방법 논문

 종속 키 1의 시험관에서 키에 의해 인 산화 특정 사이트 분석 결과

DOI:

10.3791/57674

⸱

2018년 5월 3일

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, State University of New York at Binghamton

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

 종속 키 1 (Cdk1) 세포 주기의 g 2 단계에서 활성화 되 고 많은 세포 경로 조절. 여기, Cdk1, Cdk1-특정 한 인 산화 위치의 식별이 중요 한 키의 셀룰러 목표 설정에 대 한 수와 함께 체 외에 니 분석 결과 대 한 프로토콜 선물이.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

 종속 키 1 (Cdk1)는 모든 진핵생물의 세포 주기 위한 마스터 컨트롤러와 프로테옴;의 약된 8-13% phosphorylates 그러나, Cdk1, 특히 인간의 세포에에서 대 한 확인된 대상 수 여전히 낮습니다. Cdk1-특정 한 인 산화 위치의 식별 중요 하다, 그들은 Cdk1 세포 주기를 제어 하는 방법에 대 한 기계적 통찰력을 제공. 세포 주기 규칙 충실 한 염색체 분리에 대 한 중요 하 고이 복잡 한 과정에 결함 염색체 착오 및 암으로 이어질.

여기, 우리가 시험관에서 키 분석 결과 Cdk1 관련 인 산화 위치를 식별 하는 데 사용 되는 설명 합니다. 이 분석 결과, 순화 된 단백질은 phosphorylated 생체 외에서 상용 인간 Cdk1/ B. 성공에 의해 인 산화 SDS 페이지에서 확인 및 인 산화 사이트 이후 질량 분석에 의해 식별 됩니다. 우리는 또한 정화 프로토콜 간의 상호 작용을 조사 확인 된 인 산화 위치의 기능 검증에 대 한 키 니 아 제 분석 실험 및 바인딩 분석 결과 대 한 적합 한 매우 순수 하 고 균질 단백질 준비 항복을 설명합니다 클래식 핵 지 방화 신호 (cNLS) 그리고 그것의 핵 수송 수용 체 karyopherin α. 실험 설계와 투입, 단백질 시퀀스에서 Cdk1 관련 인 산화 위치의 예측에 대 한 접근 방법을 검토 합니다. 함께 이러한 프로토콜 Cdk1 전용 인 산화 사이트를 생성 하 고 Cdk1 세포 주기를 제어 하는 방법으로 기계 론 적인 연구는 매우 강력한 접근 방식을 제공 합니다. 때문에이 메서드는 순화 된 단백질에 의존, 그것은 적용할 수 있습니다 어떤 모델 유기 체 및 수율 신뢰할 수 있는 결과에, 세포 기능 연구와 결합 하는 경우에 특히.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kinases는 기판에 ATP에서 인산 염 그룹을 전송 하 고 많은 세포질 과정을 조절 하는 효소. 이 인 산화 되돌릴 수, 빠르고, 두 부정적인 요금을 추가 및 저장 자유 에너지, 하 고 셀에서 사용 하는 가장 일반적인 posttranslational 수정 중 하나입니다. Cdk1, 일컬어 세포 주기 단백질 2 체 (cdc2)는 모든 진핵생물1,2,3,,45, 세포 주기 위해 마스터 컨트롤러가 고 phosphorylates는 프로테옴6,7의 예상된 8-13%.

최근 proteomic 연구는 단백질, 대부분의 경우에서에 많은 인 산화 사이트를 확인 하는 동안 키 이러한 수정에 대 한 책임을 알 수 있다. 인간 세포에서 특히 알려진된 Cdk1 목표의 수는 낮은7. Cdk1-특정 한 인 산화 위치의 식별 Cdk1 세포 주기를 제어 하는 방법을 설정 하는 기계 론 적인 연구를 하면 그것은 중요 하다. 세포 주기 규칙은 충실 한 염색체 분리 및 세포 분열에 대 한 중요 한 그리고 세포질 과정의 무수 한이 중요 한 생리 기능을 지원 하기 위해 발생 해야 합니다. 전사와 유사 분열, 세포의 구조와 핵, 염색체 응축, mitotic 스핀 들 어셈블리의 분해 등의 조직에 극적인 개편의 발병 이전 번역 중단 포함 됩니다. 규제 완화와 이러한 프로세스에서 오류가 발생할 암, 출생 결함, 또는 mitotic 세포 죽음. RO-3306 같은 Cdk1의 특정 억제제 개발된8, 기능성 연구를 위한 강력한 도구를 제공 하는 되었고 이러한 억제제 중 일부는 현재 암 치료에 대 한 임상 시험 (검토를 위해9 참조).

여기, 우리가 시험관에서 키 분석 결과 Cdk1 관련 인 산화 위치의 식별 수 있도록 설명 합니다. 이 분석 결과에서 상용 인간 Cdk1/ B는 순화 대상 단백질에서 생체 외에서phosphorylate 데 사용 됩니다. 기판의 인 산화의 질량을 증가 하 고 추가 두 음 전; 따라서, 성공적인 인 산화는 SDS 페이지에 단백질 젤 밴드의 상승 교대에 의해 확인 된다. 인 산화 Cdk1 특정 사이트 이후 체 외에 phosphorylated 단백질의 질량 분석 분석에 의해 식별 됩니다. 실험적인 디자인으로 돕기 위해 우리는 또한 계산 도구와 단백질 시퀀스에서 Cdk1 관련 인 산화 위치의 예측에 대 한 참조를 검토 합니다. 또한, 우리는 또한 매우 순수 하 고 균질 단백질 준비 니 분석 결과 대 한 적합 한 생성 하는 정화 프로토콜 설명 합니다. 마지막으로, 기능 연구에 의해 확인 된 인 산화 사이트를 확인 해야 합니다 그리고 여기에 설명 된 간단한 바인딩 분석 결과 그 목적을 위해. 결합, 이것은 매우 강력한 접근 Cdk1 세포 주기7,,1011를 제어 하는 방법으로 기계 론 적인 연구를 가능 하 게 Cdk1 관련 인 산화 사이트를 생성. 이 메서드는 순화 된 단백질에 의존, 이후 모든 모델 유기 체 및 수율 신뢰할 수 있는 결과에 적용할 수 있습니다. 그러나, 취득된 인 산화 사이트에는 생체 외에서 의 기능 확인은 권장, 셀 추가 규제 메커니즘 posttranslational 수정, 상호 파트너 또는 셀룰러 지역화 같은 장소에는 인 산화 사이트 액세스할 수 또는 Cdk1에 의해 인식에 대 한 액세스할 수 없게 렌더링 수 있습니다.

Cdk1 어디 X 어떤 잔류물 이며 떠들고 또는 트레오닌 인 산화의 사이트 (Ser/Thr-프로-X-리스/Arg), 구성 된 합의 인 산화 사이트를 인식 합니다. 특히 중요 한 인식에 대 한 + 1 위치에 프롤린의 존재가입니다. + 2 또는 3 위치에 기본적인 잔류물을 선호 하는 또한, 대부분 Cdk1 관련 인 산화 사이트는 + 3에서 리스 또는 Arg를 포함 위치6,12.

Cdk1의 활성화 긴밀 하 게 규제 하 고 유사 분열1,2,3,,45의 발병에 연결 됩니다.  종속 kinases의 활동 일반적으로 진동 세포 주기13전역 수준에서 표현 되는 뚜렷한 cyclins ( A, B, C, D, 그리고 E 인간에서), 그들의 연관에 따라 달라 집니다. Cdk1는 일정 한 세포 주기 고  A와 B5,13,,1415로  규제 소 단위와의 연결에 의존 하는 그것의 활동의 규제 뿐만 아니라 포스트 번역 상 수정. Cdk1/ B 복합체의 형성이 키 니 아 제 활성화5,14,15,,1617,18에 대 한 필요 합니다. G2 단계  B는 cytosol에서 번역 및 그것은 Cdk15,14,15,16,,1718; 바인딩 핵을 가져올 그러나, Cdk1/ B 인간 Cdk1 억제 kinases Myt1에 의해 Thr14와 Tyr15 잔류물에 인 산화 (멤브레인 관련 티로신, 트레오닌-특정 cdc2 억제 키)와 Wee1, 각각19, 사 개최 20,21. 늦은 G2 단계에서 세포 분열 주기 25 인산 가수분해 효소 (cdc25)에 의해 Thr14와 Tyr15의 dephosphorylation Cdk1/ B 복합의 키 니 아 제 활동을 활성화 하 고 유사 분열12,14, 의 개시를 유발 18 , 20 , 22 , 23. Thr161 인 산화는 Cdk1/ B 활성화에도 필요 하 고 Cdk7, Cdk 활성화 키 (케이크)18에 의해 중재입니다.  B anaphase에의 생긴다 Cdk1을, 유사 분열24,25에서 출구를 허용. Cdk1/ B의 활성화는 따라서 복잡 한 과정입니다. 여기에 제시 된 프로토콜 상용 Cdk1/ b 수행 곤충 세포에서이 복합물의 재조합 식 동안 활성화 된 vivo에서 생 kinases14,20 이며 순화 된 상태에서 활성 상태로 유지 합니다. 결과 활성화, 재조합 인간 Cdk1/ B는 생체 외에서 키 니 아 제 분석 실험에 적합 합니다.

여기, 우리는 인간의 centromere 단백질 F (CENP F)10Cdk1 관련 인 산화 위치의 식별에 대 한 프로토콜을 설명합니다. CENP-F는 대부분 interphase (g 1과 S 상)의 중 핵에 있는 g 2 단계26,27,28 , Cdk1 종속 방식으로10에 cytosol에 수출 하는 kinetochore 단백질 11. 핵 지역화26이 분 cNLS 의해 수 여. cNLSs 핵 전송 요소 karyopherin α karyopherin β 및 RanGDP, 핵29에 cNLS 화물의 수입 촉진에 의해 인식 됩니다. G2 단계에서 핵 수출10알 수 없는 수출 통로 통해 촉진 된다. CENP-F는 cytosol에 있는, 일단 핵을 모집 하 고 차례 차례로 모터 단백질 복잡 한 다30,31신병. 이 통로 mitotic 항목의 정확한 타이밍에 대 한 및 두뇌에 있는 근본적인 과정에 대 한 중요 한 다 종속 방식 mitotic 스핀 들 어셈블리의 초기 단계는 centrosome 각각 핵 위치 하는 것이 중요 하다 개발30,,3132. G 2 단계에서 시작 해 서, CENP-F 또한 조립 되는 kinetochore에 충실 한 염색체 분리27,28,,3334,35에 대 한 중요 한 역할을가지고 . 이 통로의 주요 규제 단계는 Cdk110,11에 따라 g 2 단계에서 CENP-F의 핵 수출 이다. 여기 CENP F. cNLS에 Cdk1-관련 인 산화 위치의 식별 프로토콜 설명 이 사이트의 Phosphomimetic 돌연변이 CENP-f, B Cdk1/ 직접 CENP-F의 그것의 cNLS10의 인 산화에 의해 세포 지역화 조절 제안 핵 가져오기 천천히.

전반적으로,이 생체 외에서 니 분석 결과 수 있습니다 특정 기판의 식별을 키 Cdk1 정화 대상 단백질 phosphorylated 생체 외에서 상용 Cdk1/ B 복합물 및 인 산화 사이트에 대 한 이후 질량 분석에 의해 식별 됩니다. Cdk1-특정 한 인 산화 위치의 식별 Cdk1 세포 주기를 제어 하는 방법을 계시 하는 기계 론 적인 연구를 지원 합니다.

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프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 단백질 시퀀스에서 Cdk1 관련 인 산화 위치의 예측

  1. 키 니 아 제 분석 실험을 시작 하기 전에 예측된 Cdk1 전용 인 산화 사이트에 대 한 단백질 시퀀스를 분석 하 고 알 수 없는 키도 실험적으로 설립된 인 산화 사이트에 대 한 문학을 검색 합니다. 사용 하 여 다음 도구, 데이터베이스, 및 요약 참조.
    1. IGPS 3.0 소프트웨어,3637 (http://gps.biocuckoo.org/online_full.php)를 사용 하 여 대상 단백질 시퀀스에서 Cdk1 관련 인 산화 사이트 예측. 여기 링크를 사용 하 여 이차 구조 및 표면 내게 필요한 옵션의 주석을 포함 하는 포괄적인 예측에 대 한.
    2. 소프트웨어, FASTA 형태로 단백질 시퀀스를 입력 합니다. 키 니 아 제 특이성에 대 한 떠들고/트레오닌 키 니 아 제, CMGC, CDK, CDC2, CDK1, 확인 하 고 다른 모든 특이성을 선택을 취소 합니다. 임계값으로 매체를 선택 하 고 전송 단추를 클릭 합니다.
    3. Cdk1 합의 인 산화 사이트 (Ser/Thr-프로-X-리스/Arg)와 결과 예측된 사이트를 비교 합니다.
    4. 중요 한 것은, phosphorylated 잔류물 (일부 Cdk1 기판 최소한의 사이트 (Ser/Thr-Pro)6,12에 phosphorylated는) 옆 프롤린에 대 한 예측된 사이트를 확인 하십시오. 또한, 선호 하는 + 2 또는 3 위치의 대부분 Cdk1 관련 인 산화 사이트 + 3 위치6,12에서 리스 또는 Arg를 포함 하는 기본적인 잔류물에 대 한 확인 합니다.
  2. 또한 확인 사이트 전체 합의 사이트의 존재로 인식에 대 한 접근은 Cdk1 인 산화에 대 한 충분 하지 않습니다.
    1. 표면 접근성 및 이차 구조 예측 주석 iGPS 출력 여부는 사이트 액세스할; 수 전망 이다 상태에서 검사 단백질의 N와 C 테르미니 많은 경우 유연 하 고 인 산화에 대 한 액세스할 수 있습니다.
    2. 대상 단백질의 x 선 구조를 사용할 수 있으면 구조에서의 위치를 검사 하 여 상 상속 인 산화 위치의 접근 가능성을 확인 합니다.
  3. 실험적 설립된 인 산화 사이트에 대 한 문학으로 알 수 없는 키 UniProtKB/스위스-보호 데이터베이스38 (http://www.uniprot.org)를 사용 하 여 검색 합니다.
    1. 단백질의 이름을 검색 상자에 입력 하 고 검색 버튼을 클릭 합니다. 올바른 시퀀스 항목을 선택 합니다. 인 산화 사이트 주석 하 고 아미노산 수정 섹션에서 참조 됩니다.
    2. Cdk1 세포 주기의 g 2 단계에서 활성화 됩니다 때문에 특히 유용 하다는 인간 세포 라인7,,3940, mitotic 추출의 proteomics 연구에 대 한 검색.
  4. 이 분 cNLS NLSmapper (옵션)로 식별 합니다.
    참고: 셔틀은 cytosol와 핵 단백질에 대 한 세포질 지 방화의 규칙에 대 한 일반적인 메커니즘 Cdk1에 의해 주요 모티브의-1 위치에이 분 cNLS의 인 산화는. 인 산화 핵 지역화 g 2 단계10,41,,4243곧.
    1. 이러한 왕복 단백질 단백질 시퀀스에서 cNLS NLSmapper43 (http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi)에 의해 식별 합니다. 텍스트로 단백질 시퀀스 순서 상자에 붙여 넣습니다, 그리고 5.0의 커트 오프 점수를 선택 하 고 전체 지역에 NLS에 대 한 검색 하기로. 예측 NLS 를 클릭 합니다.
    2. 이 분 cNLS, 이루어져 있는 작은 모티브 (리스-Arg), 적어도 10 잔류물의 링커 및 주요 모티브 (리스-리스/Arg-X-리스/Arg), 여기서 X는 부정 청구 되지 어떤 잔류물 든 지의 합의 시퀀스에 대 한 예측된 결과 cNLS 비교 .
    3. 만약 예측된 Cdk1 인 산화 사이트 (*)는 인접해 링커의-1 위치에 주요 주제를 확인: Ser/Thr*-Pro/X-X-Lys-Lys/Arg-X-Lys/Arg.
      참고:이 분 cNLS Cdk1에 의해-1 위치에의 인 산화는 여러 셔틀 단백질10,,4142, 에 대 한 셀룰러 지역화에 대 한 규제 메커니즘으로 설립 되었다 43.

2. 대장균 에서 재조합 단백질의 표현

  1. 단계 2.1.1-2.1.2에서 식 플라스 미드를 사용 하 여 대장균에서 재조합 형 단백질의 표정을 위해.
    1. 전체 길이 CENP F 구문에서 생성 삽입 연쇄 반응 (PCR)에 의해 DNA 파편을 증폭 시켜으로 만드는 인간 CENP-F (잔류물 2,987-3065) 식 구성, (은행 취득: U19769.1). 다음 프라이 머를 사용 하 여: AGTCGGGGATCCCAGCAATCTAAACAAGATTCCCG 및 AGTCGGCTCGAGTCATTATTCTGCAGGGTGAATACCACTCATG.
      주: 전체 길이 인간의 CENP F 플라스 미드 아낌없이 박사 X. Zhu, 생물 과학, 중국 과학원, 상하이, 중국에 대 한 기관에 의해 제공 되었다.
      1. BamHI 및 XhoI 금지 사이트와 pGEX6p1 벡터에 삽입을 복제할. 이 플라스 미드를 사용 하 여 CENP-F (잔류물 2,987-3065)의 N 맨끝 티 S-전이 효소 (GST) 융해 단백질을 표현 하.
        참고: GST-태그 수 수 떨어져 죽 습 PreScission 프로 테아 제 (이제부터 PS 효소 라고도 함)에 의해.
    2. 인간의 karyopherin α 식 구성에 대 한 전체 길이 karyopherin α2 cDNA 템플릿에서 PCR에 의하여 DNA 파편을 증폭 시켜 삽입을 생성 (시퀀스 취득 NM_002264.3; 뇌관: GCACTACATATGTCCACCAACGAGAATGCTAATA 및 TCACGCCTCGAGTTATCAAAAGTTAAAGGTCCCAGGAGCC)입니다.
      참고:는 isoforms의 유사성으로 인해이 karyopherin α2 구문 이라고를 후속 텍스트에서 karyopherin α.
      1. NdeI 및 XhoI 금지 사이트와 pET28a 대가로 벡터에 삽입을 복제할.
        참고:이 수정된 pET28a 벡터는 PS 효소 분열 사이트에 대 한 인코딩 시퀀스에 의해 대체 되었다 트 롬 빈 분열 사이트에 대 한 인코딩을 하는 시퀀스입니다. 이 플라스 미드를 사용 하 여 그의6의 N 맨끝으로 karyopherin α 융합 단백질을 표현-태그, 어디에 그의6-태그 수 있습니다 PS 효소에 의해 떨어져 죽 습 수.
  2. 포인트 대상 단백질의 돌연변이만들려면 키트 mutagenesis 사이트 감독을 수행 합니다.
  3. 이후 정화에 대 한 대장균 에서 재조합 단백질을 표현 한다.
    1. 다음 주식 확인: 50 mg/mL 대 (1:1, 000 재고 솔루션), 70% 에탄올 (1:1, 000), 100 mg/mL 암 피 실린 (1:1, 000), 그리고 1 M 이소프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG; 1:5, 000)에서 35 mg/mL 페니.
    2. 멸 균 필터 주식 및-20 ° c.에 저장 IPTG 반복된 freeze-thaw 주기를 하지 마십시오.
    3. 제조업체의 지침에 따라 대장균 로제타 2 (DE3) pLysS 긴장의 유능한 세포의 50 µ L로 식 플라스 미드의 1 µ L를 변환.
    4. 페니 (35 µ g/mL 파운드)와 한 천 Luria Bertani (파운드) 및 암 피 실린 (100 µ g/mL 파운드) CENP-F 구문, 또는 페니 karyopherin α 구문 대 (50 µ g/mL 문화)에 대 한 문화 접시 12-20 h 37 ° c.에 대 한 번호판을 품 어
    5. 단일 식민지를 선택 하 고 (단계 2.3.4 참조) 항생제로 보충 하는 파운드의 50 mL를 접종. 12-20 h 37 ° c.에 대 한 160-180 rpm에서 동요 하는 동안 preculture를 품 어
    6. 준비 1 L 파운드의 2800 ml에서 매체 Fernbach 플라스 크를 당황 하 게. 각 preculture 및 오토 클레이 브에 대 한 두 개의 플라스 크를 만들 그들. 통 기 통풍을 허용 하려면 플라스 플라스 크 볼륨의 2/3 이상 채우지 마십시오. 삼각 플라스 크도 사용할 수 있습니다.
    7. 항생제 (2.3.4 단계)와 살 균 필터 40% (w/v) 포도 당 솔루션의 LB 매체 1 L 당 preculture의 냉각된 파운드 추가 20 mL의 1 L 당 10 mL를 추가 합니다.
      참고: 600에서 흡 광도 1:10 희석 된 preculture의 0.15-0.2 사이 여야의 nm.
    8. 동안 37 ° c.에 160-180 rpm에서 떨고 있는 플라스 크를 품 어 600에서 흡 광도 측정 박테리아 문화를 정기적으로의 nm. 경우는 흡 광도 0.5-0.6, 0.2 m m IPTG을 추가 하 여 단백질 표정 유도 (파운드 매체의 1 L 당 1 M의 200 µ L).
      참고: 셀 올바른 흡 광도에서 유도 된다 중요 하다. 보통이 단계에 도달 하는 3-4 h 걸립니다.
    9. 37 ° c.에서 3 h 동안 흔들어 동안에 플라스 크를 품 어 원심 (15 분, 4100 x g, 4 ° C, 스윙 아웃으로 터)에 의해 세포를 수확. 폐기는 상쾌한. 20 mL GST 바인딩 버퍼 (CENP-F) 또는 그의6셀 펠 릿 resuspend-문화의 1 L 당 바인딩 버퍼 (karyopherin α). -80 ° c.에서 셀 저장
      1. GST 바인딩 버퍼 (10 mM Tris pH 8.0 25 ° c, 150 mM NaCl, 1 m m dithiothreitol (DTT), 0.5 m m EDTA) 준비와 그의6-버퍼 (10 mM Tris pH 8.0 25 ° c, 250 m NaCl, 5mm 이미 pH 8.0 m 5 m m β-mercaptoethanol (공학은))를 사전에 바인딩.

3. 티 친화성 크로마토그래피와 젤 여과 하 여 재조합 형 단백질의 정화

  1. 다음 주식 확인: 1 M DTT (1:1, 000 주식, 무 균 0.2 µ M 기 공 크기, 필터링 및 degassed); 250 m m phenylmethylsulfonyl 불 (PMSF; dimethylsulfoxide에서 1:1,000 재고) -20 ° c.에 게 반복적인된 동결-해 동 주기를 하지 마십시오.
  2. 다음 버퍼를 만들고 4 ° c 냉각
    1. 10 mM Tris pH 8.0을 사용 하 여 25 ° c, 150 m m NaCl, 1 mM DTT, 0.5 m m EDTA GST 바인딩 버퍼 를 준비 합니다.
    2. 50 mM Tris pH 8.0 25 ° c, 150 m m NaCl, 1 mM DTT의 버퍼에 녹아 10 m m 감소 티 (0.15 g/50 mL)을 사용 하 여 GST 차입 버퍼 를 준비 합니다. 마지막 버퍼의 pH 8.0은 확인 하 고 사용 되었다 같은 날에.
    3. 25 ° c, 60 m m NaCl, 2mm DTT 20 mM Tris pH 7.5를 사용 하 여 젤 여과 버퍼 를 준비 합니다. 멸 균 병 상단 필터 (0.2 µ M 기 공 크기) 버퍼를 필터링 합니다. 15 분 동안 진공 (-6 psi)에서 교 반 하면서 버퍼 드
    4. 사용 당일 버퍼 위의 모든 DTT를 추가 합니다.
  3. CENP-F 구조를 포함 하는 섹션 2에서 셀 동 GST 바인딩 버퍼와 40 mL를 볼륨을 조정 합니다. 1mm DTT, 0.25 m m PMSF, 0.5 m m (0.5 M 재고 솔루션, pH 8.0), EDTA 추가 7 mg benzamidine 염 산 염 (1 m m), 그리고 40 mg d / 메티오닌.
    참고: 분해 저하를 줄이기 위해, 모든 단계 수행 4 ° c, 차가운 방에 선호, 다른 설명이 없는 한. 항상, 셀, lysates, 및 얼음에 순화 된 단백질 분수를 유지 하 고 protease 억제제를 추가. 시스테인과 메티오닌 잔류물의 산화 방지, 실험 당일 DTT, 메티오닌 등 reductants을 추가 합니다. 위하여 저하를 줄이기 위해, 신속 하 게 단계를 통해 작동 합니다.
  4. Lyse 으로 sonicator 셀 다음과 같습니다. lysate를 유리 비 커를 얼음 물 탕에 젖어 있습니다. (1 분 40 s, 100 W (50%) 출력/진폭, 10 s 펄스와 10 s 나머지 사이클에서) 문화 sonicate 250 µ M PMSF 쥡니다 후 추가 합니다. 세포 lysate, 더 투명 한 모양과 더 이상 점성 수를 검사 합니다.
  5. 명확한 lysate centrifuging 12000-40000 x g, 25 분, 4 ° c.에 의해 라운드-하단 원심 분리기 튜브와 고정된 각도 터를 사용 합니다.
  6. 재래식 일회용 크로마토그래피 열 티 agarose 1:1 슬러리의 2 개 mL를 추가 하 여 수행 합니다. 결과 열 1 mL의 볼륨을 가질 것 이다. 25 mL 초순과 25 mL GST 바인딩 버퍼의 열을 씻어.
  7. 다음과 같이 바인딩 을 수행 합니다. 차가운 방 또는 찬 상자에서 작업, 알 약에서 lysate 가만히 따르다. 연결된 열에 부 어 및 lysate (0.2 µ m 기 공 크기)를 필터링 합니다. 뚜껑 열과 부드럽게 nutating 4 ° c.에 30 분 동안 품 어
  8. 세척 하는 선반에 그것을 넣어 열 수 지 정착, 그리고를 통해 흐름을 수집 하자. GST 바인딩 버퍼의 25 mL로 두 번 열을 씻어.
  9. 분해 분열에 의해 elute.
    1. 열을 연결 합니다. GST 바인딩 버퍼의 400 µ L 및 PS 효소 (2 mg/mL 주식 1000 U/mg의 활동 중 실험실에서 정화 또는 구입; 테이블의 자료를 참조)의 250 µ L를 추가 합니다.
    2. 뚜껑을 열 고 부드럽게 버퍼에 수 지를 resuspend에 소용돌이. 16-20 h 4 ° c.에 대 한 열을 품 어 다음 열에서 proteolytically 쪼개진된 CENP F 조각 elute GST 바인딩 버퍼의 4 mL를 추가 합니다.
  10. 티 차입
    1. 열 연결 GST 차입 버퍼 (4 열 개)의 4 개 mL를 추가 하 고 바운드 GST 태그 elute를 10 분 동안 품 어. eluate를 수집 합니다. 제조 업체에 의해 설명 된 대로 다시 사용 하기 전에 열을 다시 생성 합니다.
  11. PS protease 차입 분수와 16% 아크릴 아 미드 젤에 SDS 페이지 티 차입 분수를 분석 합니다. Coomassie 블루 젤 45 분 얼룩에 대 한 25 V/cm에서 전기 영동을 수행 합니다. 티 분수 쪼개진된 GST 태그 포함 되지만 PS protease 분수 순화 CENP F 조각을 포함 됩니다. 위하여 분열 효율성을 평가 하기 위해 젤을 검사 합니다.
  12. 0.5 ml 3 kDa 분자량 컷오프와 원심 필터 단위를 사용 하 여 효소 eluate PS 집중 ( 재료의 표참조). 필터의 위쪽 구획에는 eluate를 추가 하 고 4100 x g, 샘플 집중 하 4 ° C (스윙 아웃으로 터)에서 10-15 분 단위로 원심. 각 증가 후 pipetting으로 혼합.
  13. 적당 한 여과 열 젤 연결 (구매 정보에 대 한 재료의 표 참조) 고속 단백질 액체 착 색 인쇄기 (FPLC) 시스템, 1 열 볼륨 젤 여과 버퍼의 equilibrate 그리고.
  14. Microcentrifuge (20 분, 21,700 x g, 4 ° C)에 집중된 CENP F 조각 원심 열에 넣기 예제와 젤 여과 버퍼의 1 열 볼륨 elute. 0.6 mL 분수를 수집 합니다.
    참고: 젤 여과 버퍼 후속 키 분석 결과와 호환성을 위해 최적화 됩니다. 테스트 대상 단백질이이 버퍼에 안정 되어 있는 경우. 그것은 안정 되어 있는, 더 많은 염화 나트륨을 추가 해보십시오.
  15. SDS 페이지 (3.11 단계)에 의해 피크 분수를 분석 합니다. 순수한 CENP-F 파편을 포함 하는 피크 분수 풀. 3.3 mg/mL (3.12 단계)를 순화 CENP F 파편을 집중 을 한다. SDS 페이지 (3.11 단계)에 의해 순화 CENP F 파편을 분석 합니다.
  16. 단백질 농도 결심
    1. 초순에 샘플 1: 100 희석 하 고 석 영 마이크로-베트에 배치. 분 광 광도 계에 220-300 nm의 파장 범위에서 스펙 하 트 레코드 라
      참고: 단백질 농도 c (mg/mL) 다음 식에서 파생 된다:
      figure-protocol-1
  17. 순화 된 단백질의 50 µ L aliquots 0.5 mL microtubes 및 플래시 동결 을 액체 질소에 그들. -80 ° c.에 aliquots 저장

4. Ni NTA 친화성 크로마토그래피에 의해 재조합 형 단백질의 정화

  1. 다음 버퍼를 만들고 멋진 4 ° c
    1. 준비는 그의6-바인딩 버퍼 25 ° c, 250 mM NaCl, 5mm 이미 pH 8.0, 5mm 공학은 10 mM Tris pH 8.0을 사용 하 여. 사용 당일 공학은 모든 버퍼에 추가 합니다.
    2. 준비는 그의6-워시 버퍼 는 그의 같은 방식으로6-버퍼 바인딩 하지만 20mm 이미를 사용 하 여.
    3. 준비는 그의6-차입 버퍼 바인딩 버퍼 하지만 150mm 이미를 사용 하 여 같은 방식으로.
  2. 생성 하 고는 그의 40 mL에 볼륨 조정 karyopherin α를 포함 하는 섹션 2에서 셀을 녹여 6-바인딩 버퍼. 5mm 공학은, 0.250 mM PMSF, 7 mg benzamidine 염 산 염 (1 m m), 및 40 mg d / 메티오닌 추가 합니다.
    1. 다음 변형을 3.4-3.8 단계에서 설명한 대로 진행:6그의 사용-모든 단계에 대 한 GST 바인딩 버퍼 대신 바인딩 버퍼. 티 agarose 대신 사용 니켈 선호도의 4 mL 젤 ( 재료의 표참조) 2 mL의 열 량을가지고 것입니다 열.
      참고: 니켈 선호도 열 DTT와 EDTA와 호환 되지 않습니다. 니켈 선호도 젤 대신 Ni2 +-nitrilotriacetic 산 (NTA) agarose 경우 사용할 수 있습니다, 차입 버퍼에 이미 농도 250 m m로 증가 ( 자료 표참조).
  3. 워시는 의 그의68 mL와 열-워시 버퍼.
  4. 그의6의 12 mL와 함께 Elute karyopherin α -차입 버퍼 및 SDS 페이지 (단계 3.11) eluate 분석.
  5. PS protease의 추가 250 µ l (단계 3.9)는 eluate 하 고 16-20 h 4 ° c.에 품 어 한편, 두 번에 대 한 그의6의 1 L eluate dialyze-2-20 h는 6-8 kDa 분자량 컷오프 투 석 막 사용에 대 한 바인딩 버퍼.
  6. 제조 업체에 의해 설명 된 대로 니켈 선호도 젤 열을 다시 생성 합니다. 그의625 mL와 열 equilibrate-바인딩 버퍼. Dialyzed 단백질은 열을 추가 하 고 단계 3.7에서에서 설명한 대로 바인딩 단계 를 수행 합니다.
  7. 를 통해 흐름을 수집, 순화 karyopherin α를 포함 (는 그의6-태그 떨어져 죽 습), 그리고 그의6의 추가 4 mL와 함께 남은 단백질을 elute-바인딩 버퍼. 이 분수를 풀. 그런 다음 그의6의 12 mL와 함께 열을 elute-차입 버퍼. 이 분수는 불순물을 포함합니다.
  8. 분석 단계 4.4-4.5에서에서 uncleaved 및 쪼개진 karyopherin α와 SDS 페이지 (단계 3.11) 그의6의 효율성을 평가 하 여이 단계에서 두 차입 분수-절단, 순도 태그.
  9. 8 mg/mL 및 플래시 동결 에 액체 질소 (3.15-3.17 단계) karyopherin α 집중 을 한다.

5. 시험관에서 키 분석 결과 Cdk1/ B

  1. 키 니 아 제 분석 실험 체 외에
    참고:는 키의 도착, 작은 aliquots, 플래시 동결 그들 액체 질소에 만들고-80 ° c.에서 그들을 저장합니다 6 개월 이내에 사용 합니다. 분자 무게는 Cdk1에 대 한 34 kDa  b 48 kDa, SDS 페이지  B의 명백한 분자량 약 60 kDa 이다.
    1. PK (고 니와 함께 제공 된) 버퍼를 사용 하 여 x 10 준비 0.5 M Tris HCl, 0.1 m M MgCl2, 1 mM EDTA, 20mm DTT, 0.1% Brij 35, 25 ° c.에 pH 7.5
    2. ATP 주식 x 10을 준비: PK 버퍼, x 1에 4 mM ATP의 솔루션을 확인 하 고 재고의 최종 pH를 확인. -20 ° C에서 작은 aliquots에 저장 하 고 동결-해 동 주기를 피하기 위해.
    3. CENP-F의 믹스 40 µ L 조각 (3.3 mg/mL, 또는 400 µ M의 농도)에 PK 버퍼, 3 µ L의 초순, 6 µ L ATP 10 배 재고, 그리고 인간의 5 µ L x 6 µ L 10 Cdk1/ B (1 µ g, 100 U) 0.5 mL microtube에.
      참고: CENP F 조각 8.6 kDa와 4 Cdk1 전용 인 산화 사이트의 어 금 니 질량은 이다. 새로운 기판에 대 한 분석 결과 및 인 산화 위치의 수에 따라 단백질의 어 금 니 농도 따라 니 농도 조정 합니다. 재조합 인간 Cdk1/ B 주식의 활동 20000 U/mL, 그리고 특정 활동 1000000 U / mg. 1 U Cdk1/ B Cdk1 펩 티 드 기질 PKTPKKAKKL-NH2 1 pmol 인산 염의 이전을 촉매 하는 데 필요한 금액으로 정의 (50 µ M) 30 ° C에서 1 분에 ( 재료의 표참조).
    4. 1-16 h 30 ° c.에 대 한 Cdk1/ B. 품 없이 제어 반응 반응 물 욕조에 준비
  2. 키 니 아 제 분석 실험 반응의 2.5 µ L 분석 SDS 페이지 (3.11), 단계에 의해 컨트롤의 2.5 µ L 16% 아크릴 아 미드 젤을 사용 하 고. 해상도 늘리려면 실행 시간을 확장 합니다.
  3. 나머지 키 분석 결과 반응 (및 컨트롤) 6 M guanidine 염 산 염 솔루션의 동일한 볼륨을 추가 합니다. 마지막 guanidine 염 산 염 농도 3 M. 질량 분석 (제 6 항) 인 산화 사이트 식별 또는 분석, 질량 분석 시설에 샘플을 보내 다음 기능 확인 (수행 하 여이 샘플을 분석 될 것 이다 섹션 7)입니다.
    참고: 후속 질량 분석 분석을 위해 매우 중요 하다는 개별 사이트의 인 산화 효율, 높은 선호 100%,으로 인 산화 위치를 매핑할 수 없습니다. 크게 인 산화 효율성 향상, Cdk1/ B의 더 큰 금액을 추가 하 고 16 h 배양 시간을 증가. 또한 ATP의 농도 두 배로 수 있습니다.
  4. 문제 해결을 위한 긍정적인 컨트롤로 CENP-F (잔류물 2,987-3065)의 체 외에 키 니 아 제 시험을 수행 합니다. Cdk1/ B의 신선한 배치를 사용 하 여 높은 활동.

6. 질량 분석에 의해 인 산화 Cdk1 특정 사이트의 식별

  1. 변성 단백질 견본 desalt PLRP300 열과 microbore 역 상 액체 크로마토그래피 를 수행.
  2. CENP-F 조각에 인 산화 위치의 수를 분무 이온화 이온 트랩 질량 분석 (ESI-ITMS)44,45는 그대로 체 외에 phosphorylated CENP F 84-메 르 분석.
  3. CENP-F의 phosphoamino 산 사이트 위치를 평가 하는 체 외에서 의 트립 신 다이제스트 준비 CENP F 단백질 견본 phosphorylated. 담 피펫으로 팁과 트립 신 다이제스트 desalt.
  4. 분무 이온화 푸리에 이온 싸이 클 로트 론 공명 질량 분석 (MS ESI FTICR) 변환에 의해 CENP-F의 tryptic 다이제스트를 분석 합니다. 169 µs의 축적 시간 ESI FTICR 질량 분석기에서 분석을 수행 합니다.
    참고: 0.005 amu 내의 대 중 ESI FTICR MS에 의해 결정의 정확도 이다. 총 단백질 양을 각각 phosphorylated 각 종의 비율 계량, 질량 스펙트럼의 피크 높이 결정 합니다.

7. 기능 검증: 단백질-단백질 상호 작용 분석 크기 배제 크로마토그래피에 의해에 Phosphomimetic 돌연변이의 효과 테스트

참고: 위해 확인 된 Cdk1 관련 인 산화 위치의 기능 검증 확인 된 인 산화 사이트 aspartates 대체 하 여 CENP-F 파편의 phosphomimetic 돌연변이 생성 . Aspartate의 네거티브 차지 인 산화의 효과 모방합니다. CENP-F 조각 (잔류물 2,987-3065)의 S3048D 돌연변이 만들었습니다.

  1. 기능 검증, 야생-타입의 바인딩 비교 및 karyopherin α. phosphomimetic CENP F 파편 분석 젤 여과 사용 하 여 바인딩 분석 결과로. 분석 젤 여과 대 한 티 친화성 크로마토그래피 (단계 3.1-3.12)에 의해 CENP F 파편 을 정화 하 고 젤 여과 단계를 건너뜁니다.
  2. 5-6 mg/ml 단백질을 집중 한다. 플래시-동결 단백질 aliquots 액체 질소 (3.15-3.17 단계).
  3. 믹스 순화 CENP F 조각 (0.1 mg, 야생-타입 또는 S3048D 이체) 및 1:1 어 금 니 비율에서 karyopherin α (0.7 mg)를 정화. 젤 여과 버퍼 200 µ L에 샘플 볼륨을 조정 합니다. 얼음에 30 분에 대 한 샘플을 품 어, 샘플 (0.2 µ m 기 공 크기), 필터, 원심 분리 (25 분, 21,700 x g, 4 ° C) 하 여 샘플을 취소
  4. 샘플에 크기 배제 크로마토그래피에 의해 (단계 3.13-3.14) 구분 합니다. 20 mM HEPES, pH 7.5, 150 m NaCl, m 및 2 m m DTT의 구성 된 젤 여과 버퍼를 사용 합니다. 모든 샘플에 대 한 동일 조건에서 분석 젤 여과 실험을 수행 합니다.
  5. 제조 업체에 의해 설명 된 대로 알려진된 분자량의 고분자 중량 기준 분석 젤 여과 열 보정.
  6. 16% 차입 분수 분석 SDS 페이지 (단계 3.11).

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결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

최근 포함 cNLS10CENP-F 조각에서 Cdk1 관련 인 산화 사이트를 식별 하는 생체 외에서 니 분석 결과 (그림 1) 사용 했습니다. 이 신호는 대부분의 interphase 동안 CENP F의 핵 지역화를 수 여. G2 단계에서 CENP F Cdk1 종속 방식에서 cytosol에 핵에서 수출 된다. Cdk1 CENP-F의 셀룰러 지역화를 조절 하는 방법에 대 한 기계적 통찰력을 얻으려면, 우리는 iGPS 서버36,37을 사용 하 여 CENP-F Cdk1-관련 인 산화 위치를 예측 하기의 순서 분석. CENP F cNLS, 내 세 Cdk1 관련 인 산화 사이트 예측 했다 3,042, 잔류물에서 3045, 및 3,048 (표 1

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리의 생체 외에서 니 분석 결과 세포 주기의 마스터 컨트롤러 및 많은 중요 한 세포질 과정을 조절 키 Cdk1를 위한 분자 표적을 식별 하는 매우 강력한 방법입니다. 메서드는 순화 된 단백질 Cdk1에 대 한 기판 이며 수 인 산화 특정 사이트의 경우 결정 합니다. 이 Cdk1 통해 인 산화에 의해 세포 프로세스의 규칙을 위한 기계 연구를 촉진 한다.

질량 분석에 의해 인 산화 위치의 성공적인 식별에 대 한 가장 중요 한 요소 니 분석 결과의 인 산화 효율입니다. 개별 사이트의 인 산화 효율 이어야 한다, 높은 선호 100%. 이 Cdk1/ B의 양을 증가 하 고 16 h 배양 시간에 의해 얻을 수 있습니다. 때 Cdk1/ B, 단백질과 사이트를 고려해 야 하는 인 산화 수의 어 금 니 농도의 양을 계산 합니다. 이것이 여러 인 산화 위치는 대상 단백질에 존재 하는 경우에 특히 중요 합니다. 그것은 상업 Cdk1/ B의 활동 배치에서 배치, 다 수 고는 키...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 없다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 질량 분석 분석 및 유용한 의견에 대 한 박사 데이비드 킹, 하 워드 휴즈 의학 연구소, 캘리포니아 대학 버클리를 감사합니다. 우리는 박사 Xuelian 주, 상하이, 생물 과학을 위한 학회, 과학의 중국 아카데미, 상하이, 중국 전체 길이 CENP F 구조를 제공 하기 위한 감사 합니다. 마지막으로, 우리는 감사 박사 수잔 베인 박사 브라이언 칼라, 빙 엄 턴 대학에서 박사 Christof Grewer 장비에 대 한 액세스. 이 연구는 뉴욕의 주립 대학 및 대학의 뉴욕 주립 빙햄 턴 화학과 연구 재단에 의해 투자 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2800 mL 당황 Fernbach 플라스크Corning44232XL
암피실린골드 생명 공학A-301-25
ATPFisher ScientfiicBP413-25
벤자미딘 염산염Millipore SigmaB6506-25
병탑 필터Corning431161
Cdk1 / cyclin B 재조합, human 20,000 U/mLNew England BiolabsP6020
Cdk1/cyclin B (대체 소스)EMD Millipore14-450
Cdk1/cyclin B (대체 소스)InvitrogenPV3292
Cdk1/cyclin B + 10x PK 버퍼New England BiolabsP6020
CENP-F (residues 2987 – 3065) pGEX6P1 플라스미드요청 시 사용 가능.
원심분리기: Heraeus Multifuge X3R, 냉각, TX-1000 스윙아웃 로터 포함Thermo Scientific10033-778
원심 필터 장치: Amicon Ultra-15 원심 필터 장치, 3kDa 컷오프, Ultracel-PL 멤브레인EMD MilliporeUFC900324
chlorampenicolGold BiotechnologyC-105-100
D/L 메티오닌Agros Organics / Fisher
탈염 피펫 팁: 지퍼 팁Millipore SigmaZTC18S008
일회용 크로마토그래피 컬럼, Econo-Pac 1.5 x 12cmBiorad7321010
dithiothreitolGold BiotechnologyDTT50
E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS 균주EMD Millipore71403
전기 분무 이온화 푸리에 변환 이온Bruker 아마존에이펙스 III
사이클로트론 공명 질량 분석기
전기 분무 이온화 이온 트랩 질량 분석기Bruker 아마존맞춤형
고정 각도 로터: Fiberlite F15-8x-50cyThermo Scientific97040-276
FPLC 시스템: Ä kta Pure FPLCGE 헬스케어29032697
젤 여과 컬럼: Superdex 200 증가 10/300 GLGE 헬스케어28990944
글루타티온 아가로스피어스16101
글루타티온, 감소Millipore SigmaG4251-50g
인큐베이션 쉐이커: 멀티트론 쉐이커InforsI10102
이소프로필 &베타;-D-1-티오갈라크토피라노시드골드 바이오테크I2481C50
카나마이신골드 바이오테크K-120-25
카료페린 &알파; PET-28a 프레스 플라스미드요청 시 이용 가능.
Luria Bertani mediumFisher ScientfiicBP1426-2
microcentrifuge 5418R, 냉장Eppendorf5401000013
microtubes (0.5 mL)Eppendorf30121023
microtubes (1.5 mL)Eppendorf30120086
Nickel 친화성 겔: His-Select Nickel 친화성 겔Millipore SigmaP6611-100ml
pGEX-6P-1 플라스미드Millipore SigmaGE28-9546-48
페닐메틸설포닐 플루오라이드골드 생명공학P470-10
PS 프로테아제: PreScission 프로테아제GE 헬스케어27084301
포스 태그 아크릴아미드Wako Pure Chem.304-93521
감소된 글루타티온Millipore SigmaG4251-50G
라운드바텀 원심분리기 튜브(Oakridge 튜브)Fisher Scientfiic055291D
현장 지시 돌연변이 유발 키트: QuikChange LightningAgilent210518
현장 지시 돌연변이 유발 키트
소파화기: Branson S-250D 소닉 화기Branson15 338 125
Spectra/Por 1RC 투석 멤브레인 (6-8 kDa 컷오프)Spectrum Labs08 670B
스윙 아웃 로터 TX-1000Thermo Scientific10033-778
125650010놀러지 놀러지 공업

참고문헌

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