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방법 논문

인간의 면역 세포의 3 차원 시각화를 위한 빛 시트 현미경

7.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57651

⸱

2018년 6월 13일

 ,  ,  , 
1Department of Biophysics, Center for Integrative Physiology and Molecular Medicine (CIPMM), School of Medicine, Saarland University

이 논문에서

요약

여기, 선물이 빛 시트 현미경을 사용 하 여 3 차원 (3D) 콜라겐 매트릭스에 포함 된 면역 세포를 시각화 하는 프로토콜. 이 프로토콜은 또한 3d에서 셀 이동 추적 하는 방법 elaborates. 다른 유형의 3D 매트릭스에 현 탁 액 셀이이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

초록

Vivo에서, 활성화, 확산, 그리고 모든 면역 세포의 기능 림프절 이나 조직에 예를 들어 3 차원 (3D) 환경에서 발생합니다. 최신, 대부분 체 외에 시스템 셀 문화 또는 coverslips와 같은 2 차원 (2D) 표면에 의존합니다. 최적의 모방 생리 조건에 생체 외에서우리는 간단한 3D 콜라겐 매트릭스를 활용합니다. 콜라겐은 세포 외 기질 (ECM)의 주요 구성 요소 중 하나입니다 그리고 3D 매트릭스 구성에 널리 사용 되 고 있다. 3D 영상에 대 한 최근에 개발한 빛 시트 현미경 기술 (단일 평면 조명 현미경이 라고도 함)는 높은 수집 속도, 큰 침투 깊이, 낮은 표백 및 photocytotoxicity 기능입니다. 또한, 빛 시트 현미경 장기 측정을 위해 특히 유리 하다. 여기 우리는 최적화 된 프로토콜 설정 하 고 인간의 면역 세포, 예를 들어 기본 인간의 세포 독성 T 세포 (CTL)을 처리 하는 방법을 설명 하 고 라이브 셀 이미징에 대 한 빛-시트 현미경과 사용에 대 한 3D 콜라겐 매트릭스에 자연 킬러 (NK) 세포와 고정된 샘플입니다. 이미지 수집 및 세포 이동의 분석을 위한 절차 되 게 됩니다. 특히 초점 중요 한 단계 및 샘플 준비 및 데이터 분석에 대 한 요소를 강조 하기 위해 제공 됩니다. 이 프로토콜은 3D 콜라겐 매트릭스에 현 탁 액 셀의 다른 종류에 대 한 고용 수 있습니다 하 고 면역 세포에 국한 되지 않습니다.

서론

마이그레이션에 대 한 대부분 지식 세포에서 온다 2D는 일반적으로 유리 또는 플라스틱 표면 문화/이미징의 실시는1,2,3, 실험 접시. 그러나, 생리 적인 시나리오 필요, 대부분의 경우, 3D microenvironment, 기질 (ECM) 결정적인 역할을 담당 합니다. ECM 뿐만 아니라 적절 한 세포 형태를 유지 하기 위해 3 차원 구조 에센셜을 제공 하지만 또한 생존 신호 또는 많은 셀4,5 의 최적의 기능에 대 한 방향 신호를 제공 합니다. 따라서, 3D 환경이입니다 더 나은 휴대 전화 기능 및 생리 적 컨텍스트를 반영 하는 더 나은 환경에서 동작을 식별 하는 데 필요한.

인간의 신체에서 대부분 세포 면역 세포 특히 3D 시나리오에서 그들의 기능을 발휘 한다. 예를 들어 활성화 된 T 세포 순찰 조직 대상 셀에 대 한 검색, naïve T 세포 마이그레이션 기간 동안 마이그레이션 모드와 기계는 해당 하는 extracellular 적응 그들의 동족 항 원 제시 세포에 대 한 검색에서 림프절을 통해 환경3,,67. 3D 콜라겐 젤 잘 설립 하 고 잘 특징이 3D 셀 문화 시스템8,,910로 널리 사용 되었습니다. 우리의 이전 작품에서는 기본 인간의 세포 높은 모바일 0.25% 콜라겐 기반 매트릭스11약 4.8 µ m/min의 평균 속도에 마이그레이션할. 골격의 재배치는 셀 마이그레이션12에서 핵심 역할을 한다. 세포 이동의 단일 모드에만 적용 되지 않습니다 아직 위치, microenvironment, cytokines, 혈 그라디언트, 특정 마이그레이션 동작 간에 전환할 수 및 extracellular 신호는 조정 보여주는 증거를 축적 된 여러 가지 방법 3에 철새 행동입니다.

안정적으로 면역 세포 기능 및 동작을 예를 들어 마이그레이션, 돌출 형성 또는 기공을 교통 분석을 그것 큰 장점은 신속 하 고 안정적인 방식으로 상대적으로 대용량 3D 이미지를 취득할 수 있을 것입니다. 3D 영상에 대 한 최근에 개발한 빛 시트 현미경 기술 (단일 평면 조명 현미경이 라고도 함)는 만족 스러운 솔루션13,14을 제공 합니다. 이미지 수집, 동안 얇은 정적 빛 시트 샘플을 밝히는 생성 됩니다. 초점 비행기에 이렇게에서 넓은 지역 비행기에서 세포를 영향을 주지 않고 동시에 조명 될 수 있습니다. 이 기능에는 크게 감소 표백 및 photocytotoxicity 높은 수집 속도를 수 있습니다. 이 문서에서 우리 주 인간의 면역 세포 빛 시트 현미경을 사용 하 여 시각화 하는 방법 및 마이그레이션 3D 시나리오에서를 분석 하는 방법을 설명 합니다.

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프로토콜

인간의 재료 (인간의 혈액 기증자 로부터 백혈구 감소 시스템 실)와 함께이 연구를 위해 실시 하는 연구 승인 지역 윤리 위원회 (16.4.2015 (84/15;에서 선언 교수 박사 Rettig Stürmer))와 해당 지침을 따릅니다.

1. 중화 콜라겐 솔루션의 준비 (500 µ L)

  1. 셀 문화 후드 무 균 1.5 mL 튜브에 냉장된 콜라겐 재고 솔루션 (10.4 mg/mL)의 400 µ L를 전송. 천천히의 50 µ L 냉장 10 x PBS (pH 7.0-7.3) 냉장된 콜라겐 재고 솔루션의 400 µ L 추가 합니다. 부드럽게 튜브를 타일링 하 여 솔루션을 믹스.
    참고: 1 부의 모든 단계는 셀 문화 후드 행해져야 한다.
  2. 1.1에서 콜라겐 솔루션의 500 µ L로 0.1 M NaOH의 8 µ L를 추가 합니다. pH 7.2-7.6를 조정 하려면 PH 시험 지구를 사용 하 여 (pH 범위: 6-10) 혼합물의 pH 값을 확인 하.
    참고: 볼륨 콜라겐의 다른 일괄 처리에 대 한 달라질 수 있습니다. NaOH 솔루션을 공기 방울을 피하기 위해 천천히 혼합 될 수 있다. 혼합물을 콜라겐 겔 화를 피하기 위해 얼음에 보관 한다.
  3. 추가 2 µ L 살 균 ddH2O 500 µ L. 최종 볼륨을 잘 섞어 또는 및 저장이 콜라겐 솔루션 (8.32 mg/mL) 얼음에 4 ° C에서 사용까지.
    참고:이 조건 하에서 중화 콜라겐 사용할 수 있습니다 24 h. 위해 Aliquots 공기 방울을 피하기 위해 권장 하지 않습니다.

2. 샘플 준비 빛 시트 형광 현미경 검사 법 모 세관을 사용 하 여

  1. 앞에서 설명한 대로 붙일 원하는 기본 형광 염료15 또는 형광 단백질11 관심의 라이브 셀 라벨.
  2. 1 × 106 셀의 셀 문화 후드 무 균 1.5 mL 튜브에 전송 합니다. 원심 8 분 삭제에 대 한 200 x g에 튜브는 상쾌한 고 문화 매체의 200 µ L에 펠 릿을 resuspend.
    참고: 5 × 106 셀/mL의 셀 밀도 인간의 면역 세포 이동, 세포 독성 T 세포 (CTL)과 자연 킬러 (NK) 세포의 시각화에 대 한 것이 좋습니다.
  3. 1.3에서 중화 콜라겐 솔루션의 85.9 µ L를 추가 합니다. 에 세포 현 탁 액 2.2에서. 그리고 제대로 2.5 mg/mL의 콜라겐 농도 도달 하는 혼합. 후드에 얼음에 셀/콜라겐 혼합을 둡니다.
    참고: 콜라겐의 원하는 농도 N mg/mL 이면 가정의 볼륨 무력화 (200 µ L 세포 현 탁 액)에 대 한 콜라겐 솔루션 = 200 × N /(8.32-N)
  4. 다음, 모 세관에 넣고 일치 플런저 (내부 직경 ~ 1 mm) 플런저는 모 세관에서 1 m m까지. 문화 매체 (그림 1A)로 담거 서 플런저를 젖은.
    참고:이 단계는 모 세관 셀/콜라겐 혼합으로 감소 때 기포를 방지 하기 위해 도울 수 있었다. 모 세관 및 플런저 살 균 될 필요가 없습니다.
  5. 2.3에서 셀/콜라겐 혼합으로 모 세관을 찍어. 천천히 다시 10-20 m m (그림 1B)에 대 한 플런저를 당겨. 70% 에탄올 스프레이 나머지 콜라겐 솔루션 제거를 적신 종이 타월로 모 세관의 외부 벽을 닦으십시오.
  6. 5 mL 튜브의 내부 벽에 클레이 모델링 모 세관을 탑재 하 고 모 세관 (그림 1C)의 가장자리에 셀/콜라겐 혼합을 밀어.
  7. 5% CO2 콜라겐 합 1 h 37 ° C에서 모 세관을 유지.
  8. 5 mL 튜브를 배양 (약 1-2 mL)를 추가 합니다. 신중 하 게 약 3/4 매체 (그림 1D)에 걸려 콜라겐의 중간에 밖으로 생산 콜라겐 로드를 누릅니다.
  9. 모 세관,이, 같은 매체를 가진 교원 질 막대 equilibrate 또 다른 30 분 5% CO2 와 37 ° C에서 유지.
    참고: 나중에, 콜라겐 막대 수 수 철수 모 세관 그리고 경작에 더 사용 하기 전에 추가.

3. 이미지 수집 빛 시트 현미경을 사용 하 여

  1. 제조업체의 지침에 따라 샘플 챔버 어셈블리입니다.
  2. 보육 및 현미경 시료 챔버 (라이브 셀 이미징만)에 대 한 37 ° C에가 열을 켭니다.
  3. 시료 챔버에서 모 세관을 놓고 이미지 수집에 대 한 관심의 영역을 찾아 샘플을 찾습니다.
  4. 해당 laser(s)를 활성화 합니다. 다음 설정을 설정: 레이저 전원, 노출 시간, 단계-z-스택, 시작 위치와 끝 위치 z-스택, 그리고 라이브 셀 이미징에 대 한 시간 간격의 크기.
    참고: 예를 들어 그림 2 의 샘플은 몇 군데 모든 40 단계-1 µ m의 크기와 37 ℃에서 6 h s (총 두께: 538 µ m). 레이저 파워 노출 시간 30 양 x-y 방향에서 픽셀 크기의 1%는 0.23 µ m 이었다.
  5. 이미지 수집을 시작 합니다.

4. 자동 분석 추적

  1. 파일 변환기를 열고, 파일 추가 (*.ims) 소프트웨어 파일 형식으로 변환할 이미지 파일 선택을 클릭 합니다. 찾아보기 를 클릭 하 고 변환 된 파일을 저장할 폴더를 선택 합니다. 모든 시작을 클릭 합니다.
  2. 분석 소프트웨어를 엽니다. 클릭 능가합니다. 파일 에 가십시오 오픈, 클릭 다음 이미징 파일 분석을 선택 합니다.
    참고: 파일 크기가 큰 경우이 단계 시간을 걸릴 수 있습니다. 1 테라바이트 (TB) 보다 큰 파일 권장 하지 않습니다 하나의 실험에 대 한 프로세스와 같은 큰 파일은 매우 계산 용량 요구.
  3. 새로운 관광 명소를 추가클릭 합니다. 프로세스 전체 이미지 마지막으로상자를 확인 하십시오. 다음을 클릭 합니다.
  4. 입력 x 좌표와 y (픽셀)에 관심 영역을 정의 하. (시간 및 z 위치) 분석 프레임 수를 입력 합니다. 다음을 클릭 합니다.
  5. 소스 채널의 드롭다운 목록에서 추적할 개체를 포함 하는 대상 채널을 선택 합니다. 입력 예상 xy 직경 (µ m). 다음을 클릭 합니다.
    참고: 예상된 xy 직경 추적할 개체의 x-y 차원에서 평균 지름이입니다.
  6. 품질을 클릭 합니다. 있는 셀 (개체)의 대부분은 포함 되어야 하는 임계값을 설정 합니다. 다음을 클릭 합니다.
  7. 원하는 알고리즘 (회귀 모션 권장)을 선택 합니다. 입력 하는 최대 거리 (20 µ m 권장)와 최대 간격 크기 (3 또는 2 권장). 프로세스 전체 이미지를 마지막으로클릭 합니다.
    참고: 최대 거리 와 최대 간격 크기 트랙 휴식 두 임계값은. 좀 더 구체적으로, 두 개의 연속 프레임에서 동일한 개체 사이의 거리 최대 거리를 초과 하는 때 나중 프레임에이 개체 간주 됩니다 새 개체로. 가끔 중, 같은 개체 수 있습니다 몇 프레임 사라지고 다시 나타난다. 이 경우에, 최대 간격 크기 내에서이 개체가 다시 나타납니다 경우에 그것은 동일한 개체도 간주 될 것 이다.
  8. 필터 형식 을 클릭 하 고 원치 않는 트랙을 제외 하는 옵션을 선택 합니다.
    참고:이 단계는 선택 사항입니다.
  9. 다음 을 클릭 한 다음 마침을 클릭 합니다.
    참고:이 단계는 일 컴퓨팅 성능에 따라 시간을 걸릴 수 있습니다.
  10. 트랙 편집 을 클릭 하 고 올바른 드리프트를 선택 합니다. (변환 드리프트 권장) 적절 한 알고리즘을 선택 합니다. 원하는 결과 데이터 집합 크기 를 선택 합니다 (새 크기와 같은 현재 크기 권장). 확인을 클릭 합니다.
    참고:이 단계는만 콜라겐 이미지 중 떠내려 때 필요한.
  11. 통계 를 클릭 하 고 구성의 표시 통계 값 목록을선택 합니다. 관심의 옵션을 수출 (예: 좌표, 속도 및 등) 확인 하십시오. 확인을 클릭 합니다.
  12. 파일 내보내기 모든 통계 를 클릭 하 고 파일 이름을 입력 합니다.

5. 고정 및 면역 형광 콜라겐 매트릭스 셀의 얼룩

  1. 화학 후드 5 mL 튜브에 4 %paraformaldehyde (PFA, PBS)의 1000 µ L를 전송 합니다.
    참고: PFA 실내 온도 균형 해야 합니다.
  2. 2.9에서 생산 콜라겐과 모 세관을 찍어. PFA 솔루션으로 (대 한 ~ 5 m m) ( 그림 1C에서 같이) 클레이 모델링 5 mL 튜브의 내부 벽에는 모 세관을 탑재.
  3. PFA 솔루션 (그림 1D)에 매달려 콜라겐 로드의 절반 때까지 플런저를 살짝 누릅니다. 20 분 동안 실내 온도에 튜브를 유지.
  4. 다시 모 세관 안에 콜라겐 막대를 플런저를 당겨. 모 세관을 꺼내와 PFA 삭제.
  5. 신선한 관으로 모 세관을 탑재 하 고 PBS의 1 mL를 추가 합니다. 모 세관은 PBS에 몰입은 다는 것을 확인 하십시오.
  6. 교원 질 막대의 절반은 솔루션에 매달려 때까지 플런저를 살짝 누릅니다. 클레이 모델링 내부 벽에는 모 세관을 탑재 합니다.
  7. 5 분 동안 실내 온도에 튜브를 유지.
  8. 5.4를 반복 합니다. -또 다른 2 시간 동안 5.7입니다.
  9. 다시 모 세관 안에 콜라겐 막대를 플런저를 당겨. PBS를 삭제 합니다. 차단/permeabilization 버퍼 (PBS + 1 %BSA + 0.1% 비 이온 계면 활성 제)의 1-2 mL 튜브에 전송 하 고 5.6를 반복 합니다.
    참고: BSA (1%) 5% 보조 Ab에서 발생 하는 동물의 혈 청으로 교체할 수 있습니다.
  10. 30-60 분 동안 실내 온도에 튜브를 유지.
  11. 다시 모 세관 안에 콜라겐 막대를 플런저를 당겨. Permeabilization 버퍼를 삭제 합니다. 차단/permeabilization 버퍼에 1 차적인 항 체의 200-500 µ L를 전송 하 고 솔루션으로 막대를 퇴 학 시켜도.
  12. 1 시간에 대 한 실 온에서 튜브를 유지.
  13. 5.4에 설명 된 대로 3 번 PBST (PBS + 0.1-% 비 이온 계면 활성 제)와 함께 교원 질 막대를 씻어. -5.8입니다.
  14. 실 온에서 1 h에 대 한 차단/permeabilization 버퍼에 이차 항 체에 막대를 품 어. 빛에서 그것을 유지.
  15. 5.4에 설명 된 대로 콜라겐 로드 3 회 PBS로 세척. -5.8입니다.
  16. 다시 모 세관 안에 콜라겐 막대를 플런저를 당겨. PBS 영상까지 샘플을 하십시오.
  17. 3에 설명 된 대로 샘플을 검사 합니다.

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결과

T 세포 마이그레이션 중 돌출 형성 걸 의존 하는 매우 역동적인 프로세스입니다. 기본 인간 CTL의 돌출 형성을 시각화 하려면 우리는 뚜렷이11전에 설명한 대로 CTL에 말라 골격을 mEGFP 융합 단백질 페. Transfection, 후에 1 일 셀 콜라겐 매트릭스에 포함 했다. 이미지 스택 인수 했다 모든 40 단계-빛-시트 현미경을 사용 하 여 37 ° C에서 1 µ m의 크기와 함께 s. 같이 그림 2A 에 보충 영화 1, 마이그레이션 중 인간의 CTL 양식 주요 돌출 레몬 모양 좋은 스핀 들 모양의 구조에 의해 드리워진. 실험 같이, 뿐만 아니라 하나의 단일 셀은 몇 군데 있지만 큰 볼륨 (538 µ m3x 450 x 450)에서 (그림 2B). 따라서, 광학 품질...

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토론

대부분 체 외에서 분석 vivo에서 세포, 면역 세포 특히 주로 3D microenvironment을 경험 하는 반면 2D 표면, 세포 배양 배지, 페 트리 접시 또는 coverslips, 예를에 밖으로 수행 됩니다. 증거를 신흥 면역 세포의 이동 패턴 2D 및 3D 시나리오17사이 다 보여줍니다. 또한, 종양 세포의 식을 프로필은 2D 및 3D 교양 조직18,,1920에서 다른도. 따라서, 최고의 시뮬레이션 시험관에생리 적 조건, 예를 들면 3D 콜라겐 매트릭스에서에서 3D 맥락에서 실험을 수행 하는 큰 장점은의입니다. 새로 개발된 된 접근, 특히 빛 시트 형광 현미경 검사 법, 제어 환경 조건 하에서 3 차원 매트릭스 시스템에서 안정적이 고 재현 실험을 수 있습니다.

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공개 사항

저자는 금융 또는 상업적 충돌의 관심을 선언합니다.

감사의 글

우리 임상 Hemostaseology 연구소 및 수혈 의학 기증자 혈액;를 제공 하기 위한 감사 합니다. 카르멘 Hässig 및 우수한 기술 지원에 대 한 코 라 호자. 우리 LifeAct mEGFP 구조를 생성 하기 위한 수정된 pMAX 벡터에 대 한 옌스 Rettig (자를란트 대학), 롤랜드 Wedlich-용 병 (뮌스터 대학) 원래 LifeAct-루비 구문 및 기독교 고물 (자를란트 대학) 감사 합니다. 이 프로젝트는 Sonderforschungsbereich 1027 (B.Q. 프로젝트 A2)와 894 (수소 프로젝트 a 1)에 의해 투자 되었다. 빛-시트 현미경 DFG에 의해 투자 되었다 (GZ: INST 256/4 19-1 FUGG).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Fibricol, bovine collagen solutionAdvanced Biomatrix #5133-20ML콜라겐 매트릭스
0.5 M NaOH 용액Merck1091381000for neutralizing Fibricol solution
Ultra-Low melting agaroseAffymetrix32821-10GM저농도 c[Col]
Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells KitThermo Fisher11348DPBMC에서 일차 인간 CD8+ T 세포 분리
T 세포 증식 및 활성화를 위한 Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28Thermo Fisher11132DCTL 집단의 활성화
인간 재조합 인터루킨-2Thermo FisherPHC0023배양 CTL
P3 1차 용액 키트LonzaV4XP-30XXTransfection
α-PFN1 항체, 토끼, IgGAbcamab124904IF
Alexa Fluor 633 PhalloidinThermo FisherA22284IF
CellMask 주황색 플라즈마 멤브레인 염색Thermo FisherC10045형광 세포 라벨
Tween 20SigmaP1379-250mLIF
Triton X-100Eurobio018774IF
DPBS Dulbecco의 phopsphate 완충 식염수Thermo Fisher14190250
IF 소 혈청 알부민SigmaA9418-100GIF
Goat α 토끼 568, IgG, 토끼Thermo FisherA-11011IF
Lightsheet Z.1 (광시트 현미경)ZeissN.A.
세포 배양 후드Thermo FisherHeraSafe KS
세포 배양 인큐베이터 HERACell 150i 써모 피셔N.A.
Centrifuge 5418 및 5452EppendorfN.A.
피펫Eppendorf3123000039, 3123000020, 3123000063
피펫 팁VWR89079-444, 89079-436, 89079-452 
15 mL 튜브Sarstedt  62.554.002
모세혈관 50 &마이크로; LVWR (브랜드)613-3373Zeiss LSFM 샘플 준비
캐필러리용 플런저VWR (브랜드)BRND701934"테플론 팁이 있는 스탬프" LSFM 샘플 준비
MColorPhast pH 스팁Merck1095430001중화된 Fibricol
BD Plastipak 1mL 주사기BDZ230723  ALDRICH대체 시료 준비
모델링 점토 (Hasbro Play-Doh A5417EU7)Play-DohN.A.
Imaris 파일 변환기Bitplaneavailable at http://www.bitplane.com 이미징 파일을 Imaris 파일 형식으로 변환
Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage)Bitplaneavailable at http://www.bitplane.com 3D 및 4D 이미징 데이터 분석
체 (비트플레인)

참고문헌

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