에에서 실험을 수행 합니다.
  2. CO2 챔버를 사용 하 여 C57BL/6 쥐 나이의 8-10 주를 안락사. 해 보드에 마우스를 놓고 70% 에탄올으로 씻어. 경골 비 골 및 대 퇴 골 뼈 수술가 위를 사용 하 여 삭제할 및 70% 에탄올 10 cm 배양 접시에 그들을 배치.
  3. 외과 블레이드와 집게를 사용 하 여 조직 멀리 해 부 10 cm의 뚜껑에 가능한 만큼 요리 문화와 tibias 및 화관 6 cm 문화 접시에 70% 에탄올을 분리.
  4. 외과 블레이드를 사용 하 여 tibias 화관의 양쪽 끝을 잘라. 23 G 바늘 3 ml 주사기에 3 mL PBS를 사용 하 여 12 ml PBS를 포함 하는 원뿔 튜브에 뼈의 한쪽 끝에서 골 수의 내용을 플러시합니다. 뼈의 양 끝에 대 한 3 배가이 단계를 반복 합니다.
  5. 5 분 x 300g에 세포 현 탁 액 원심
  6. 상쾌한을 제거 하 고 붉은 혈액 세포를 제거 하려면 5 분 동안 1 ml ACK lysing 버퍼 셀 펠 릿 resuspend.
  7. 9 ml PBS ACK lysing 버퍼 및 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기를 희석에 추가 합니다.
  8. 상쾌한을 제거 하 고 10 ml 문화 매체 (RPMI 1640 플러스 L-글루타민, 10 %FBS, 1% 비 필수 아미노산 (100 배), 10 mM HEPES, 50 nM β-mercaptoethanol, 및 5% 페니실린/스) resuspend.
    참고: 내 수준 FBS에 EU/ml 미만 0.1을 수 있다.
  9. 세포 현 탁 액 40 μ m 셀 스 트레이너를 통해 전달 하 고 세포 현 탁 액의 20 µ l를 취할 trypan cytometer를 사용 하 여 라이브 셀의 수를 계산 하는 파란색의 80 µ l 믹스.
  10. 1 x 106 셀/ml 15 ng/ml GM-CSF와 10 ng/ml IL-4에 셀 수를 조정 합니다.
  11. 6 잘 플레이트의 각 음에 1 x 106 셀/ml의 3 ml 접시 하 고 37 ° C, 5% CO2, 그리고 CO2 배양 기에서 95% 습도에서 세포를 품 어.
    참고: 주위에서 한 마우스 골 수 세포는 3-5 107 셀, 그것 수 있는 수 배치 됨을 나타내는 2에서 3 6 잘 플레이트에 배.
  12. 3 일에 각 음에 2 ml 신선한 PBS를 추가 각 우물에서 모든 3 ml 문화 매체를 제거 하 고 부드럽게 소용돌이 모든 비 부착 한 세포를 제거 수 있도록 접시.
  13. 3 ml 신선한 문화 매체를 15 ng/ml GM-CSF와 10 ng/ml IL-4에 각 잘 바꿉니다. 37 ° C, 5% CO2, 그리고 CO2 배양 기에서 95% 습도에서 세포를 품 어.
  14. 5 일에 직접 각 잘에서 15 ng/ml GM-CSF와 10 ng/ml IL-4 다른 3 ml 신선한 문화 매체를 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO2, 그리고 CO2 배양 기에서 95% 습도에서 세포를 품 어.
    참고: 각 잘에서 총 볼륨은 이제 6 ml.
  15. 7 일에 10 분 동안 얼음에 전체 접시를 넣어. 부드럽게 플라스틱에 서 스 펜 션에는 느슨하게 부착 BMDCs iDCs로 꺼내 려 각 잘 배양.
    참고: 부착 세포는 판에 아직도 붙어있다. 낮은 온도 부드럽게 절차 추가 실험에 영향을 미칠 DC 활성화를 방지 하는.
  16. 5 분 x 300g에 세포 현 탁 액을 원심 고 추가 실험에 대 한 신선한 문화 매체와 resuspend.
    참고: BMDCs cytometry 여 CD11c 항 체 형광 표시로 확인할 수 있습니다 그리고 우리는 그림 1에서 추가 실험에 대 한 BMDCs의 제어 전략을 보였다.

2. TolDC 유전자와 단백질 프로 파일 특징

  1. 37 ° C, 5% CO2 와 CO2 배양 기에서 95% 습도에서 1 h 잠복기에 대 한 100-400 nM CDDO DFPA의 유무에서 문화 매체와 1 x 106 BMDCs/ml 6 잘 플레이트에 잘 당 2 ml 접시.
    참고: CDDO-DFPA, 합성 triterpenoid-처럼-2 요소 (Nrf2) 유도 및 핵 요인-κB (NF κB) 억제제 핵 요소 (erythroid 파생 2) 이다. IDCs, IL-10, 비타민 D3, dexamethasone 베이 11-7085, 등에서 TolDCs의 유도 대 한 다른 에이전트를 적용 하 고 각 에이전트에 대 한 최적의 조건으로이 단계를 수정 합니다.
  2. 잠복기 4-24 시간 mDCs (부 화 시간은 다르다 때문에 mRNA 나 단백질 측정)를 유도 하는 것에 대 한 10 또는 100 ng/ml의 LPS 추가 합니다.
  3. 부드럽게 플라스틱 각 잘에서 배양 하 고 세포 현 탁 액 1 ml 피 펫을 사용 하 여 수확. 셀과 상쾌한, 각각 수집 하 5 분에 대 한 300 x g에서 원심.
  4. Cytometry 같은 물질로 ligands에 의해 셀 펠 릿에서 표면 ligands를 분석: CD40, CD80, CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL, 또는 억제 ligands: PD L1, L2 PD, ILT3, ILT4.
  5. 셀 펠 릿에서 RNA를 분리 하 고 RNA와 양적 실시간 PCR (qRT-PCR)와 ELISA, cytokine 프로필 및 유전자와 단백질 수준에 대 한 표면에 뜨는 샘플을 각각 분석.
    참고: 예를 들면, 선 동적인 cytokines: TNF-α, IFNγ, EDN-1, 일리노이-6, IL-12, 및 IL-23, 또는 항 염증 성 cytokines: IL-4, IL-10 일-15, TGF-β1, 및 호-1.

3. TolDCs의 기능 평가 생체 외에서 그리고 Vivo에서

  1. T-세포 Syngeneic 확산 분석 실험
    1. 압력가 마로 소독을 통해 모든 수술 기구를 소독 하 고 클래스 II 생물 안전 캐비닛 적절된 한 안전 절차에에서 실험을 수행 합니다.
    2. 0.5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 500 ml PBS 2 mM EDTA 사용 하 여 MAC 버퍼를 준비 합니다. 0.2 µ m 필터를 통해 필터링 하 여 버퍼를 소독.
      참고: 다음 실험 기간 동안 얼음에 버퍼를 유지.
    3. CD4를+ T 세포, CO2 챔버를 사용 하 여 나이의 8-10 주 OT II T 세포 수용 체 (TCR) 유전자 변형 마우스를 안락사. 해 보드에 마우스를 놓고 70% 에탄올으로 씻어. 복 부의 왼쪽에서 비장 수술가 위, 집게를 사용 하 여 격리 합니다.
    4. 6 cm 문화 접시에 2 ml PBS와 함께 비장을 넣고 3 ml 주사기의 푸시 스틱의 뒷면을 사용 하 여 40 μ m 셀 스 트레이너를 전달 하 여 비장을 말하다.
    5. 셀 펜션과 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기를 수집 합니다.
    6. 맥에서 버퍼의 400 μ에 셀 펠 릿을 resuspend.
    7. CD4의 100 μ 추가+ T 셀 비오 틴-항 체 칵테일 5 분 동안 4 ° C에서.
      참고: 항 체 칵테일 CD4 제외 하 고 다른 셀 형식에 바인딩+ T 세포, CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, 안티-MHC 종류 II, Ter-119, 그리고 TCRγ/δ.
    8. 10 분 4 ° C에서 맥 버퍼의 300 μ와 반대로 Biotin 구슬 (자료 테이블)의 200 μ를 추가 합니다.
    9. 강자성 분야 (자료 테이블)의 열으로 구성 하는 장소 및 사전 분리 필터는 자석에 함께 필드와 맥 버퍼의 3 ml와 함께 그것을 씻어.
    10. 셀에 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기 맥 버퍼의 9 ml를 추가 합니다.
    11. 3 ml 맥 버퍼의 셀 펠 릿 resuspend 고 열에 적용 합니다. 수집 흐름-통해 포함 CD4+ T 세포.
    12. 맥에서 버퍼의 또 다른 3 ml 열 세척 하 고 또한 흐름 통해 수집.
    13. 비장 팬 Dc를, 안락사 C57BL/6 쥐 나이의 8-10 주 공동2 챔버를 사용 하 여. 해 보드에 마우스를 놓고 70% 에탄올으로 씻어. 복 부의 왼쪽에서 비장 수술가 위, 집게를 사용 하 여 격리 합니다. 콜라 D 솔루션의 2 개 ml를 포함 하는 6 cm 문화 접시에 비장을 넣어 (2 mg/ml 콜라 D 칼슘, 마그네슘을 포함 하는 HBSS에 용 해).
    14. 두 번 1 ml 주사기와 25 G 바늘 비장에 콜라 D 솔루션의 1 ml를 주사. 작은 위 비장을 작은 조각으로 잘라.
    15. 동요 하 고 25 분 동안 실 온에서 품 어.
    16. 5 분 동안 실 온에서 0.5 M EDTA의 500 μ를 추가 합니다.
      참고: 3.1.13-3.1.14에서 단계는 Dc의 수율을 높이기 위한 중요 합니다.
    17. 이제 푸시 스틱 3 ml 주사기의 뒷면을 사용 하 여 40 μ m 셀 스 트레이너를 전달 하 여 비장 슬러리를 말하다 centrifuging 5 분에 대 한 300 x g에 의해 세포 현 탁 액을 수집 하.
    18. 맥 버퍼, FcR 차단 시 약의 50 μ와 10 분 동안 4 ° C에서의 팬 수지상 세포 Biotin 항 체 칵테일 100 μ의 350 μ에 셀 펠 릿을 resuspend.
      참고: 항 체 DCs에 의해 표현 되지 않는다 항 원에 대 한 칵테일.
    19. 5 분에 대 한 300 x g에서 맥 버퍼 및 원심 분리기의 9 ml를 추가 하 여 셀을 씻어.
    20. 맥 버퍼의 800 μ에 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 10 분 4 ° C에서 안티 Biotin 구슬의 200 μ를 추가 합니다.
    21. Dc를 수집 하는 3.1.9-3.1.11에서 단계를 반복 합니다.
    22. 씻어 맥 버퍼의 또 다른 3 ml와 함께 열 두 번을 통해 흐름 또한 수집 합니다.
    23. 2 x 105 Dc/ml 100-400 nM 37 ° C에서 1 시간 별도로, 라벨은 CD4+ CDDO-DFPA T 세포 (1 x 107/ml)의 유무에 15 분 동안 37 ° C에서 1 μ M CFSE와, PBS로 세척 2 x 106 T 셀/ml에서 최종 농도 얻으려면 볼륨을 조정 하 고.
    24. 다음으로 96 잘 접시에서 공동 CFSE 표시 된 CD4의 동일한 볼륨 처리 수지상 세포의 100 μ 문화+ T 세포, 1시 10분을 위의 단계에서 수집 된 둘 다 비율. 이제 보육의 2-3 일 후 잘 측정 CFSE 강도 cytometry에 의하여 T 세포의 당 100 ng/mL ovalbumin (OVA) 펩 티 드 323-329를 추가 합니다.
      참고: 셀 숫자와 비율 Dc와 T의 세포 우리의 이전 작품37에서 최적화 되었습니다.
  2. 수동 유도 BMDCs를 주입 하 여 EAE Myelin Oligodendrocyte 당단백질 (MOG) (35-55)와 펄스
    1. 1 시간 잠복기에 대 한 100-400 nM CDDO DFPA의 유무에서 문화 매체와 1 x 106 BMDCs/ml 6 잘 플레이트에 잘 당 2 ml 접시.
    2. 추가 10 ng/ml LPS의 잠복기 24 시간.
    3. 추가 100 μ g/ml 집 고 양이 (35-55)의 잠복기 4 시간.
    4. 셀 펜션과 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기를 수확.
    5. PBS와 셀 펠 릿 resuspend 및 셀.
    6. 피하 주사 200 μ 2 x 106 셀 8 10 주 오래 된 여성 C57BL/6 마우스 (100 μ 각 뒷 다리에).
    7. BMDC 주입 및 48의 날에 시간. 나중에, 200 주사 각 마우스에 백 일 해 독 소 (PTX)의 ng.
    8. 반복 단계 3.2.6-3.2.7 4 연속적인 주 동안 매주 한 번 합니다.
    9. 표준 기준37 (0.5-다리를 절 며 꼬리 끝, 1-다리를 절 며 꼬리, 2-보통 후방 사지 약점, 3 심각한 후방 사지 약점, 4 완전 한 뒷 다리 마비, 5 사지 또는 죽어가는 상태, 6-죽음)를 사용 하 여 매일 EAE의 임상 증상을 평가 합니다.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

차별화와 BMDCs의 선택:

골 조상 세포는 7 일 (그림 1A)로 iDCs 분화 GM-CSF와 IL-4의 완전 한 RPMI 매체에 경작 했다. 하루에 1, 셀 크기에 작은 되었고 구형 형태를 보였다. 3 일에 신선한 매체의 교체 형태 클러스터 셀을 도움이 CD11c의 인구 증가 하기 전에 PBS로 세척+ 세포. 하루에 4, BMDCs 크기에서 확대 됐다 하 고 클러스터 형성을 시작. 준수 세포 또한 변환 하 고 길쭉한 모양으로 접시의 아래쪽에서 관찰 했다. 5 일에 BMDCs의 대형 크기의 클러스터 형성 된다. 6 일에 반 부착 및 부동 BMDCs의 많은 또한 관찰 되었다. BMDCs 제 7 일에 수확 되었고 cytometry murine Dc의 특정 마커로 ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 문서 사용할 수 있습니다. reproducibly iDCs를 생성 하 고 이후에 TolDCs로 그들을 분화 하는 효율적인 프로토콜을 설명 하 고 우리가 제안 하는이 TolDC를 유도 하기 위해 새로운 분자 대상 에이전트의 용량 평가에 적용할 수 있습니다. 표현 형입니다. 이 보고서에 설명 된 대로 우리는 우리가 먼저 표면 ligands의 TolDC 표현에 의해 분석 cytometry qRT-PCR과 ELISA로 측정 된 DC cytokine 프로필의 평가 다음 순서를 따라. 마지막으로, TolDCs의 immunoregulatory 함수는 그들의 용량을 줄이기 위해 T 세포 확산에서 생체 외에서 그리고 vivo에서, MS의 전 임상 murine EAE 모델을 사용 하 여 면역을 억제 하기 위해 그들의 효능을 입증 함으로써 확인 되었다.

우리의 프로토콜 iDCs 생성 하 고 GM-CSF와 IL-4의 조합으로 murine 골 수 선구자에서 분화 했다. 다른 프로토콜...

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Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리가 제공 하는 CDDO-DFPA Reata 제약 감사. 우리는 또한 제인이 Seidman의 자 소아 암 혁신 (John Letterio)의 지원을 인정합니다. 이 작품은 국방부의 [W81XWH-12-1-0452];에 의해 지원 되었다 앤 지 파울러 사춘기와 젊은 성인 암 연구 이니셔티브 경우 종합 암 센터; 그리고 F.J. 칼라 재단에서 Hsi 주 웨이 대 한 칼라 대학원 학술 상.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CDDO-DFPA (RTA-408)Reata Pharmaceuticalsin house synthesis세포 배양
마우스 GM-CSFPeprotech Inc.315-03BMDC 차별화
마우스 IL-4(주)페프로텍214-14BMDC 분화
지질다당류(LPS)Sigma Aldrich Inc.L2880세포 배양
&베타;-메르캅토에탄올Sigma Aldrich Inc.516732세포 배양
백일해 독소 (PTX)R& D 시스템3097EAE 유도
MOG (35– 55) 펩타이드21세기 사내 생화학합성EAE 유도
Trypan blueGibco, Life Technologies15250-061세포 배양
RPMI-1640 플러스 L-글루타민ThermoFisher Scientific11875-093세포 배양
비필수 아미노산 (100X)ThermoFisher Scientific11140050세포 배양
HEPESThermoFisher Scientific15630080세포 배양
페니실린/스트렙토마이신ThermoFisher Scientific15140122세포 배양
40 μ m 세포 스트레이너Corning352340세포 분리
PE 결합 CD80BD Biosciences557227유세포 분석
PE 결합 CD86BD Biosciences555665유세포 분석
PE 결합 PD-L1BioLegend124307유세포 분석
APC 결합 MHCIIMiltenyi Biotec Inc.130-112-388유세포 분석
APC-conjugated CD11cBD Biosciences340544유세포 분석
동형과 일치하는 PEMiltenyi Biotec Inc.130-091-835유세포 분석
Miltenyi Biotec Inc.와 일치하는 동형을 확인하십시오130-091-836유세포 분석
CFSEBioLegend423801T 세포 증식 분석
팬 수지상 세포 분리 키트Miltenyi Biotec Inc.130-100-875T 세포 증식 분석
FcR 차단 시약Miltenyi Biotec Inc.130-100-875T 세포 증식 분석
팬 수지상 세포 비오틴-항체 칵테일Miltenyi Biotec Inc.130-100-875T 세포 증식 분석
Anti-Biotin MicroBeadsMiltenyi Biotec Inc.130-100-875T 세포 증식 분석
CD4+ T 세포 분리 키트Miltenyi Biotec Inc.130-104-454T 세포 증식 분석
CD4 + T 세포 비오틴-항체 칵테일Miltenyi Biotec Inc.130-104-454T 세포 증식 분석
Anti-Biotin MicroBeadsMiltenyi Biotec Inc.130-104-454T 세포 증식 분석
ACK 용해 버퍼ThermoFisher ScientificA1049201BMDC 분화
1 ml 주사기BD Biosciences309626T 세포 증식 분석
3 ml 주사기BD Biosciences309588BMDC 분화
25G 바늘BD Biosciences309626T 세포 증식 분석
23G 바늘BD Biosciences309588BMDC 분화
BSASigma Aldrich Inc.A2058T 세포 증식 분석
EDTAThermoFisher Scientific15575020T 세포 증식 분석
LS 컬럼Miltenyi Biotec Inc.130-042-401T 세포 증식 분석
사전 분리 필터Miltenyi Biotec Inc.130-095-823T 세포 증식 분석
콜라겐 분해 효소 D시그마 Aldrich Inc.11088858001T 세포 증식 분석
HBSSThermoFisher Scientific14025076T 세포 증식 분석
오브알부민 (OVA) 펩타이드 323– 329시그마 알드리치 Inc.O1641T 세포 증식 분석
마우스 IFN-&감마; TaqMan 프로브ThermoFisher ScientificMm01168134_m1qRT-PCR
마우스 IL-12a TaqMan 프로브ThermoFisher ScientificMm00434165qRT-PCR
마우스 IL-12 p70 DuoSet ELISAR& D 시스템DY419-05ELISA
마우스 EDN-1 ELISARayBiotechELM-EDN1-1ELISA
TNF-&알파; TaqMan 프로브ThermoFisher ScientificMm00443258qRT-PCR
마우스 TNF-&알파; Quantikine ELISA 키트R& D 시스템MTA00BELISA
IL-6 TaqMan 프로브ThermoFisher ScientificMm00446190qRT-PCR
마우스 IL-6 Quantikine ELISA KitR& D 시스템M6000BELISA
IL-23a TaqMan 프로브ThermoFisher ScientificMm01160011qRT-PCR
마우스 IL-23 DuoSet ELISAR& D 시스템DY1887-05ELISA
IL-4 TaqMan 프로브ThermoFisher ScientificMm99999154_m1qRT-PCR
IL-10 TaqMan 프로브ThermoFisher ScientificMm01288386_m1qRT-PCR
TGF-β TaqMan 프로브ThermoFisher ScientificMm01178820_m1qRT-PCR
Anti-Heme Oxygenase 1 항체Abcamab13248Western blotting
Anti-β-actin 항체Abcamab8226Western blotting
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection SystemBio-Rad Inc.qRT-PCR
BD FACS칼리버 세포 분석기BD Biosciences유세포 분석
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