신선 하 게 고립 된 쥐 두뇌 Microvessels에서 막 샘플을 준비 하는 간단 하 고 재현할 수 방법

Summary

여기, 쥐 뇌 microvessels의 격리에 대 한 고 막 샘플의 준비에 대 한 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜 허용 단백질와 개별 동물에서 항복 하는 풍부한 microvessel 생산의 명확한 장점이 있습니다. 샘플은 다음 뇌 microvascular 내 피에 강력한 단백질 분석에 사용할 수 있습니다.

Abstract

혈액-뇌 장벽 (BBB)은 다양 한 병 태 생리 및 약리 자극에 응답 하는 동적 장벽 조직. 이러한 자극 으로부터 발생 하는 이러한 변경 고 수 있습니다 크게 뇌에 약물 전달 조절, 확장 하 여, 질병의 원인이 상당한 도전 중앙 신경 치료에서 (CNS). Pharmacotherapy에 영향을 주는 많은 BBB 변화를는 지역화 된 내 피 세포의 수준에서 단백질을 포함 한다. 실제로, 건강 및 질병에 BBB 생리학에 이러한 지식은이 막 단백질의 연구에 상당한 관심을 촉발 했다. 기초 과학 연구의 관점에서이 실험 동물에서 수확 하는 뇌 조직에서 microvessels의 격리에 대 한 간단 하지만 강력 하 고 재현할 수 방법에 대 한 요구를 의미 합니다. 갓 격리 된 microvessels에서 막 샘플을 준비 하기 위하여 샘플 준비 내 피 세포에 농축 되어야 하지만 다른 세포 유형 (즉, 이다, microglia, 신경, 혈관 단위의 존재 제한 필수적 이다 pericytes)입니다. 추가 혜택 개별 동물에서 실험적인 인구에서 단백질 식의 진정한 변화를 캡처하기 위해 샘플을 준비 하는 기능입니다. 이 원고에서 쥐 뇌 microvessels의 고립과 막 샘플의 준비에 대 한 활용 방법에 관한 세부 정보는 제공 됩니다. Microvessel 농축, 파생, 샘플에서 dextran 샘플 버퍼에 포함 된 4 개의 원심 분리 단계를 사용 하 여 이루어집니다. 이 프로토콜은 그들의 자신의 특정 응용 프로그램에 대 한 다른 실험실에 의해 쉽게 적응 수 있습니다. 이 프로토콜에서 생성 된 샘플 크게 생리 적, 병 태 생리, 약리 자극 응답 BBB의 이해를 원조 할 수 있는 단백질 분석 실험에서 강력한 실험 데이터를 얻을를 보였다.

Introduction

혈액-뇌 장벽 (BBB) 중앙 신경 시스템 (CNS)와 조직의 순환 간의 인터페이스에 존재 하 고 뇌 항상성 유지에 중요 한 역할. 구체적으로, 정확 하 게 제어 용 질 농도에 효율적으로 뇌 조직 CNS¹의 상당한 변화 요구를 충족 하는 데 필요한는 그 영양분을 공급 하 고 뇌 세포 외 액에는 BBB 기능. 이러한 역할 의미 microvascular 내 피 세포의 수준에 있는 BBB 잠재적으로 유해한 xenobiotics 수 없습니다 하면서 뇌 실질에 액세스 하는 일부 물질을 사용할 수 있는 개별 메커니즘을가지고 있어야 합니다. 축적. 사실, microvascular 내 피 세포 fenestrated 하지 않습니다 하 고 비 선택적인 침투성²의 부족을 보장 제한 pinocytosis 전시. 또한, microvessel 내 피 세포 꽉 접점과 외화 접합 단백질 형태로 실제 인접 한 내 피 세포 사이의 "봉인"과 뇌에 혈액을 매개로 물질의 paracellular 확산을 크게 제한 하는 표현 실질입니다. 사실, 내 인 성 및 외 인 성 물질의 선택적인 침투성의 통풍 관 및 경과 전송기³기능 식이 필요합니다. 전반적으로, 단단한 접속점, 외화 교차점, 및 전송기는 BBB의....

Protocol

아래에 설명 된 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 되었습니다와 국립 보건원 (NIH) 및 동물 연구: Vivo에서 실험 (도착) 지침을 보고. 프로토콜에 대 한 절차 흐름은 그림 1에 묘사 된다.

1입니다. 설정 절차에 대 한

1. 뇌 microvessel 버퍼 (BMB)를 준비 합니다. 54.66 g D-마 니 톨, 1.90 g EGTA, 깨끗 한 비 커에 1.46 g 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (즉, 트리 스) 자료를 재 시작 합니다. 이온된 수의 1.0 L를 추가 합니다. 자력 교 반기를 사용 하 여 BMB 버퍼의 구성 요소를 믹스. 일단 솔루션을 철저 하 게 혼합 되어, pH 7.4 1.0 M HCl을 사용 하 여를 조정 합니다.
2. 동물을 마비 전에 26 %dextran (MW 75000) 솔루션 (w/v)을 준비 합니다. 다음 단계에 설명 된 대로 dextran 솔루션을 준비 합니다.
   참고: 그것은 비판적으로 dextran 약 1.5-2 h 수성 버퍼에 분해를 걸릴 수 있기 때문에 미리이 솔루션을 준비 하는 것이 중요.
   1. 깨끗 한 비 ....

Results

쥐 뇌 microvessels의 격리 및 microvessel 막 샘플의 준비에 대 한 실험 흐름은 그림 1에 표시 됩니다. 여기에 제시 된 절차를 사용 하 여, 쥐 두뇌에서 그대로 microvessels의 성공적인 절연 설명 된다 (그림 2A). 이러한 혈관 원심 dextran와 ultracentrifugation 막 샘플 (즉, 다음 준공 단계 4.10) 준비를 개시 직전의 완료 후 얻은 했다. 이 이미지는 microvessel Oatp1a4, 두뇌 microvascular 내 피 세포^{2,11,13의 원형질 막에 잘 표현 될 표시 되었습니다 전송에 대 한 항 체를 사용 하 여 스테인드입니.......}

Discussion

이 문서에서는 갓 쥐 뇌 조직에서 분리 된 microvessels에서 막 단백질 샘플 준비의 간단 하 고 효과적인 방법을 설명 합니다. 격리 된 microvasculature에서 쥐 뇌 microvessels의 격리 및 막 준비의 세대에 대 한 몇 가지 방법은 문학^13,20,,2122 에 보고 되었습니다. ^{, 24}.이 이렇게 하나의 실험 동물에서 우수한 단백질 수확량을 가진 막 샘플의 준비를 수 있도록 최적화 되었습니다 비록 위에서 설명한 microvessel 격리 프로토콜 원칙적으로 비슷합니다. 이 사전 탈락 했다 필요 풀 microvessels을 3 개 이상 Sprague-Dawley 쥐에서 만족 스러운 단백질 농축 단백질 분석에 대 한.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
프로테아제 억제제 칵테일	시그마-알드리치	#P8340	뇌 미세혈관 완충액의 구성
D-만니톨	시그마-알드리치	#M4125	뇌 미세혈관 완충액의 구성 요소
EGTA	시그마-알드리치	#E3889	뇌 미세혈관 완충액의 구성 요소
트리즈마 염기	시그마-알드리치	#T1503	뇌 미세혈관 완충액의 구성 요소
덱스트란 (MW 75,000)	Spectrum Chemical Mftg Corp	#DE125	뇌 실질에서 미세혈관을 분리하기 위한 원심분리 단계에 사용되는 덱
스트란 Zetamine	MWI Animal Health	#501072	전신 마취제
Xylazine	Western Medical Supply	#5530	전신 마취제
0.9% 식염수 Western	Medical Supply	N/A	전신 마취제 희석제
여과지 (직경 12.5cm)	VWR	#28320-100	뇌 조직에서 수막을 제거하는 데 사용됩니다
원심분리기 튜브	Sarstedt	#60.540.386	덱스트란 원심분리 단계
피어싱&트레이드에 사용되는 일회용 튜브; Coomassie Plus(Bradford) 분석	ThermoFisher Scientific	#23236	멤브레인 제제의 단백질 농도 측정
Wheaton Overhead Power Homogenizer	DWK Life Sciences	#903475	시료 균질화에 필요
10.0ml 유리 모르타르 및 유봉 조직 분쇄기	DWK Life	Sciences#358039	시료 균질화에 필요
염산	Sigma-Aldrich	#H1758	완충액의 pH 조정에 필요
소 혈청 알부민	ThermoFisher Scientific	#23210	Bradford 분석을 위한 단백질 표준
표준 펜치	Fine Science Tools	#91100-12	뇌 조직 해부에 사용
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science Tools	#16020-14	뇌를 분리하기 위해 두개골을 여는 데 사용
50 ml 원뿔형 원심분리기 튜브	ThermoFisher Scientific	#352070	분리 후 뇌 조직을 수집하는 데 사용됩니다
유리 파스퇴르 피펫	ThermoFisher Scientific	#13-678-20C	덱스트란 스핀 후 세포 파편의 흡인에 사용됩니다.
에탄올, 무수	Sigma-Aldrich	#459836	조직 분쇄기를 청소하는 데 사용됩니다. 증류수로
70%로 희석합니다.초원심분리기 튜브	Beckman-Coulter	#41121703	시료의 초원심분리에 사용됩니다