인간의 면역 세포의 3 차원 시각화를 위한 빛 시트 현미경

Summary

여기, 선물이 빛 시트 현미경을 사용 하 여 3 차원 (3D) 콜라겐 매트릭스에 포함 된 면역 세포를 시각화 하는 프로토콜. 이 프로토콜은 또한 3d에서 셀 이동 추적 하는 방법 elaborates. 다른 유형의 3D 매트릭스에 현 탁 액 셀이이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

Abstract

Vivo에서, 활성화, 확산, 그리고 모든 면역 세포의 기능 림프절 이나 조직에 예를 들어 3 차원 (3D) 환경에서 발생합니다. 최신, 대부분 체 외에 시스템 셀 문화 또는 coverslips와 같은 2 차원 (2D) 표면에 의존합니다. 최적의 모방 생리 조건에 생체 외에서우리는 간단한 3D 콜라겐 매트릭스를 활용합니다. 콜라겐은 세포 외 기질 (ECM)의 주요 구성 요소 중 하나입니다 그리고 3D 매트릭스 구성에 널리 사용 되 고 있다. 3D 영상에 대 한 최근에 개발한 빛 시트 현미경 기술 (단일 평면 조명 현미경이 라고도 함)는 높은 수집 속도, 큰 침투 깊이, 낮은 표백 및 photocytotoxicity 기능입니다. 또한, 빛 시트 현미경 장기 측정을 위해 특히 유리 하다. 여기 우리는 최적화 된 프로토콜 설정 하 고 인간의 면역 세포, 예를 들어 기본 인간의 세포 독성 T 세포 (CTL)을 처리 하는 방법을 설명 하 고 라이브 셀 이미징에 대 한 빛-시트 현미경과 사용에 대 한 3D 콜라겐 매트릭스에 자연 킬러 (NK) 세포와 고정된 샘플입니다. 이미지 수집 및 세포 이동의 분석을 위한 절차 되 게 됩니다. 특히 초점 중요 한 단계 및 샘플 준비 및 데이터 분석에 대 한 요소를 강조 하기 위해 제공 됩니다. 이 프로토콜은 3D 콜라겐 매트릭스에 현 탁 액 셀의 다른 종류에 대 한 고용 수 있습니다 하 고 면역 세포에 국한 되지 않습니다.

Introduction

마이그레이션에 대 한 대부분 지식 세포에서 온다 2D는 일반적으로 유리 또는 플라스틱 표면 문화/이미징의 실시는^1,2,3, 실험 접시. 그러나, 생리 적인 시나리오 필요, 대부분의 경우, 3D microenvironment, 기질 (ECM) 결정적인 역할을 담당 합니다. ECM 뿐만 아니라 적절 한 세포 형태를 유지 하기 위해 3 차원 구조 에센셜을 제공 하지만 또한 생존 신호 또는 많은 셀^4,5 의 최적의 기능에 대 한 방향 신호를 제공 합니다. 따라서, 3D 환경이입니다 더 나은 휴대 전화 기능 및 생리 적 컨텍스트를 반영 하는 더 나은 환경에서 동작을 식별 하는 데 필요한.

인간의 신체에서 대부분 세포 면역 세포 특히 3D 시나리오에서 그들의 기능을 발휘 한다. 예를 들어 활성화 된 T 세포 순찰 조직 대상 셀에 대 한 검색, naïve T 세포 마이그레이션 기간 동안 마이그레이션 모드와 기계는 해당 하는 extracellular 적응 그들의 동족 항 원 제시 세포에 ....

Protocol

인간의 재료 (인간의 혈액 기증자 로부터 백혈구 감소 시스템 실)와 함께이 연구를 위해 실시 하는 연구 승인 지역 윤리 위원회 (16.4.2015 (84/15;에서 선언 교수 박사 Rettig Stürmer))와 해당 지침을 따릅니다.

1. 중화 콜라겐 솔루션의 준비 (500 µ L)

1. 셀 문화 후드 무 균 1.5 mL 튜브에 냉장된 콜라겐 재고 솔루션 (10.4 mg/mL)의 400 µ L를 전송. 천천히의 50 µ L 냉장 10 x PBS (pH 7.0-7.3) 냉장된 콜라겐 재고 솔루션의 400 µ L 추가 합니다. 부드럽게 튜브를 타일링 하 여 솔루션을 믹스.
   참고: 1 부의 모든 단계는 셀 문화 후드 행해져야 한다.
2. 1.1에서 콜라겐 솔루션의 500 µ L로 0.1 M NaOH의 8 µ L를 추가 합니다. pH 7.2-7.6를 조정 하려면 PH 시험 지구를 사용 하 여 (pH 범위: 6-10) 혼합물의 pH 값을 확인 하.
   참고: 볼륨 콜라겐의 다른 일괄 처리에 대 한 달라질 수 있습니다. NaOH 솔루션을 공기 방울을 피하기 위해 천천히 혼합 될 수 있다. 혼합물을 콜라겐 겔 화를 피하기 위해 얼음에 보관 한다.
3. 추가 2 µ L 살 균 ddH₂O 50....

Results

T 세포 마이그레이션 중 돌출 형성 걸 의존 하는 매우 역동적인 프로세스입니다. 기본 인간 CTL의 돌출 형성을 시각화 하려면 우리는 뚜렷이¹¹전에 설명한 대로 CTL에 말라 골격을 mEGFP 융합 단백질 페. Transfection, 후에 1 일 셀 콜라겐 매트릭스에 포함 했다. 이미지 스택 인수 했다 모든 40 단계-빛-시트 현미경을 사용 하 여 37 ° C에서 1 µ m의 크기와 함께 s. 같이 그림 2A 에 보충 영화 1, 마이그레이션 중 인간의 CTL 양식 주요 돌출 레몬 모양 좋은 스핀 들 모양의 구조에 의해 드리워진. 실험 같이, 뿐만 아니라 하나의 단일 셀은 몇 군데 있지만 큰 볼륨 (538 µ m³x 450 x 450)에서 (그림 2B). 따라서, 광학 품질.......

Discussion

대부분 체 외에서 분석 vivo에서 세포, 면역 세포 특히 주로 3D microenvironment을 경험 하는 반면 2D 표면, 세포 배양 배지, 페 트리 접시 또는 coverslips, 예를에 밖으로 수행 됩니다. 증거를 신흥 면역 세포의 이동 패턴 2D 및 3D 시나리오¹⁷사이 다 보여줍니다. 또한, 종양 세포의 식을 프로필은 2D 및 3D 교양 조직^18,,1920에서 다른도. 따라서, 최고의 시뮬레이션 시험관에생리 적 조건, 예를 들면 3D 콜라겐 매트릭스에서에서 3D 맥락에서 실험을 수행 하는 큰 장점은의입니다. 새로 개발된 된 접근, 특히 빛 시트 형광 현미경 검사 법, 제어 환경 조건 하에서 3 차원 매트릭스 시스템에서 안정적이 고 재현 실험을 수 있습니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibricol, bovine collagen solution	Advanced Biomatrix	#5133-20ML	콜라겐 매트릭스
0.5 M NaOH 용액	Merck	1091381000	for neutralizing Fibricol solution
Ultra-Low melting agarose	Affymetrix	32821-10GM	저농도 c[Col]
Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit	Thermo Fisher	11348D	PBMC에서 일차 인간 CD8+ T 세포 분리
T 세포 증식 및 활성화를 위한 Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	Thermo Fisher	11132D	CTL 집단의 활성화
인간 재조합 인터루킨-2	Thermo Fisher	PHC0023	배양 CTL
P3 1차 용액 키트	Lonza	V4XP-30XX	Transfection
α-PFN1 항체, 토끼, IgG	Abcam	ab124904	IF
Alexa Fluor 633 Phalloidin	Thermo Fisher	A22284	IF
CellMask 주황색 플라즈마 멤브레인 염색	Thermo Fisher	C10045	형광 세포 라벨
Tween 20	Sigma	P1379-250mL	IF
Triton X-100	Eurobio	018774	IF
DPBS Dulbecco의 phopsphate 완충 식염수	Thermo Fisher	14190250
IF 소 혈청 알부민	Sigma	A9418-100G	IF
Goat α 토끼 568, IgG, 토끼	Thermo Fisher	A-11011	IF
Lightsheet Z.1 (광시트 현미경)	Zeiss	N.A.
세포 배양 후드	Thermo Fisher	HeraSafe KS
세포 배양 인큐베이터 HERACell 150i	써모 피셔	N.A.
Centrifuge 5418 및 5452	Eppendorf	N.A.
피펫	Eppendorf	3123000039, 3123000020, 3123000063
피펫 팁	VWR	89079-444, 89079-436, 89079-452
15 mL 튜브	Sarstedt	62.554.002
모세혈관 50 &마이크로; L	VWR (브랜드)	613-3373	Zeiss LSFM 샘플 준비
캐필러리용 플런저	VWR (브랜드)	BRND701934	"테플론 팁이 있는 스탬프" LSFM 샘플 준비
MColorPhast pH 스팁	Merck	1095430001	중화된 Fibricol
BD Plastipak 1mL 주사기	BD	Z230723  ALDRICH	대체 시료 준비
모델링 점토 (Hasbro Play-Doh A5417EU7)	Play-Doh	N.A.
Imaris 파일 변환기	Bitplane	available at http://www.bitplane.com	이미징 파일을 Imaris 파일 형식으로 변환
Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage)	Bitplane	available at http://www.bitplane.com	3D 및 4D 이미징 데이터 분석