방법 논문

생체 외에서 Decidualization에 대 한 인간의 자궁내 막 기질 세포의 고립

DOI:

10.3791/57684

⸱

2018년 9월 1일

 ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Center for Reproductive Health Sciences, Washington University School of Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 분리와 decidualization 분석 결과 생체 외에서 실시 하 인간의 자궁내 막 기질 세포의 문화에 대 한 검증 및 최적화 절차를 선물 한다. 또한,이 연구를 효율적으로 최저의 자세한 방법을 siRNAs를 사용 하 여 인간의 자궁내 막 기질 세포에서 특정 유전자를 제공 한다.

초록

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인간의 자궁내 막 기질 세포 (HESC) 분 비 decidua에 구와 같은 모습에서의 분화는 어머니 자 궁의 자 궁 내벽에 배아 이식에 필요한 변환입니다. 잘못 된 decidualization 이식 실패와 이후의 초기 태아 유산에 대 한 근본 원인으로 설립 되었습니다. 따라서, 밑에 decidualization 분자 메커니즘을 이해 성공적인 출생의 속도 향상에 유리 하다. Vivo에서 기반 인공 decidualization의 연구는 종종 동물 모델에서 변환 합병증 뿐 아니라 인간의 연구와 관련 된 윤리적 딜레마 때문 제한 됩니다. 결과적으로, 기본 세포 배양을 통해 분석 실험 체 외에 호르몬을 통해 decidualization의 변조를 탐험 자주 활용 됩니다. 이 연구는 HESC 고립과 자란 보통 호르몬의 보충을 통해 후속 인공 decidualization에 대 한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 또한,이 연구 하면 잘 설계 된 최저에 관심사의 어떤 유전자 지질 기반 siRNA transfections를 활용 하 여 있습니다. 이 프로토콜 허용 기본 decidualization, 및의 후속 정량화 하는 분자 메커니즘을 이해 하는 신뢰할 수 있는 방법으로이 모델을 활용 하는 능력을 극대화 함으로써 제품의 수율 뿐 아니라 문화 순도의 최적화 decidualized 자궁내 막 기질 세포에 의해 분 비 대리인입니다.

서론

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Menarche의 단계와 폐 경, 생식 연령의 여성 호르몬 규제 자궁내 막 증식, 차별화, 임신 생리1 이라는 프로세스에 대 한 준비에 후속 흘리기의 월별 주기 받아야 ,2. 인간의 endometrium의 실제 수정 등은 자 궁 벽1에 적절 한 배아 이식 필요 합니다. 난소 스테로이드 호르몬 에스트로겐과 황 체 호르몬 (P4)를 통해 생리 주기 변경 endometrium, 형태학 및 생화학 적인 적응을 포함 하 여의 중재는3,,45. 증식 (follicular) 단계 내 preovulatory 에스트로겐 수준의 증가, endometrium 두껍게 시작. 배 란, 다음 분 비 (또는 luteal) 단계 반올림, 상피 같은 decidual 셀 구와 같은 모습에서 자궁내 막 기질 세포 (ESC)의 형태학 상 변화를 유도 하는 P4 농도에 상당한 증가 촉진 decidualization4,6로 알려진 프로세스. 잘못 된 decidualization 이식 실패와 이후의 초기 태아 유산4,,78에 대 한 근본 원인으로 설립 되었습니다. 따라서, 밑에 decidualization 분자 메커니즘을 이해 진단과 초기 임신 손실의 처리에 유리 하다.

현재, 자궁내 막 기질 세포에서 decidualization의 기본 효과 탐험 여러 방법론 활용 됩니다. Vivo에서, 마우스 궁 기계적 자극 (즉,긁 적)를 통해 decidualization에 대 한 인위적으로 유도 될 수 있다 또는 기름9hormonally 끝났다 자 궁 주입. 다른 인간,이 합성 자극 blastocyst 존재, 설치류10,11decidualization의 개시에 필요한 단계의 모양을 제공 하 여 자 궁 루멘의 분화를 촉진 합니다. 따라서, 동물 모델 및 인간에서 vivo에서 기반 연구를 둘러싼 윤리적 딜레마와 관련 된 변환 합병증으로 인해 decidualization 기반 모델은 가장 성공적으로 공부 생체 외에서.

이 연구에서 과목 두 지역 영어와 스페인어 신문에서 광고의 배치를 통해 채용 됩니다. 과목이이 연구에 대 한 적합 한 후보자로 식별 되는 가져온 연구 코디 네이 터, 잠재적인 위험의 전체 공개 토론 된다와 나. 관련 된 잠재적인 위험에 대 한 완전 한 이해의 확인, 과목의 동의 서 면과 구두 모양에서 달성 했다. 주제 동의 (1) 받을 미래 연구 목적을 위해 그들의 조직의 정 (2) 장기 저장 (3) 수집 된 조직 표본에서의 기본 문화 창조에 동의 하는 권한이 포함 됩니다. 동의 다음 과목 인종/민족성의 비공개에 대 한 권리는 허용 된 자가 식별에 완료 하는 폼을 받는다. 후속 방문 endometrium 생의 생리 주기에 따라 달성 예정 이다. 이 연구에 모집 하는 자원 봉사자로 2012 인구에 의해 문서화 세인트 루이스 수도권의 민족과 인종 인구를 반영 하 고 임산부, 태아, 태아를 포함 하 여 모든 취약 한 주민들의 참여를 포함 하지 않았다 나이, 또는 다른 취약 한 그룹의 18 세 미만 어린이. 생 검 샘플 컬렉션에 참여 하기 위한 자격 요건 포함 (1) 일반 생리 주기 (25-32 일) (3) 현재 임신 이나 호르몬 자궁내 장치 피임약의 사용 하는 데는 데 18-45 년 (2)의 나가 사이 되 고 현재 질 감염이 나 성병 (5) 없는 현재 항생제 치료와 (6) 등록 (4) 전 30 일에 대 한 없음 현재 비정상적인 경부 데.

이 연구에서 인간의 자궁내 막 기질 세포 (HESC) 배양 하 (estradiol (e 2), medroxyprogesterone 아세테이트 (MPA), 및 순환 아데노신 호르몬의 보충을 통해 생체 외에서 decidualization을 인위적으로 유발 monophosphate (캠프)) 매체에. 이 방법에서는, decidualization의 정도 호르몬 치료의 일의 총 수에 따라 변경 됩니다. Cytoskeletal 재배치와 함께, 호르몬 보충 decidual 세포 분 비 같은 자질2,4를 경험 하는 생 화 확 적인 적응을 유도 합니다. Prolactin (PRL)와 인슐린 같은 성장 인자 의무적인 단백질 1 (IGFBP1), 같은 각 인 유전자의 표정은 확인 하 고 계량 HESC decidualization5,12, 의 정도를 이용 될 수 있다 13 , 14. 중요 한 것은,이 프로토콜을 유전자 특정 최저 생존도 시연 했다.

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프로토콜

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세인트 루이스, 산부인과 학과에서 워싱턴 대학에서이 연구를 위해 수집 하는 모든 인간의 endometrium biopsies 달성 했다 고 부인과 기관 검토 위원회 (IRB)를 사용 하 여 서 면된 동의서를 승인.

1입니다. 준비

  1. 100 U/mL 페니실린과 100 µ g/mL 스 미디어 포함 병 (HBSS + 매체 추가 참조)에 추가 하 여 1 x 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)의 500 mL를 준비 합니다.
  2. Dulbecco의 수정이 글 중간의 500 mL를 준비: 페 놀 레드, L-글루타민와 15 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 산 (HEPES) 1% 항생제 antimycotic 솔루션 (최종 농도 추가 하 여 영양소 혼합 F-12 (DMEM/F12) 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스, 그리고 0.25 µ g/mL Fungizone) 병 (HESC 절연 매체로 참조 추가)를 포함 하는 미디어를.
  3. 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1 x 나2HCO3및 1%를 추가 하 여 페 놀 레드, L-글루타민와 15 mM HEPES DMEM/F12의 500 mL를 준비 페니실린 (10000 U/mL)와 스 (10000 µ g/mL) (펜 Strep) 미디어 (추가 병 포함 HESC 미디어로 참조).
  4. 2%의 감소 혈 청 L-글루타민, 2.4 g/L 나트륨 중 탄산염와 HEPES 500 mL를 준비 숯 박탈 태아 둔감 한 혈 청 (csFBS)와 1% 펜 Strep 병 (Decidualization 미디어 추가 참조)를 포함 하는 미디어.
  5. 페 놀 레드 숯불 2%를 추가 하 여 무료 DMEM/F12 (더 변경 미디어 참조) 병을 포함 하는 미디어에 소 태아 혈 청 (csFBS) 박탈의 500 mL를 준비 합니다.
  6. 10 nM estradiol (e 2), 1 µ M medroxyprogesterone 아세테이트 (MPA), 및 15 mL 폴 리 프로필 렌 원뿔 튜브, 50 µ M 순환 아데노신 monophosphate (캠프) 준비 하 고 이전 준비 decidualization 미디어 생체 외에서 의 잘 약 수 당 2 mL에 추가 decidualization 분석 결과 (EPC 미디어 추가 참조).
  7. 50 mL 50 mL 폴 리 프로필 렌 원뿔 튜브 (고정 미디어 추가 참조)에서 90 %FBS 10% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 미디어를 동결을 준비 합니다.
  8. 전 콜라와 DNase의 5 mg 25 밀리 그램 무게 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브에-20 ° c.에 게 나

2. 인간의 Endometrium 생 검 획득

  1. HBSS에 IRB 승인 클리닉에서 생리 주기의 증식 단계 (하루 9-12 일)에서 수집 된 인간의 endometrium 생 샘플을 가져옵니다.
  2. Prewarmed 37 ° C HBSS + 매체 1 mL와 함께 생 검 견본을 세척 하 고 부드럽게 흔들어 과잉 혈액을 제거 하 고 점액.

3. 인간의 자궁내 막 기질 세포 (HESC)의 절연

참고:이 격리 절차 생물 안전 캐비닛 아래 무 균 환경에서 수행 됩니다.

  1. 포함 된 10 mL 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 원심 분리기 관으로 소독된 겸 자 생 검 전송 신선한 HBSS.
  2. 90 x 500g에 실 온에서 생 검 원심 s.
    1. 셀 펠 릿 파열 90 2000 x g에 생을 다시 회전 경우 s.
  3. 1 mL를 피펫으로 사용 하 여 미디어를 제거 하 고 37 ° C의 10 mL로 씻어 HESC 격리 미디어 500 x 90 g에서 원심 분리 뒤 prewarmed s.
  4. 1 mL 피펫으로 사용 하 여 미디어를 제거 하 고 적극적으로 생 검 꺼내 려 신선한 HESC 격리 미디어의 3 mL를 추가 합니다.
  5. HESC 격리 미디어의 5 mL를 포함 하는 배양 접시에 생 검을 가만히 따르다.
  6. 약 20 분 동안 #5 집게와 좋은 스트레이트 스티치가 위를 사용 하 여 가능한 작은 조각으로로 생을 말하다.
  7. DNase 준비 나 하 고 미리 무게 DNase를 HESC 격리 미디어의 10 mL를 추가 하 여 콜라 효소 나 (0.5 mg/mL)와 콜라 (2.5 mg/mL). 피펫으로 믹스.
  8. 피 펫 1 mL를 피펫으로 새로운 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브로 사용 하 여 조직 샘플을 잘라. HESC 격리 미디어의 7 mL로 세척 하 고 전체 샘플 얻으려고 폴 리 프로필 렌 튜브에 추가.
  9. 2 분에 대 한 원심 분리기 샘플 800 x g에 실 온에서 부드럽게 피 펫은 상쾌한을 제거 합니다.
  10. 어 0.2 µ m 필터를 통해 콜라 솔루션 10 mL 주사기 펠 릿에 직접에 연결 하는 DNase를 필터링 합니다.
  11. 10 소용돌이 펠 릿 resuspend s.
  12. 1.5 h에 대 한 37 ° C 물 목욕, vortexing 10에 대 한 다이제스트의 조직 소화 될 때까지 철저 하 게 모든 10 분.
  13. 필터 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 샘플 상피 세포와 조직 파편을 제거 하는 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브에 쌓입니다.
    참고: Stromal 세포 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브에 있습니다.
  14. 실 온에서 2.5 분 800 x g에서 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브 원심 부드럽게 1 mL 피 펫과 상쾌한을 제거 합니다.
  15. HESC 격리 미디어 10 mL에 펠 릿을 resuspend.
  16. 실 온에서 2.5 분 800 x g에서 원심. 상쾌한, 발음 하 고 혼합 HESC 미디어 정방향 및 역방향 피 펫의 6 mL에 셀 resuspend.
  17. 천천히 밀도 그라데이션 미디어 레이어를 혼합 하지 않도록 주의 되 고 stromal 세포에서 남아 있는 혈액 세포를 분리 하는 resuspended 세포를 3 mL에 레이어.
  18. 실 온에서 30 분 400 x g에서 15 mL 폴 리 프로필 렌 튜브 원심
  19. 새로운 50 mL 폴 리 프로필 렌 튜브에 상쾌한의 5 mL을 수집 하 고 셀을 resuspend 하는 추가 5 mL HESC 미디어 추가.
  20. 실내 온도에, 뒤에 상쾌한의 제거 및 추가 6 mL HESC 미디어의 2.5 분 800 x g에서 원심. 소용돌이 10 s를 pipetting으로 혼합 샘플 앞으로 반전 5 번.
  21. Aliquot 10 µ L 셀 개수에 대 한 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 다시 일시 중단 된 세포의.
  22. 0.4 %Trypan 푸른 얼룩 약 수를 셀을 피펫으로 믹스의 10 µ L를 추가 합니다. 약 수의 10 µ L을 로드 하 고는 hemocytometer를 사용 하 여 셀.
  23. 15 mL HESC 미디어에서 총 세포 수에 따라 적절 한 플라스 크에 세포 격판덮개
    1. 셀의 총 수 1 백만 보다는 더 적은 인 경우에, 25 cm 플라스 크에 있는 모든 셀 HESC 미디어의 6 mL 접시. 경우 셀의 총 수는 1 백만 이상, 75 cm 플라스 크에 있는 모든 셀 HESC 미디어의 15 mL 접시.
  24. 문화는 5% CO2 인큐베이터에서 37 ° C에서 최소 6 h 적절 한 세포 접착을 보장 하는 HESC 미디어는 미디어 변경에 대 한 셀.
  25. 37 ° C에서 5% CO2 배양 기에서 격리 HESC 세포 형성 단층 도금된 플라스 크에 80-90 %confluency 달성 될 때까지 3-5 일의 기간에 대 한 문화.
  26. HESC 미디어 매 2 일 변경.
    1. 15-20 분 동안 37 ° C 물 욕조에 따뜻한 HESC 미디어.
    2. 플라스 크에서 미디어를 발음 하 고 신선한 HESC 미디어 플라스 크를 추가 (작업 볼륨: 8 mL 또는 16 mL 당 25 cm 또는 75 cm 플라스 크 각각).
    3. 80-90 %confluency 달성 될 때까지 플라스 크를 37 ° C에서 5% CO2 배양 기에 다시 놓습니다.
  27. HESC 되 면 80-90% 합칠, 전송 셀 75 cm 플라스 크를 25 cm 또는 한 75 cm 플라스 크에서 세 75 cm 플라스 크.
    참고: HESC 냉동 고 미래 실험을 위해이 이번에 최신 사용을 위해 저장 될 수 있습니다.

4. 중지 및 재개 HESCs

  1. 75 cm 플라스 크에서 미디어를 발음 하 고 트립 신-EDTA의 2 개 mL를 추가 합니다.
  2. 세포는 플라스 크에서 빠질 때까지 37 ° C에서 2-3 분 5% CO2 배양 기에서 품 어.
  3. 앞으로 역 HESC 미디어와 pipetting으로 잘 섞어 7 mL를 추가 합니다.
  4. 800 x g 2.5 분에서 centrifuge 고는 상쾌한 발음.
  5. 레이블 셀 라인, 날짜, 및 통로 수 튜브를 동결.
  6. 다시 미디어를 동결의 5 mL에 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다.
  7. -80 ° C 냉장고를 각 튜브 및 전송 관에 다시 중단된 HESC의 aliquot 1 mL.
  8. 24 시간 이내에 액체 질소를 튜브를 전송 합니다.
    참고: 즉시 미래에 있는 세포를 해 동 계획 저장 냉동된 셀-80 ° C에서 한 달 동안.
  9. 녹고 있는 HESCs 대 한 HESC 미디어 20 분 예 열.
  10. 25 cm 플라스 크를 데워 HESC 미디어의 8 mL를 추가 합니다.
  11. 액체 질소 탱크 또는-80 ° C에서 냉동 관을 검색 하 고 세포를 해 동 1-2 분 동안 37 ° C 물 목욕에서 튜브 잠수함.
  12. 해 동된 HESC HESC 미디어 25 cm 플라스 크를 전송 하 고 37 ° c.에 하룻밤 5% CO2 배양 기에서 품 어
  13. 다음 날, HESC 미디어를 변경 하 고 2-3 일 HESC confluent 되 고 아래에 설명된대로 프로토콜 5 75 cm 플라스 크에 세포를 전송 될 때까지 기다립니다.
    1. 15-20 분 동안 37 ° C 물 욕조에 따뜻한 HESC 미디어.
    2. 플라스 크에서 미디어를 발음 하 고 신선한 HESC 미디어 플라스 크를 추가 (작업 볼륨: 8 mL 또는 16 mL 당 25 cm 또는 75 cm 플라스 크 각각).
    3. 80-90 %confluency 달성 될 때까지 플라스 크를 37 ° C에서 5% CO2 배양 기에 다시 놓습니다.

5. 인간의 자궁내 막 기질 세포 (HESC) 경작

참고:이 Culturing 절차 생물 안전 캐비닛 아래 무 균 환경에서 수행 됩니다.

  1. 20-30 분 물 목욕에서 37 ° C에서 사전 열 HESC 미디어.
  2. 플라스 크에서 미디어를 발음 하 고 0.25% Trypsin ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) (1 개 mL를 추가 25 cm 플라스 크 또는 75 cm 플라스 크 2 mL).
  3. 셀 꺼내 때까지는 5% CO2 인큐베이터에서 37 ° C에서 2-3 분 동안 품 어.
  4. 부드럽게 플라스 크 벽 꺼내 나머지 셀을 누릅니다. 앞으로 역 HESC 미디어와 pipetting으로 잘 섞어 7 mL를 추가 합니다.
  5. 피펫으로 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브 및 실 온에서 2.5 분 800 x g에서 원심 분리기로 셀 혼합물.
  6. 발음은 상쾌한 고 다시 셀 펠 릿 HESC 미디어에서 일시 중지.
    1. 25 cm 플라스 크 또는 45 mL 플라스 크 75 cm (각 15 mL)에 대 한 15 mL를 추가 합니다.
  7. 각 25 cm 또는 75 cm 플라스 크에 각각 5 mL 또는 15 mL 셀 정지를 추가 합니다.
  8. 37 ° C에서 5% CO2 배양 기에서 격리 HESC 세포 형성 단층 도금된 플라스 크에 80-90 %confluency 달성 될 때까지 3-5 일의 기간에 대 한 문화.
  9. HESC 미디어 매 2 일 변경.
    1. 15-20 분 동안 37 ° C 물 욕조에 따뜻한 HESC 미디어.
    2. 플라스 크에서 미디어를 발음 하 고 신선한 HESC 미디어 플라스 크를 추가 (작업 볼륨: 8 mL 또는 16 mL 당 25 cm 또는 75 cm 플라스 크 각각).
    3. 80-90 %confluency 달성 될 때까지 플라스 크를 37 ° C에서 5% CO2 배양 기에 다시 놓습니다.

6. 인간의 자궁내 막 기질 세포 (HESC) 도금 및 siRNA Transfection

참고:이 transfection 절차 생물 안전 캐비닛 아래 무 균 환경에서 수행 됩니다.

  1. 75 cm 플라스 크에서 HESC 미디어를 발음 하 고 0.25% trypsin EDTA 용액 2 mL를 추가 합니다.
  2. 셀을 꺼내 때까지 2-3 분 동안 37 ° C에서 5% CO2 인큐베이터에서 품 어.
  3. 일단 세포는 플라스 크에서 빠질 HESC 미디어의 7 mL를 추가 하 고 앞으로 pipetting으로 부드럽게 혼합 역 5 번.
  4. 피펫으로 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브 및 실 온에서 2.5 분 800 x g에서 원심 분리기로 셀 혼합물. 발음은 상쾌한 고 다시 HESC 미디어 10 mL에 셀 펠 릿을 일시 중단.
    참고: 둘 이상의 플라스 크에서 셀 도금, 경우 단순히 HESC 미디어 볼륨 증가.
  5. Hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
    1. Aliquot 10 µ L 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 다시 일시 중단 된 세포의.
    2. 0.4 %Trypan 파랑 셀 aliquot 얼룩 및 앞으로 pipetting으로 혼합 및 반전의 10 µ L를 추가 합니다.
  6. 6 잘 플레이트에 잘 당 0.8 x 10 접시5 셀. 이틀 후, 셀 최적의 transfection에 대 한 60-70% 합칠 이어야 한다.
  7. 각 siRNA transfection 샘플에 대 한 단지 transfection 시 약에 siRNA (60 nanomoles)를 사용 하 여 준비 합니다.
  8. Transfection 시에 감소 된 혈 청 자유로운 미디어의 150 µ L의 5 µ L를 희석 하 고 5 분 동안 품 어.
  9. 감소 된 혈 청 자유로운 미디어의 100 µ L에 siRNA의 60 nanomoles 희석 하 고 5 분 동안 품 어.
  10. 5 분 후 희석된 transfection 시 솔루션 희석된 siRNA를 결합 하 고 앞으로 pipetting으로 부드럽게 혼합 5 번 역.
    참고: 하나 이상의 siRNA에 여러 우물을 transfecting, 준비 10 mL에 마스터 믹스 폴리스 티 렌 튜브.
  11. 실 온에서 5 분에 대 한 siRNA transfection 시 약 단지를 품 어.
  12. 이 부 화 하는 동안 각 잘을 변경 미디어의 1 mL를 추가 합니다.
  13. 외피의 5 분 후 솔루션을 수집 하 여 siRNA transfection 시 약 단지의 250 µ L 각 잘 셀 및 미디어를 포함을 추가 2 분 동안 500 x g에서 튜브 원심.
  14. 락을 부드럽게 혼합 하 고 37 ° c 5 h 5% CO2 배양 기에서 세포를 품 어.
  15. 5 h 후 HESC 미디어 미디어 변경 합니다.
  16. 생체 외에서 decidualization 분석 결과 대 한 준비에 2 일 동안 37 ° c 5% CO2 배양 기에서 세포를 품 어.

7. 생체 외에서 Decidualization 분석 결과

참고:이 분석 결과 생물 안전 캐비닛 아래 무 균 환경에서 수행 됩니다.

  1. Camden 외 에 설명 된 대로 생체 외에서 decidualization 치료를 시작 하기 전에 EPC 미디어 준비 3 (1.6 참조).
  2. 게시물 48 시간 단계 6.16에서에서 incubated HESC의 transfected 라인에서에서 미디어 발음
  3. 각 우물에 EPC 미디어의 2 개 mL를 추가 합니다.
    참고:로 컨트롤을 두고 한 일련의 셀의 EPC 미디어와 치료. 대신, 컨트롤 우물에 HESC 미디어의 2 개 mL를 추가 합니다.
  4. 6 일 동안 37 ° C에서 5% CO2 배양 기에서 세포를 품 어.
    1. EPC 미디어 48 시간 마다 변경 됩니다.
      1. 따뜻한 고 15-20 분 동안 37 ° C 물 욕조에 EPC 미디어를 준비 합니다.
      2. 우물에서 미디어를 발음 하 고 신선한 EPC 미디어를 추가 합니다.
      3. 37 ° c.에 5% CO2 배양 기에 다시 접시를 놓습니다
  5. 6 일 후 (아래와 같이) ELISA와 qRT-PCR을 통해 stromal 세포 decidualization의 정도 분석 합니다.

8. 양적 실시간 PCR (qRT-PCR)을 이용 하 여 체 외에서 Decidualization의 유효성 검사

참고: qRT-PCR Kommagani 외10에 앞에서 설명한 완료 됩니다.

  1. 상용 RNA 격리 키트에서 프로토콜을 활용 하는 HESC에서 총 RNA 격리 합니다.
    1. RNA의 양과 순도 (는260/A280) 가르시아-일 라이 어스 외15에 설명 된 대로 NanoDrop 또는 유사한 방법론을 사용 하 여 분석 합니다.
  2. 상업적으로 이용 가능한 반전 녹음 방송 키트 프로토콜을 통해 총 RNA의 1 µ g에서 cDNA를 음성 합성.
  3. 상용 qRT-PCR 키트 프로토콜에 설명 된 대로 qRT-PCR 반응을 실행 합니다.
    1. 상업적으로 사용 가능한 실시간 PCR 주인 혼합을 사용 하 여 반응을 수행 하 고 내부 시스템 컨트롤 (18s, PRL및 IGFBP1) 함께 특정 유전자 프로브.

9. ELISA를 이용 하 여 체 외에서 Decidualization의 유효성 검사

  1. 계량 상용 Prolactin ELISA 키트를 활용 하 여 조직 문화 매체에서 secreted Prolactin 수준.

10. Phalloidin 얼룩을 이용 하 여 체 외에서 Decidualization의 유효성 검사.

  1. 12 잘 플레이트의 각 음에 살 균 coverslips를 삽입 합니다.
  2. 6.1-6.5 단계를 반복 합니다.
  3. 12 잘 플레이트의 당 0.8 x 10 접시5 셀.
  4. 2 일 동안 37 ° C에서 5% CO2 배양 기에서 세포를 품 어.
  5. 미디어 발음
  6. 7.3-7.4 단계를 반복 합니다.
  7. 30 분 동안 실내 온도에 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 4 %paraformaldehyde (PFA)에서 셀을 수정.
  8. 고정 솔루션을 발음 하 고 3 시간 5 분에 대 한 PBS의 1 mL로 씻어.
  9. 침투성 증가 고정된 셀에 5 분에 대 한 PBS에 0.1% 비 이온 계면 활성 제 폴 리 에틸렌 글리콜 tert-octyl 페 닐 에테르를 추가 합니다.
  10. 5 분에 대 한 PBS의 1 mL로 3 번 세척.
  11. Phalloidin 솔루션 coverslip 당 100 µ L을 추가 하 고 90 분 동안 실 온에서 품 어.
    1. 5 µ L 당 1 단위에서 phalloidin 재고 솔루션을 사용 하 여 PBS에 1: 100 희석을 준비 합니다.
  12. 5 분에 대 한 PBS의 1 mL로 3 번 세척.
  13. 설치 매체를 포함 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)와 슬라이드를 탑재 합니다.
  14. Confocal 현미경을 이용 하 여 세포를 관찰 합니다.

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결과

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HESC 문화 decidualization

절연, 다음 인간 자궁내 막 기질 세포 80-90 %confluency 단층 형성에 교양 있었다 및 10 nM E2, MPA, 1 개의 µ M, 50 µ M 캠프와 치료에 의해 생체 외에서 decidualization에 대 한 유발 (EPC). 생체 외에서 decidualization와 관련 된 형태학 변화 그림 1A에서 구상 했다. Decidualization, 시 HESCs 둥근된 epithelioid 세포에 길쭉한, fibroblastic 세포에서 cytoskeletal 재배열을 겪는 다. 따라서, phalloidin 얼룩 HESC decidualization 중 cytoskeletal 개편을 확인 하...

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토론

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여성 생식 생리 주기는 라운드, 상피 같은 분 비 세포3,8에 ESC의 decidualization를 유도 함으로써 상승 luteal 단계 내내 황 체 호르몬 수준에 의해 특징입니다. Decidualization의 개시는 종 의존. 인간에서는, decidualization 발생 합니다 자연 호르몬 농도의 증가 따라 쥐 해야 blastocyst 존재10,11. Decidualization에서의 이러한 불일치는 인간의 세포에 세포 분화의 변환 혜택을 예로 보여주. 1 차 세포 배양을 통해 생체 외 분석 실험 호르몬4,,610통해 decidualization의 ...

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공개 사항

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이 작품은 여에서 국립 보건원 (NIH) 자금 지원/아동 건강과 인간 발달 (NICHD) 그랜트 (R00 HD080742)와 워싱턴 대학의과 대학 시작의 국립 연구소 R.K.에 자금 우리는 워싱턴 대학 불 임 클리닉 자궁내 막 생 검 견본을 제공 하기 위한 감사 하 고 싶습니다.

감사의 글

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저자는 공개 없다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Opti-MEM I (1X) Reduced Serum MediumGibco31985-070탈이중화 매체용
DMEM / F12 (1:1) (1X)Gibco11330-032
Trypan Blue Stain (0.4%)Gibco15250-061세포 계수용
PureLink RNA Mini KitInvitrogen12183018ARNA 분리/정제용
TaqMan 2X Universal PCR 마스터 믹스Applied Biosystems4304437
고용량 cDNA 역전사 키트Applied Biosystems4374967
진핵생물 18S rRNA 내인성 대조군생명 기술4319413EqPCR 내부 대조군
TaqMan 유전자 발현 분석 Prolactin 프로브 qPCR내부 대조Applied Biosystems
분석 IGFBP1 프로브응용 바이오 시스템4331182qPCR 내부 제어
Phalloidin-iFluor 488 시약 - CytoPainterAbcamab176753
인간 프로락틴 ELISA 키트InvitrogenEHIAPRL
16 % 파라 포름 알데히드Alfa Aesar30525-89-4고정
리포 펙타민 RNAiMAXInvitrogen13778150트랜스펙션 시약
ProLong Gold antifade reagent with DAPIInvitrogenP36935
0.25% 트립신-EDTA (1X)Gibco25200-056
페니실린 스트렙토마이신Gibco15140-122
숯 박탈 소 태아 혈청시그마F6765-500ML
중탄산나트륨(7.5%)Gibco25080-094
Ficoll-Paque PLUS 시약Fisher Scientific45001749
Clostridium histolyticum의 콜라겐 분해효소 시그마C0130-1G
소 췌장에서 추출한 Deoxyribonuclease I시그마DN25-100MG
Medroxyprogesterone 17-acetateSigmaM1629-1GEPC 매체
EstradiolSigmaE1024-1GEPC 미디어 용
cAMP시그마A6885-100MGEPC 미디어 용
미세 스트레이트 스티치 가위Fine Science Tools15396-00
TaqMan 유전자 발현 분석 NCOA2 프로브응용 바이오 시스템4351372
소 태아 혈청, 열 비활성화Gibco10-082-147
항생제 - 항진균성 열 과학15240062
행크' s 균형 잡힌 소금 솔루션 Corning21-021-cv
50 mL 원뿔형 폴리프로필렌 팔콘 튜브Corning352098
Dumont #5/45 집게Fine Science Tools11251-35
100 x 15 mm 유리 페트리 접시VWR75845-546
40 미크론 셀 스트레이너Midsci229481
Isotemp 215 수조Fisher ScientificFS-215
LSE 원심분리기 코닝6755
인간 NCOA2 siRNA DharmaconL-020159-00유전자 특정 qPCR 프로브
Steri-cycle i160 CO2 인큐베이터 Thermo Scientific51030301
NanoDrop 2000Thermo ScientificND-2000RNA 정량화
인산염 완충 식염수 Fisher Scientific50146771
75cm 경사형 목 세포 배양 플라스크Corning430641U
6웰 비발열성 세포 배양 플레이트Corning3506
피펫 컨트롤러 울트라코닝4099
PhotoshopAdobe19.0.1.334
25cm 경사형 목 세포 배양 플라스크Corning7200876
Triton X-100SigmaX100-1L
15 mL 원뿔형 폴리프로필렌 Falcon tubeCorning352099
10 mL 주사기BD302995
1300 시리즈 A2 생물학적 안전 후드Thermo Scientific1377
accuspin Micro17 원심분리기Fisher Scientific13100675
7500 Fast 실시간 PCR 시스템Applied Biosystems3052632
EVOS FL 면역형광 현미경Life Technologies01414-155G-291
Leica Inverted Light MicroscopeLeicaDMi1
IllrustratorAdobe22.0.1.253
Excel 스프레드시트Microsoft2016
Deckglaser 18mm 커버 안경NeuVitroGG-18
Reichert Bright-Line HemacytometerSigmaZ359629-1EA
2-메르캅토에탄올Fisher BioreagentsBP176-100RNA 용해 완충액
1.2mL 외부 나사식 폴리프로필렌 극저온 바이알Corning430658HESC 세포 동결용 
디메틸 설폭 사이드 (DMSO)SigmaD2650-100mL냉동 매체 용
군 TaqMan 유전자 발현 4331182

참고문헌

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