Immunostimulatory 에이전트 평가: 림프 조직 추출 및 주입 경로-종속 수지상 세포 활성화

요약

Immunostimulating 접한의 치료 후 림프 조직의 림프 수지상 세포 활성화 테스트 후속 추출에 대 한 실험 절차를 설명 합니다.

초록

Immunotherapy 또는 예방 접종에 대 한 새로운 치료 대리인의 평가, 대 한 림프 조직에서 면역 세포 활성화의 분석은 필수적입니다. 여기, 우리는 마우스에서 다른 관리 경로에서 나노 입자 형태로 소설 지질-DNA immunostimulant의 면역 효과 조사: 구강, intranasal, 피하, 노상 강도, 복, 그리고 정 맥. 이러한 주사 직접 영향을 미치는 면역 반응, 그리고 수확 하는 림프 조직 하 고 조직에 수지상 세포 (DC) 활성화의 분석은 이러한 평가의 중요 한 부분. Mediastinal 림프 노드 (mLNs)의 추출은 크기와이 오르간의 위치 때문에 중요 하 그러나 매우 복잡 한. 사 타 구니 림프절 (iLN)만 대, 그리고 비장을 수확 cytometry에 의해 DC 활성화를 분석 하기 위한 단계적 절차를 설명 합니다.

서론

면역학 및 나노 의학, 약물 전달 및 immunostimulation를 포함 하 여 응용 프로그램에 대 한 잠재적인 새로운 치료 전략의 지도 있다. 관리 경로 최적화 immunostimulatory 요원의 효능에 영향을 미치는 중요 한 측면 이다. (INP)로 구성 된 DNA immunostimulatory 나노 자기 조립 microphase 별거에 의해 지질-DNA¹amphiphilic 구조 때문에 새로 개발된 된 나노 면역 보조 제 이다. 따라서, INP는 소재¹ vivo에서 다른 경로 통해와 같은 사 타 구니 림프절 (iLN), mediastinal LN (mLN), 그리고 비장, 적절 한 조직의 수확에 대 한 세 가지 절차의 관리와 관련 된 프로토콜 설명. 마지막으로,이 조직 면역 시스템에 가장 강력한 항 원 제시 세포 수지상 세포 (DC) 활성화를 위해 분석 되었다. 이 프로토콜은 또한 항 원, 항 체, 또는 다른 면역 adjuvants²평가 하는 데 적용할 수 있습니다.

그것은 위대한 약속 표시는 에이전트 때문에 INP 공식 테스트. INP는 수용 체 통행세 같이 9 (TLR9) immunostimulation의 어떤 평가 대 한 효능은 다른 주입 방법³을 테스트 하는 데 필요한 핵 산을 포함 하는 보조 자료. 이러한 맥락에서 Dc의 자극은 비보에 평가 대 한 강력한 끝점입니다. 항 원 또는 immunostimulatory 분자는 주변 조직이 나 혈액에 DCs에 의해 phagocytosed, 후이 세포 림프 기관 장과 LNs^4,5등을 마이그레이션합니다. 따라서, DC 활성화 비장, iLN, 및 주입 된 동물의 mLN에서 분석 했다. 제대로 수확이 조직의입니다 그러므로 또한 새로운 보조 또는 병원 체⁵에 면역 반응을 평가 하기 위한 중요 한. 이러한 조직 수확도 암 치료로 서 소설 면역학 방법론을 개발 하기 위해 중요 하다. 또한,이 프로토콜 안티 인간 면역 결핍 바이러스 치료제⁶같은 다른 약물의 효율성을 확인 하기 위해 사용할 수 있습니다.

프로토콜

동물 처리, 희생, 및 기관 격리를 포함 하 여 모든 실험 절차는 국제 동물 관리 및 사용 위원회 상하이 보건 임상 센터와 서울 아산 병원의 규칙에 따라 수행 했다. 연구 프로토콜 상하이 보건 임상 센터에서 동물 실험의 윤리에 해당 위원회에 의해 승인 되었다 (마우스 프로토콜 번호: SYXK-2010-0098) 아산 의료 센터 (2016-02-168).

1입니다. 자료의 준비

참고: 나노 보조, INP, 자기 조립된 지질-DNA 캐리어, 즉 U4T의 구성 및 CpG 모티브 포함 oligonucleotide, eCpG, 마우스^{2에서에서 immunotherapy, 예방접종에 대 한 적절 한 주입 경로 테스트를 현재 연구에서 고용 했다} . 중요 한 것은, 항 원, 항 체, 및 보조 에이전트와 같은 다른 잠재적인 치료 분자 INP 대체 하실 수 있습니다 하 고 아래 설명 된 동일한 방법론을 사용 하 여 테스트.

1. INP 정립^2,,47
   1. Anneal U4T (160 µ M, 캐리어) eCpG (80 µ M, TLR9 주 작동 근 시퀀스가 포함 된)와 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, pH 7.4)와 MgCl₂ (2 mM) x 1의 존재. 어 닐 링에 대 한 표준 볼륨 PCR 튜브에서 50와 110 µ L 사이입니다. 10 분 동안 95 ° C에 혼합물을가 열 하 고 천천히 thermocycler는을 사용 하 여 25 ° C를 (1 ° C/16 분)을 냉각. 어 닐 링 프로토콜 약 2 시간을 요구 한다.
      주의: U4T 포함 된 액체 매우 거품 이며 신중 하 게 처리 되어야 합니다.
   2. INP 준비; 50 µ L aliquots를 확인 각 주입에 대 한 자료의 50 µ L을 사용 합니다.
      참고: 경우 주입 당 100 µ L, 재료의 적절 한 계산 단계 1.1 반복 합니다.

2. 일반 동물 절차

참고: 쥐를 처리 하기 위한 대체 방법은 실험실 요구 사항 및 승인 된 동물 프로토콜⁸에 따라 사용할 수 있습니다. 사용 하는 마우스의 유형은 이다 6 주 된 C57BL/6과 여성 쥐.

1. 재료의 목록
   1. 액체 마 취 제 (isoflurane), 마 취 기계, 이산화탄소 (CO₂) 흡입 챔버, 멸 균된 거 즈, 집게, 마우스 restrainer, 장갑, 갈고리 집게, 1 인치 해가 위, 2-인치 해가 위, 알코올에 대 한 준비 살 균, 그리고 인슐린 주사기입니다.
2. 흡입 마 취
   참고: 마 취는 intranasal, 피하, 노상 강도, 그리고 쥐⁹정 맥 주사에 대 한 필수. 기화 기 기계와 산소 탱크 연결 유도 챔버를이 절차에 사용 됩니다.
   1. 유도 챔버에서 동물을 놓고 단단히 뚜껑을 닫아야 합니다.
   2. 1 L/min에 산소 흐름을 isoflurane에 대 한 4%의 유도 단계로 기화 설정을 설정 합니다.
   3. 동물 동물 무게;에 따라 챔버에의 노출 시간을 다 그러나, 이상의 10의 노출 및 5 분 마다 모니터링은 마 취¹⁰필요.
      참고: 없음 페달 반사 성공적인 마 취를 나타냅니다.
   4. Isoflurane 인덕터를 끄고 직원 노출 isoflurane 가스를 방지 하기 위해 산소 1 L/min 흐름.
3. 희생
   1. CO₂ 흡입 희생 "지침에 대 한 안락사의 설치류를 사용 하 여 이산화탄소" NIH에 따라 챔버 준비¹¹.
4. 동물 희생 완전히 확인 테스트 개 그 응답.
   1. 마우스의 발 끝을 곤란 하 고 개 그 응답을 확인 하 여 희생 제대로 확인 하십시오. 응답 경우 2.2 단계를 반복 합니다.
5. 소독
   1. 주사 또는 알코올 스프레이와 멸 균된 거 즈 해 사용 하는 모든 표면 영역을 치료.
6. 장기 저장
   1. 집게를 사용 하 여 모든 지방 및 수확된 장기 주변 혈액 제거 하. 3 mL의 PBS로 가득 페 트리 접시에이 수확된 조직을 개별적으로 저장 합니다. 컨테이너와 미디어는 후속 절차 요구 사항에 따라 달라질 수 있습니다.

3. 사출 노선

1. 6 주입 방법을 사용 하 여 주입-종속 면역 반응 조사: 구강, intranasal, 피하, 노상 강도, 복, 그리고 정 맥^8,,1213.

4입니다. 절연의 림프절과 비장

참고: 사용 하 여 젊고 건강 한 마른 쥐 (6 주 이전)이 일반적으로 더 오래 된 쥐에 있는 림프절 주위를 구축 지방 하기 어렵기 때문에 제거 하 고 장기의 적절 한 시각화를 방지할 수 있습니다.

1. 미리 수확 단계
   참고:이 섹션 iLN, 장과 면역 자극을 분석 하기 위한 마우스에서 mLN의 수확 후 주입 설명 합니다. 2.3-2.5 희생에 대 한 단계를 참조 하십시오, 응답, 및 소독 방법 개 그.
   1. 수술 폼 보드를 마우스의 사지를 고정 하 고 70% 에탄올과 마우스의 복 부 측을 소독.
   2. 생식 기 지역 및 텐트 처럼 외부 피부 커버를 사용 하 여 연결 집게 위에 2 cm 위치를 선택 하십시오. 이 위치에는 대략 1 cm 컷을 확인 하 고가 위 (2 인치)는 피부를 더 절 개 상처 아래 슬라이드.
   3. 외피, 잘라 세로로 위 (2 인치)의 두 팔을 가진 외부 피부를 통해. 복 막으로 덮여 내부 장기를 노출 합니다.
   4. 피부의 바깥 레이어를 고정 합니다.
2. 사 타 구니 림프절 (iLN)의 절연
   1. 기울어진된 문자 'Y'으로 표시 되는 왼쪽된 다리를 내리고 혈관의 함께 다음 다리의 왼쪽에는 iLN을 찾습니다.
      참고: 피하 주입 된 쥐에 대 한 주입 위치의 같은 쪽에 iLN 선택 합니다.
   2. 덮여 지질 층을 벗 겨 엷은 노란색 iLN (콩 모양, 2 mm)를 수확 하 두 집게와 레이어를 발견. 후속 처리 및 조직의 저장 단계 2.6 참조.
3. 비장의 절연 ¹⁴
   1. 텐트 사용 하 여 복 막의 중심에서 한 손에 집게를 연결 및 사용 하 여 작은 얇은 복을 다른 손에 (1 인치)가 위.
   2. 파악 하는 창 고 마우스 복 부의 왼쪽된 상단에 부착 된 빨간 콩 같이 비장 (약 14 m m의 길이)를 찾으려고 그것을 뒤집어 왼손에 놓은 사용 집게.
   3. 부드럽게 구부려 진된 집게와 다른 장기를 분리 하는 동안 오른손에 집게의 또 다른 세트와 함께 비장에 밖으로 당겨. 따라 단계 2.6 비장 저장 하.
      참고: 관리는 필요한 때 수확 하는 비장, 그것 쉽게 손상 된 부드러운 기관으로.
4. Mediastinal 림프 노드 (mLN)의 절연
   참고:는 mLN는 갈비뼈 아래 약 1cm 있으며 심장과 폐 등 다른 장기에 의해 덮여 있다. 위치와 작은 크기 때문에 그것은 신중 하 게 집게와가 위 (1 인치)를 사용 하 여 주변 영역을 노출 하는 것이 중요.
   1. 막 고 갈비뼈에서 분리. 집게와 갈비뼈의 시체를 누른 다음 왼쪽 및 오른쪽 갈비뼈의가 (1 인치) 위로 잘라. 심 혼 및 폐를 노출 오른쪽에 마우스의 어깨 너머로 컷오프 갈비뼈를 고정 합니다.
      참고: 주의 하지 잘라 심장과 폐, 주위 혈관의 혈액 유출 어려운 매우 작은 반투명 mLN를 찾을 수로. 어떤 혈관 잘립니다 경우 부드럽게 거 즈와 지역에서 혈액을 흡수.
   2. 오른손에 갈고리 집게를 사용 하 여, 심 혼 및 폐는 오른쪽으로 부드럽게 백본 노출 될 때까지 플립. 왼손에 일반 집게의 쌍을 사용 하 여이 수확을 지원 하기 위해 오른손에 갈고리 집게와는 iLN을 제거.
   3. 폐를 백본 널리 노출 될 때까지 그들을 플립. MLN (반투명 콩 모양의 구조 크기에 약 2 m m)는 폐와 척추 사이 있습니다.
   4. 갈고리 집게는 mLN 주변 영역을 노출 하 고 조직을 추출 하는 다른 집게를 이용 한다.
      참고:는 mLN 수확을 하기 전에 집게로 조심 스럽게 제거 해야 합니다 수많은 다른 조직에 의해 둘러싸여 있습니다.
   5. 수확된 mLN 저장에 2.7 지침에 대 한 단계를 참조 하십시오.

5입니다. cytometry에 대 한 샘플의 준비

참고: 수확된 iLN 장과 mLN에서 Dc의 활성화, 시험을이 조직의 단일 셀 정지는 스테인드 DC 특정 마커, co-stimulatory 분자, 및 중요 한 조직 적합성 항 체 형광 활용 된 복잡 한 분자 cytometry 분석.

1. 단일 셀 정지의 준비: 비장
   1. 6 m m 문화 요리에 신선한 문화 매체 (CM)의 5 mL을 추가 하 고 얼음에 샘플을 놓습니다.
   2. 주변 혈액과 지방 조직을 제거 하 고 조직 문화 접시의 뚜껑에 배치.
   3. 조직의 작은 조각으로 잘라 (< 1 m m) 곡선가 위. 뒤에 회전 하는 PBS에 파편을 일시 중단 아래로 5 분 646 × g 에서 원심 분리기를 사용 하 여 및 제거는 상쾌한 조직.
   4. CM의 3 mL에 샘플을 다시 중단 하 고 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 콜라 4 20 분에 대 한 보충의 솔루션의 200 µ L 여 조각 소화.
   5. 부드럽게 흔들 및 1 h. 필터링 나일론 메쉬를 통해 소화 조직에 대 한 37 ° C에서 샘플을 품 어 (100 nm) 아래로 회전. PBS의 5 mL에 단일 셀을 세척 하 고는 상쾌한 원심 분리 하 여 제거.
   6. 다시 솔루션을 분리 하는 세포의 5 mL에 셀을 일시 중단 합니다. 수성 층으로 레이어 스택 형태로 명확한 세포 격리 솔루션의 5 mL의 또 다른 레이어를 다시 로드.
   7. 10 분 구하는 가벼운 밀도 분수 상쾌한 2012 × g 에서 셀 준비 원심 (< 1.077 g/cm³), 이후의 흐름 cytometry 분석을 위해.
   8. hemocytometer 셀의 개수를 계산 합니다.
2. 단일 셀 정지의 준비: 림프 노드
   1. 5.1.1-5.1.2를 단계를 따릅니다.
   2. 10 mL를 피펫으로 사용 하 여 3-4 회를 pipetting으로 세포를 일시 중단 하는 CM의 5 mL를 추가 합니다. 철저 하 게 중단 후 셀을 사용 하 여 살 균 나일론 메쉬 15 mL 원뿔 튜브에 컬렉션에 대 한 셀을 필터링.
   3. 4 ° C에서 7 분 646 ×g 에서 아래로 셀 회전 하 고는 상쾌한을 제거 합니다.
   4. 10 mL 피펫으로 더 pipetting으로 세포를 일시에 CM의 추가 5 mL를 추가 합니다.
   5. PBS로 세척 하 고 셀의 수를 계산 합니다.
3. 교류 cytometry 분석
   1. Aliquot 0.5-1 × 10⁶ 셀 정렬 (FACS) 튜브 각 형광 활성화 된 세포로.
   2. 5 분 동안 4 ° C에서 646 × g 에서 centrifuge 고는 상쾌한 발음.
   3. 다시 셀 펠 릿과 소용돌이 일시 중단 하려면 셀에 5 µ L 희석 각각의 형광 활용 된 항 체 준비를 추가 합니다.
      참고: 그것은 때문에 붙일 레이블된 항 체는 빛에 민감한 빛 노출 가능한 셀 펠 릿을 보호 하는 것이 중요. 항 체 마스터 믹스를 생성 하 고 항상 Fc 블록을 추가 합니다.
   4. FACS 버퍼 PBS, 열 비활성화 일반 FBS, 및 0.1% 나트륨 아 지 드의 1%의 100 µ L를 사용 하 여 준비 합니다.
   5. 30 분 린스 FACS의 2-4 mL와 함께 셀 버퍼링 및 4 ° c.에 7 분 동안 1700 rpm에서 샘플 원심 4 ° C에서 튜브에 샘플을 배치
   6. 다시 어둠에 FACS 버퍼의 500 µ L에서 세포를 일시 중단 합니다. Cytometry 셀 분석.

결과

INP 림프 조직 DC 활성화에 대 한 적절 한 주입 경로 평가 하려면 혈통으로 DC 인구는 ^-로 정의 된 CD11c⁺ , iLN, 장과 mLN에서 세포 및 co-stimulatory 분자의 식 수준 분석. INP 피하 (사우스 캐롤라이나) 및 정 맥 (i.v.) 주입의 치료 (그림 2B 와 2c) 장과 iLN Dc에 CD40, CD80 그리고 CD86 식에 상당한 증가 승진. 노상 강도 그리고 INP 또한 상당히 업 규제 CD40, CD80, 그리고 CD86 장과 iLN Dc에서의 식 수준 PBS 처리 제어 (그림 2B와 2c)에 비해의 복 (i.p.) 주입. 자극된 mLN Dc, intranasal (i.n....

토론

나노기술과 면역학에서 많은 진보 약물 전달 및 immunostimulation의 치료 연구를 통해 달성 되었습니다. 주입 방법의 주의 깊은 선택이 현재 연구의 초점 이었다 immunostimulation에 대 한 중요 한 것으로 알려져 있다.

다른 주입 경로 자연스럽 게 비-독성 및 생 분해성 DNA 기반 소재에 대 한, INP (immunostimulatory 나노), 최고의 결과 굴복 하는 어떤 경로 확인 평가 했다. 이 접근은 또한 항 체, 항 원, 또는 다른 adjuvants을 포함 하 여 다른 치료제를 제공 하기 위한 관련.

이러한 주사 면역 반응 분석, 림프 조직 (비장, iLN, 및 mLN)의 수확이 필요 합니다. 림프 조직의 고립이이 프로토콜의 가장 중요 한 측면 이며 자세히 하지 이전 설명 되어 있는 기술의 사용을 요구. 또한, 면역 세포를 더 분석을 위한 단일 세포 현 탁 액의 준비 잘 설명 되지 않았습니다. 이...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
<강>재료
인산염 완충액 식염	Corning	21-040-CVR	세척 기관
(PBS, pH 7.4)
이소플루란 용액	Aesica Queenborough Limited	26675-46-7	마취 과정
투베르쿨린 1mL 주사기 -	정림	N/A	주입
50 mL 원뿔형 튜브	S.P.L	50050	마취 과정
1mL 인슐린 주사기	(BD Ultra-FineTM­II)_short 바늘	324826	근육 주사
DMEM 고포도당	Hyclone	SH30081.01	장기 저장
Histopaque	Sigma-Aldrich	10771	FACS 분석
에틸 알코올 무수 99.5 %	대중	4022-4110	소독제
<강력한>장비
FineCycler C100 (Thermocycler)	Ssufine-Anealing
Centrifuge			Centrifuge
FACS tube	FALCON	2052	FACS 분석
자동 고성능 유세포 분석기	BD(미국), FACSVerse-FACS		분석