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방법 논문

열 Nanoimprinting 기술과 인간의 내 피 식민지 형성 세포의 응답의 심사에 의해 그라데이션 Nanopattern의 제조

7.5K 조회수

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DOI:

10.3791/57661

⸱

2018년 7월 1일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기, 우리는 열 nanoimprinting 통해 그라데이션 nanopattern 판의 제조와는 nanostructures 인간의 내 피 조상 세포의 응답을 검사 하는 방법에 대 한 프로토콜을 제시. 설명 된 기술을 사용 하 여 물리적 자극에 의해 셀 동작을 조작할 수 있는 비 계를 생산 가능 하다.

초록

Nanotopography 다양 한 세포 외 매트릭스 (ECMs) 몸 주위에서 찾을 수 있습니다 그리고 세포 반응에 중요 한 규제 조치를 알려져 있습니다. 그러나,는 nanostructure의 크기와 적절 한 검사 도구의 부족으로 인하여 세포의 응답 사이의 관계를 결정 하기가 어렵습니다. 여기, 우리가 세포 응답의 조작에 대 한 재현 가능 하 고 비용 효율적인 그라데이션 nanopattern 번호판의 개발을 보여줍니다. 마스터 금형, 증가 직경 범위 [120-200 nm (GP 120/200), 200-280 nm (GP 200/280), 280-360 nm (GP 280/360)]의 nanopillars 그라데이션 nanopattern 접시로 양극 알루미늄 산화물 (AAO)을 사용 하 여 열 기술을 각 인에 의해 조작 했다. 이 그라데이션 nanopattern 번호판 nanotopography ECM에서의 다양 한 크기를 모방 하도록 설계 되었습니다 그리고 인간 내 피 식민지 형성 세포 (hECFCs)의 응답에 사용 되었다. 이 프로토콜에서 우리 세포 공학, 인간 주변 혈액에서 hECFCs를 재배 하 고 hECFCs nanopattern 접시에 배양의 기술에 대 한 그라데이션 nanopattern 번호판 조작의 단계별 절차를 설명 합니다.

서론

최근, 표면 지형의 물리적 자극에 의해 세포의 응답 세포 공학1,2,,34의 분야에서 각광 되어 있다. 따라서, 더 많은 관심은 셀 첨부 파일 표면5에서 3 차원 nanostructures에 집중 되었습니다. Integrin은 세포의 표면 인식 장치, 메카노 변환6ECM의 마이크로-나노 구조에 의해 구동 하는 물리적 자극 전송으로 보고 되었습니다. 이 기계적인 자극 연락처 안내7 셀 동작을 조절 하 고 초점 유착 및 강성8셀 모양을 변경 하려면 cytoskeletal 개편을 유도 한다.

본문에서 인간의 내 피 조상 세포 (hEPCs) 주변 ECM9의 microenvironment와 밀접 하 게 상호 작용합니다. 이 혈액 흐름10에서 파생 된 전단 응력으로 ECM의....

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프로토콜

이 연구는 고려 대학교 안 암 병원 (IRB No.에서 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다 ED170495)입니다. 모든 절차는 헬싱키 선언 및 나중의 개정에 따라 실행 되었다.

1. 알루미늄 (Al) 전해 연마에 의해 기판의 준비

주의: 연마 솔루션 부식성 이며 독성이 있습니다. 니트 릴 장갑, 고글 및 실험실 외 투를 포함 한 개인 보호 장비를 착용 하십시오. 증기 두건에서이 단계를 수행 합니다.

  1. 에틸 알코올 (C2H5오, 99.9%)을 혼합 하 여 연마 솔루션을 준비,과 염소 산 (HClO4, 60%)는 1 L 이중 자 켓 비이 커에 (C2H5OH:HClO4 = 4:1).
  2. 이중 자 켓 비 커는 circulator에 연결 하 고 7 ° c.에 온도 설정 자력 교 반기에는 이중 자 켓 비이 커를 넣어. 온도 7 ° c.에 떨어질 때까지 적어도 30 분 동안 교 반에서 솔루션을 두고
  3. 담가 초순 알 판 (99.999%, 20 × 50 × 1 m m3) 및 악어 클립 및 구리 ....

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결과


그림 1 에서는 그들의 형식 및 위치에 따라 조작된 그라데이션 AAO 금형의 SEM 이미지. 그림 2 는 일반 둥근 nanopillars와 그라데이션 nanopattern 플레이트의 SEM 이미지 이며 그림 3 nanopillar 직경의 정량화 데이터. 표 1 조작된 nanopillars의 특성을 나열합니다.

그림 4A 혈액 파생 된 hECFCs의 재배의 계획을 보여 줍니다. 그림 4B 쇼 thecultivated hECFCs의 위상.......

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토론

종종는 AAO의 제조 결함 균열, 모 공, 그리고 굽기의 불규칙 한 형태에서에서 겪고 있다. 이러한 결함에 대 한 주요 이유 알루 되 고 금속 기판의 자연과 전해질21의 저항력에 의해 강하게 영향을 전해 쇠 약을 이라고 합니다. 전해질의 저항력의 온도 따라 다르며, 전극에서 지속적으로 열 제거 이므로 이러한 높은 전압 아노다이징 조건에서 안정적으로 전해질의 locational 온도 유지 하기 위해 중요 한 포인트. 이 프로토콜에서 우리는 마스 다의 2 단계 양극22,23를 수정 하 여 AAO 금형 조작. 메 틸 알코올로 거의 절반 전해질을 대체 뿐만 아니라 전해질 낮은 온도에서 동결 하는 것을 방지 하지만 또한 아래쪽 공24의 증발에 의해 전극의 열을 빼앗아. 자력 교 반기 대신 오버 헤드 교 반기와 임 펠 러를 사용 하는 이유는 온도 제어.......

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 작품은 기본적인 과학 연구 프로그램을 통해 국가 연구 재단의 한국 (NRF)는 교육, 과학 및 기술 (MEST) [NRF-2015R1D1A1A01060397] 및 바이오 의료 기술 개발 자금에 의해 지원 되었다 과학기술부, 정보 통신 및 미래 계획 [NRF-2017M3A9C6029563]에 의해 투자 하는 NRF의 프로그램.

....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
과염소산 60%대정화학& 금속6512-4100
에틸 알코올, 절대 99.9 %대정 화학 & 금속4118-4100
인산 85%대정화학& 금속6532-4400
메틸알코올 99.5%대정화학& 금속5558-4400
Chromium(VI) oxideDaejung Chemicals & 금속2558-4400
황산 95%대정화학& 금속7781-4100
과산화수소 30%대정화학& 금속4104-4400
n-헥산 95%대정화학& 금속4081-4400
톨루엔 99.5%대정화학& 금속: 8541-4400
(heptadecafluoro-1,1,2,2, -tetrahydrodecyl) dimethylchlorosilaneGelestSIH5840.4수분 민감성
메톡시노나 플루오로 부탄 99 %Sigma aldrich464309
콜라겐 용액Stemcell# 4902
GelatinSigma aldrichG1890단백질 코팅 용액
Ficoll-PaqueGE Heathcare17-1440-03친수성 다당류 용액
EGM-2MVLonzaCC-3202내피 세포 확장 매체
페니실린-스트렙토마이신Gibco15140-122
인산염 완충 식염수Gibco10010031
소 태아 혈청Gibco12483-020
파라포름알데히드시그마 알드리치P6148
글루타르알데히드시그마 알드리치G5882-100ML
오스뮴 테트록사이드시그마 알드리치201030-1G
헥사메틸디실라잔시그마 알드리치440191
트리톤 X-100시그마 알드리치X100-100ML옥틸페놀 에톡실레이트 
염소 세럼Gibco26050-088
항인간 빈쿨린 1차 항체 Sigma aldrichV9131
F-actin 프로브분자 프로브A12379형광 결합 팔로이딘
Alexa Fluor 488 결합 안티-마우스  IgG 항체분자 프로브A11001형광 접합 2차 항체 
4',6-디아미디노-2-페닐린돌 Sigma aldrichD9542
장착 매체DAKOS3023
Anti-human vWF primary antibody DAKOA0082
반인간  CD144 1차 항체 BD 생명과학#555661
Eponate 12™ 임베딩 키트, BDMATed Pella18012에폭시 수지
우라닐 아세테이트, 25gTed Pella19481
납 구연산염, 삼수화물, 10gTed Pella19312
초순수 알루미늄 플레이트Goodfellow26050-088
폴리스티렌 시트GoodfellowST313120
8.0" 실리콘 웨이퍼Siltron 포함29-01024-03단면 광택, 725 &마이크로; m 두께
의 진공 데시케이터, 4.4 LKartellKA.230
진공 펌프진공 청소기V3. VOP100
전원 공급 장치UnicorntechUDP-3003
자기 교반기Daihan ScientificSL 벽지
오버 헤드 교반기Daihan scientificHT120DX
CirculatorDaihan scientificWCR-P12
선형 이동 단계ZaberA-LSQ300A-E01-KT07
앵글 브래킷, 90도ZaberAB90M선형 이동 단계 PMP
forcep의 액세서리, 145mmVitlab67995비금속 핀셋
PTFE 비커, 250mLCowieCW007.25
초음파 세척기BransonB2510MTH
PCB 절단기Hozan 도구 산업용K-110
나노 임프린트 장치NanonexNX-2000
산소 플라즈마 발생기Femto ScienceCUTE
저온 살균기LowtemCrystal 50
CO2 인큐베이터PanasonicMCO-18AC
Confoal 레이저 스캐닝 현미경Carl ZeissLSM700
주사 전자 현미경JEOLJSM6701
투과 전자 현미경HitachiH-7500
SMS03022

참고문헌

  1. Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nature materials. 13 (6), 558-569 (2014).
  2. Qian, W., Gong, L., Cui, X., Zhang, Z., Bajpai, A., Liu, C., Castillo, A., Teo, J. C., Chen, W.

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